1

BAB I

PENDAHULUAN

Perbedaan antara konsentrasi glukosa pre- dan post-prandial pada wanita

diabetes dengan kontrol baik 10 kali lebih baik dibandingkan dengan wanita non-

diabetes. Konsentrasi glukosa dalam cairan tuba dan uterus secara langsung

berhubungan dengan kadar glukosa dalam plasma,1 maka dari itu dapat

dihipotesis bahwa pada wanita diabetes dengan kontrol yang baik embrio

mungkin masih terpapar kadar glukosa yang tinggi secara intermiten selama

perkembangan dalam saluran reproduksi. Selain itu, paparan kadar glukosa yang

tinggi, secara mutlak hiperglikemia, mungkin mencetuskan tekanan pada

preimplantasi embrio, membahayakan perkembangannya dan berkontribusi

terhadap peningkatan insiden malformasi fetal pada wanita diabetes dengan

kontrol yang baik.2

Mekanisme dari ‘diabetes pencetus embriopati’ sudah menjadi subjek

pada banyak penelitian diabetes yang biasanya pada model rodent. Penelitian

tersebut menunjukan bahwa pada ibu diabetes dengan kelainan metabolisme dan

hiperglikemia akan menganggu embriogenesis pada masa awal tahap

perkembangan preimplantasi. Pada Blastokista (hari ke 4 kehamilan) hewan

diabetes, peningkatan fragmentasi inti sel, pengurangan jumlah inner cell mass

(ICM) dan peningkatkan insidensi apoptosis ICM lebih tinggi dibandingkan

dengan hewan non diabetes.3-8

Selain itu, pada hewan diabetes perkembangan trofoblas juga

terhambat.9,10 De Hertough et al (1991) juga menambahkan bahwa pada tikus

diabetes terjadi pengurangan jumlah total embrio.5 Walaupun pada tikus diabetes

yang diberi insulin memiliki jumlah total embrio yang signifikan lebih rendah

dibandingkan dengan tikus non diabetes, namun insulin tetap diberikan untuk

mencegah diabetes embriopati.6

Percobaan in vitro yang menggunakan model rodent juga sudah dilakukan

untuk mengidentifikasi agen teratogenik dan hubungan yang mendasari

2

mekanisme embriopati diabetes selama peroide preimplantasi. Faktor penting

diantaranya termasuk hiperglikemia, tetapi juga tingginya kadar keton, reactive

oxygen species (ROS) dan tumor necrosis factor alpha ikut berperan.11-15

Percobaan pada kultur embrio dengan konsentrasi glukosa yang tinggi

(20-52mM) menunjukan inhibisi perkembangan blastokista, proliferasi sel dan

diferensiasi sel, serta meningkatkan apoptosis sel dan berpengaruh pada kadar

metabolit intraembrionik.3,5,11,16,17

Hiperglikemia dihubungkan bertentangan dengan regulasi Glucose

Transporter 1 (GLUT 1), GLUT 2 dan GLUT 3 dalam blastokista, pengurangan

aktivitas glikolitik dan menurunkan kadar glukosa bebas intraembrionik.10,16,17

Peningkatan kadar ROS dan stimulasi ekpresi dari gen pro-apoptotic (p53

dan Bax)12,21 dan efektor apoptotic intraselular (caspase-3 dan caspase-activated

deoxyribonuclease) menyebabkan pengurangan jumlah ICM.18

3

BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Determinasi Konsentrasi Glukosa yang Menyebabkan Embriopati

2.1.1. Efek pada Perkembangan Preimplantasi

Penilaian tahap preimplantasi pada peneiltian ini meliputi

perkembangan morfologi sel blastokista, diferensiasi balstosis dan

penilaian tingkat apoptosis sel. (Gambar 1).

Gambar 1. Assessment of embryo development

(A) Blastocyst stained using 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (scale bar 50 µm) for assessment of cell proliferation. (B) Blastocyst stained using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (scale bar 50 µm) for assessment of cell death (apoptosis). (C) Dual stained blastocyst (scale bar 20 µm) for assessment of cell differentiation

Penilaian pada tahap peri-implantasi, yaitu dengan

mengamati penempelan blastokista, perkembangan morfolosi sel

blastokista, tingkat proliferasi sel, diferensiasi sel, apoptosis sel dan

tingkat pertumbuhan trofoblas. (Gambar 2).

4

Gambar 2 : Trophoblast outgrowth (scale bar 50 µm)

(A) No trophoblast outgrowth, the embryo is highly compacted and raised. (B) Slight trophoblast outgrowth, the embryo is highly compacted and raised with a small area of flat growth. (C) Moderate trophoblast outgrowth, the embryo is less compacted and is not as raised with an extended area of flat growth. (D) Significant trophoblast outgrowth, the embryo is predominately flat.

Blastokista hasil pembilasan saluran telur tikus percobaan

ditempatkan pada 2 media buatan, yaitu KSOM (saluran telur buatan

yang diperkaya oleh potasium dengan penurunan 50% asam amino)

dan mKSOM (saluran telur buatan yang diperkaya oleh potasium).

Pada hari ke 5 post fertilisasi tingkat perkembangan blastokista

secara signifikan lebih besar pada KSOM (61,2%) dibandingkan

pada mKSOM (45.6%). Untuk selanjutnya media KSOM dipilih

untuk percobaan ini.

Dalam percobaan ini, pada tahap blastokista tidak ditemukan

adanya efek peningkatan konsentrasi glukosa pada perkembangan

5

morfologi sel embrio. Hal ini menjelaskan terjadi penurunan tingkat

perkembangan blastokista. Peningkatan konsentrasi glukosa (0.2-25

mM) menghasilkan perbedaan signifikan pada perkembangan

blastokista ketika embrio dikultur dari tahap 2 sel. (Tabel 1)

Tabel 1. The effect of increasing the concentration of glucose in embryo culture medium on the percentage of expanded blastocysts, the percentage of hatching blastocysts and blastocyst cell number on Day 5 pf.

aTotal cell number significantly different to 0.2 mM glucose culture.

b% Expanded blastocysts significantly different to 0.2 and 5.56 mM cultures . (χ2, P <0.005).

c% Hatching significantly different to 0.2 and 5.56 mM cultures(χ2, P < 0.001).

Pada preimplantasi embrio hari ke 5 post fertilisasi dengan

pajanan glukosa yang tinggi menghasilkan blastokista yang lebih

sedikit dibandingkan dengan embrio kontrol (kultur dalam glukosa

5.56 mM). Selain itu, peningkatan konsentrasi glukosa

menyebabkan gangguan pada alokasi sel, pengurangan jumlah sel

Inner cell mass (ICM) dan trophectoderm (TE) pada hari ke 5 post

fertilisasi. Rasio sel ICM : TE berbeda secara signifikan pada

kontrol kultur 5.56 mM. (Tabel 2)

Tabel 2. The Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo Culture Medium on Cell Allocation and Ratio on Day 5 pf.

Glucose concentration (mM)

Expanded blastocysts (%) Hatching (%)

Total cell number

n Mean ± SEM

0.2 64.8 39.7 36 71.1 ± 4.4

5.56 64.4 38.7 36 54.6 ± 3.5a

15.56 56.8b 23.4c 30 57.4 ± 3.5a

25.56 46.1b 17.2c 24 51.3 ± 3.3a

P < 0.002

6

Day 5

Total ICM TE Ratio (ICM:TE)

Glucose

concentration

(mM) n

0.2 46 69.16 ± 3.526 12.63 ± 0.921 56.09 ± 3.381 0.2756 ± 0.033

5.56 46 55.51 ± 2.803a 15.02 ± 1.106 40.48 ± 2.607b 0.4335 ± 0.042c

15.56 42 54.51 ± 2.707a 11.57 ± 0.920 42.94 ± 2.376b 0.2880 ± 0.027d

25.56 35 49.94 ± 2.492a 9.943 ± 0.895e 40.00 ± 2.319b 0.2706 ± 0.026d

P < 0.01 P < 0.01 P < 0.01 P < 0.05

Values are expressed as Mean ± SEM. ICM, inner cell mass; TE, trophectoderm.

aSignificantly different to 0.2 mM glucose cultures (P < 0.01).

bSignificantly different to 5.56 mM glucose cultures (P < 0.01).

cSignificantly different to 0.2 mM glucose culture (P < 0.01).

dSignificantly different to 0.2 mM glucose culture (P < 0.01).

eSignificantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.05).

Apoptosis sel tidak begitu dipengaruhi oleh peningkatan

konsentrasi glukosa. Pada embrio kontrol positif secara konsisten

menjadi mayoritas (>90%) terjadinya apoptosis sel. (Tabel 3)

Tabel 3.The Effect of Increasing the Concentration of Glucose in Embryo Culture Medium on Cell Apoptosis on Day 5 pf.

7

Day 5

Total cell number

No of apoptotic

cells % Apoptotic cells

Glucose

concentration (mM) n

0.2 43 66.9 ± 4.0 5.4 ± 0.7 7.7 ± 1.0

5.56 43 59.5 ± 3.0 4.6 ± 0.7 7.5 ± 1.1

15.56 35 49.8 ± 3.5a 3.7 ± 0.7 7.0 ± 1.0

25.56 36 42.6 ± 3.2a,b 3.4 ± 0.6 7.3 ± 1.2

P < 0.001 NS NS

Values are expressed as Mean ± SEM.

aSignificantly different to 5.56 mM glucose cultures.

bSignificantly different to 0.2 mM glucose cultures.

Hasil percobaan pada jurnal ini menunjukkan bahwa pada

tahap preimplantasi dengan kadar glukosa yang tinggi menyebabkan

pengurangan jumlah sel ICM dan sel TE yang selanjutnya

menghambat terbentuknya embrio.

2.1.2. Efek pada Perkembangan Peri-Implantasi

Pada hari 8 post fertilisasi, peningkatan konsentrasi glukosa

akan menurunkan jumlah sel di dalam blastokista tetapi tidak

mengurangi jumlah sel dipermukaan blastokista. Selain itu,

peningkatan konsentrasi glukosa menyebabkan penurunan densitas

sel dalam blastokista dan berefek secara signifikan meningkatkan

pertumbuhan trofoblas. (Tabel 4)

Tabel 4. The Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo Culture Medium on Median Cell Number (MCN), Surface Area (SA) and Cell Density on Day 8 pf.

Glucose concentration (mM) n MCN SA (×104 µm)

Cell density (MCN/SA)

0.2 30 103.8 ± 12.10 7.047 ± 0.4967 19.75 ± 0.4012

5.56 75 116.9 ± 8.464 7.177 ± 0.4079 21.33 ± 2.618

15.56 39 105.9 ± 8.490 7.128 ± 0.5222 18.52 ± 2.201

25.56 31 73.00 ± 7.731a 6.455 ± 0.5244 11.49 ± 0.9133b

8

P < 0.01 NS P < 0.05

Values are expressed as mean ± SEM.aSignificantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.01).bSignificantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.05).

Peningkatan konsentrasi glukosa secara signifikan

menyebabkan penurunan jumlah embrio yang mengandung ICM

(P<0.01). Pada kultur dengan konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56 mM,

didapatkan 80% embrio mengandung ICM. Sedangkan pada kultur

dengan konsentrasi glukosa 15.56 dan 25.56 mM hanya 60.5% dan

31.3% mengandung ICM.

2.2. Determinasi Periode Rentan Teratogenik Selama Perkembangan

Preimplantasi

Percobaan yang diuraikan diatas menunjukan bahwa efek embriopati

maksimal pada konsentrasi glukosa 25.56 mM. Oleh karena itu, embrio tikus

yang terpapar konsentrasi glukosa 25.56 mM selama 24 jam dan 48 jam

antara hari ke 2 dan 5 post fertilisasi digunakan untuk memeriksa pajanan

glukosa relatif yang dapat menyebabkan embriopati. (Gambar 3)

9

10

Gambar 3. Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo Culture Media on Percentage of 2-Cell Embryos Forming Blastocysts by Day 5 pf.

*Significantly different to control culture (χ2, P < 0.001) Control embryos were cultured in 5.56 mM glucose for the duration of the experiment.

Proliferasi sel secara signifikan terhambat pada embrio yang terpajan

oleh glukosa 25.56 mM selama 48 jam pada akhir percobaan tetapi tidak

terjadi pada awal percobaan. Selain itu, tidak ada efek signifikan pada

apoptosis sel ketika embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa yang tinggi

selama 48 jam antara hari ke 2 dan ke 4. Selain itu, pada awal pajanan

percobaan tersebut tidak ditemukan adanya alokasi sel yang diamati ketika

embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa 25.56 mM selama 48 jam. (Tabel 5)

Tabel 5. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for Either a 24 h or a 48 h Period on The Total Cell Number, Cell Allocation and Cell Ratio on Day 5 pf.

Glucose concentration of medium H = 25.56 mM, L = 5.56 mM

Total cell number ICM TE Ratio (ICM:TE)

Day 1

Day 2

Day 3 n

Expt 1 Control L L L 41 69.1 ± 2.9 16.6 ± 1.1 52.6 ± 2.3 0.32 ± 0.02

Early 24 h H L L 35 62.7 ± 3.2 16.5 ± 1.3 38.4 ± 2.8 0.36 ± 0.02

Late 24 h L L H 36 60.0 ± 3.6 13.7 ± 1.0 38.9 ± 3.2 0.31 ± 0.03

Expt 2 Control L L L 42 62.3 ± 5.3 15.5 ± 1.6 46.8 ± 4.3 0.38 ± 0.04

Early 48 h H H L 35 54.6 ± 4.6 12.6 ± 1.5 42.1 ± 3.5 0.30 ± 0.03

Late 48 h L H H 25 35.8 ± 4.6a 7.9 ± 1.4b 27.9 ± 3.0c 0.30 ± 0.05

Expt 3 Control L L L 84 53.7 ± 2.2 11.7 ± 0.9 41.3 ± 1.7 0.29 ± 0.02

11

Mid 24 h L H L 41 47.2 ± 2.7 9.0 ± 1.0 39.2 ± 2.7 0.26 ± 0.03

Split 48 h H L H 42 40.6 ± 1.6d 7.3 ± 0.6e 31.8 ± 1.7f 0.25 ± 0.02g

Values are expressed as mean ± SEM.

aSignificantly different to Expt 2 control and early 48 h (P < 0.005).

bSignificantly different to Expt 2 control (P < 0.01).

cSignificantly different to Expt 2 control and early 48 h (P < 0.01).

dSignificantly different to Expt 3 control (P < 0.001).

eSignificantly different to Expt 3 control and mid 24 h (P < 0.01).

fSignificantly different to Expt 3 control (P<0.01).

gSignificantly different to mid 24 h (P < 0.01).

Pada sistem kultur konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56 mM

meningkatkan pertumbuhan blastokista pada hari ke 5 post fertilisasi. Kadar

glukosa darah yang lebih tinggi dari itu dihubungkan dengan kegagalan dari

proses tersebut. Pada kultur hiperglikemia jumlah total sel dan alokasi sel

terhambat.

Percobaan sebelumnya juga melaporkan bahwa pada blastokista

tikus diabetes terjadi peningkatan apoptosis terutama pada ICM yang

selanjutnya meningkatkan insiden terjadinya malformasi.6

Di sisi lain, telah disampaikan bahwa induksi faktor anti apoptotik

Bcl-2 dalam menanggapi hiperglikemia dan mekanisme yang mirip dengan

hal ini dapat menjelaskan kenapa tidak adanya penambahan apoptosis

tertentu yang terlihat dalam percobaan kami.19

Hasil pengamatan kita menunjukan bahwa peningkatan konsentrasi

glukosa tidak memiliki efek signifikan pada jumlah sel apoptotik atau

proporsi dari sel apoptotik. (Tabel 6). Hal ini tentu sangat berbeda tajam

dengan penelitian yeng telah diterbitkan sebelumnya.20-22

Tabel 6. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for Either a 24h or a 48 h Period on The Total Cell Number and Cell Apoptosis on Day 5 pf.

Glucose concentration of medium H = 25.5 Total cell No of % Apoptotic cells

12

6mM, L = 5.56 mM

number apoptotic cells

Day

1

Day

2

Day

3 n

Expt 1 Control L L L 36 52.1 ± 3.7 3.8 ± 0.6 7.1 ± 1.2

Early 24 h H L L 33 58.6 ± 3.6 3.9 ± 0.6 7.1 ± 1.2

Late 24 h L L H 32 48.3 ± 3.3 3.8 ± 0.8 7.5 ± 1.5

Expt 2 Control L L L 34 50.0 ± 3.0 2.5 ± 0.4 5.3 ± 1.0

Early 48 h H H L 29 52.0 ± 3.6 2.9 ± 0.9 5.1 ± 1.4

Late 48 h L H H 37 41.5 ± 2.9a 2.4 ± 0.4 6.3 ± 1.1

Expt 3 Control L L L 56 57.5 ± 3.3 4.3 ± 0.9 8.1 ± 1.0

Mid 24 h L H L 52 49.3 ± 3.5 3.3 ± 0.5 7.3 ± 0.9

Split 48 h H L H 32 52.8 ± 3.3 3.5 ± 0.5 7.2 ± 1.1

P < 0.05 NS NS

Values are expressed as mean ± SEM.

aSignificantly different to Experiment 2 Control.

Hal ini mungkin terjadi akibat perbedaan desain percobaan, seperti

pada Jiemenez et al. (2003), sebelum menilai tingkat kematian sel, awalnya

embrio dikultur pada konsentrasi glukosa yang normal lalu konsentrasi

glukosa ditingkatkan.20 Sedangkan pada percobaan dalam jurnal ini, sebelum

menilai tingkat kematian sel, sel embrio terpajan konsentrasi glukosa yang

bervariasi secara terus menerus.

BAB III

KESIMPULAN

Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia selama > 24 jam

bersifat toksis. Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa terdapat peluang lebih

rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat peluang lebih tinggi terjadinya

kelainan kongenital dan keguguran yang tampak pada pasien diabetes, terutama

dengan kontrol diabetes yang buruk.

Proses yang mendasari gangguan pada awal perkembangan embrio

dengan pajanan hiperglikemia tersebut adalah pengurangan jumlah sel blastokista

terutama inner cell mass dengan cara menghambat proliferasi sel dan diferensiasi

sel tanpa peningkatan apoptosis dalam blastokista Namun, tidak terjadi gangguan

13

pertumbuhan trofoblas.

DAFTAR PUSTAKA

1. Leese H. The Formation and Function of Oviduct Fluid. J Reprod Fert

1981;82:843-856.

2. DAFNE Study Group. Training in Flexible, Intensive Insulin Management to

Enable Dietary Freedom in People With Type 1 Diabetes: Dose Adjustment

for Normal Eating (DAFNE) Randomised Controlled Trial. BMJ

2002;325:746-751.

3. Pampfer S, de Hertogh R, Vanderheyden I, Michiels B, Vercheval M.

Decreased Inner Cell Mass Proportion in Blastocysts from Diabetic Rats.

Diabetes 1990;39:471-476.

4. Vercheval M, De Hertogh R, Pampfer S, Vanderheyden I, Michiels B, De

14

Bernardi P, De Meyer R. Experimental Diabetes Impairs Rat Embryo

Development During The Preimplantation Period. Diabetologia

1990;33:187-191.

5. De Hertogh R, Vanderheyden I, Pampfer S, Robin D, Dufrasne E, Delcourt J.

Stimulatory and Inhibitory Effects of Glucose and Insulin on Rat Blastocyst

Development In Vitro. Diabetes 1991;a40:641-647.

6. Moley KH, Vaughn WK, DeCherney AH, Diamond MP. Effect of Diabetes

Mellitus on Mouse Preimplantation Embryo Development. J Reprod Fertil

1991;93:325-332.

7. Moley KH, Chi MM, Mueckler MM. Maternal Hyperglycemia Alters

Glucose Transport and Utilization In Mouse Preimplantation Embryos. Am J

Physiol1998;a275:E38-E47.

8. Lea RG, McCraken JE, McIntyre SS, Smith W, Baird JD. Disturbed

Development of The Preimplantation Embryo in The Insulin-Dependent

Diabetic BB/E Rat. Diabetes1996;45:1463-1470.

9. Pampfer S, Wuu YD, Vanderheyden I, De Hertogh R. In Vitro Study of The

Carry-Over Effect Associated With Early Diabetic Embryopathy in The Rat.

Diabetologia1994;a37:855-862.

10. Leunda-Casi A, De Hertogh R, Pampfer S. Decreased Expression of

Fibroblast Growth Factor-4 and Associated Dysregulation of Trophoblast

Differentiation in Mouse Blastocysts Exposed to High D-Glucose in Vitro.

Diabetologia 2001;44:1318-1325.

11. Zusman I, Yaffe P, Ornoy A. Effects of Metabolic Factors in The Diabetic

State of The In Vitro Development of Preimplantation Mouse Embryos.

Teratology1987;35:77-85.

12. Pampfer S, Moulaert B, Vanderheyden I, Wuu YD, De Hertogh R. Effect of

Tumor Necrosis Factor Alpha on Rat Blastocyst Growth and Glucose

Metabolism. J. Reprod Fert 1994;c101:199-206.

13. Pampfer S, Vanderheyden I, Wuu YD, Baufays L, Maillet O, DeHertogh R.

Possible Role for TNF-Alpha in Early Embryopathy Associated with

Maternal Diabetes in The Rat.Diabetes 1995;44:531-536.

15

14. Moley KH, Vaughn WK, Diamond MP. Manifestations of Diabetes Mellitus

on Mouse Preimplantation Development: Effect of Elevated Concentration of

Metabolic Intermediates. Hum Reprod 1994;9:113-121.

15. Wuu YD, Pampfer S, Vanderheyden I, Lee KH, De Hertogh R. Impact of

Tumor Necrosis Factor Alpha on Mouse Embryonic Stem Cells. Biol Reprod

1998;58:1416-1424.

16. Moley KH, Chi MM-Y, Kuudson CM, Karsmeyer SJ, Muekler MM.

Hyperglycemia Induces Apoptosis in Pre-implantation Embryos Through

Cell Death Affected Pathways. Nat Med 1998;b4:1421-1424.

17. Moley KH. Hyperglycemia and Apoptosis: Mechanisms for Congenital

Malformations and Pregnancy Loss in Diabetic Women. Trends Endocrinol

Metab2001;l2:78-82.

18. Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De Hertogh R,

Pampfer S. Identification of Caspase-3 and Caspase-Activated

Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their Implication in The

Induction of Chromatin Degradation (But Not Nuclear Fragmentation) by

High Glucose. Biol Reprod 2001;64:555-562.

19. Pampfer S, Cordi S, Vanderheyden I, Van Der Smissen P, Courtoy PJ, Van

Caurenberge A, Alexandre H, Donnay J, De Hertogh R. Expression and Role

of Bc1-2 in Rat Blastocysts Exposed to High D-Glucose. Diabetes

2001;50:143-149.

20. Jimenez A, Madrid-Bury N, Fernandez R, Perez-Garnelo S, Moreira P,

Pintado B, De La Fuente J, Gutierrez-Adan A. Hyperglycaemia-Induced

Apoptosis Affects Sex Ratio of Bovine and Murine Preimplantation

Embryos. Mol Rep Dev 2003;65:180-187.

21. Keim AL, Chi MM, Moley KH. Hyperglycemia-Induced Apoptotic Cell

Death in The Mouse Blastocyst Is Dependent on Expression of p53. Mol

Reprod Dev 2001;60:214-224.

22. Chi MMY, Hoehn A, Moley KH. Metabolic Changes in The Glucose Induced

Apoptotic Blastocyst Suggest Alterations in Mitochondrial Physiology. Am J

Physiol Endocinrol Metab 2002;283:E226-E232.

16