26

IV. METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitan ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan,

Laboratorium Keteknikan Pengolahan Pangan, Laboratorium Kimia Pangan dan

Laboratorium Teknologi Pengolahan Pangan Jurusan Teknologi Industri Pangan,

Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran. Waktu penelitian

dilaksanakan pada bulan Januari - Mei 2019.

4.2 Bahan dan Alat Percobaan

4.2.1 Bahan

Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah daun kemangi (O.

sanctum L.) yang diperoleh dari Kampung Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan

Parongpong, Kabupaten Bandung Barat dan bahan pembuatan mi basah yakni

terigu, garam, minyak, dan air. Media pertumbuhan mikroba menggunakan NA

(Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PCA ( Plate Count Agar), LBSS

(Lactose Broth Single Strenght), LBDS (Lactose Broth Double Strenght), EMB

(Eosin Methylene Blue), dan NaCl fis 0,85%. Bahan-bahan kimia yang digunakan

adalah formalin 0,05%, etanol 70%, alkohol 95%, metylene blue, lugol, netral red,

dan safranin. Kultur mikroba uji, yaitu E. coli dan A. niger. Bahan-bahan lain yang

digunakan yaitu akuades, alumunium foil, clingwrap, kertas saring, kertas cakram,

object glass, cover glass, kapas, kasa, dan spirtus.

27

4.2.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain beaker glass, gelas

ukur, pipet ukur, bulb, labu erlenmeyer, cawan petri, spatula, panci, saringan, pasta

maker, tabung durham, tabung reaksi, inkubator, pisau, vacuum filter, serangkaian

alat rotary evaporator, spektrofotometer, autoklaf, neraca analitik, jarum ose,

cawan alumunium, oven, mikropipet, desikator, mikroskop, bunsen, fin tip, botol

semprot, refrigerator, Laminar Air Flow, kuvet, dan botol kaca gelap.

4.3 Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

eksperimental yang dianalisis secara deskriptif dengan ulangan sebanyak 2 kali.

Tahap pertama adalah melakukan determinasi bahan uji yaitu daun kemangi,

pembuatan ekstrak daun kemangi dengan metode maserasi menggunakan pelarut

etanol 70%, serta pemeriksaan parameter non spesifik dan spesifik ekstrak uji.

Kemudian dilakukan pengujian aktivitas antimikroba terhadap E. coli dan A. niger

menggunakan metode difusi agar dengan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan

100%. Konsentrasi terbaik kemudian diaplikasikan pada mi basah dengan

pembanding formalin 0,05% sebagai kontrol positif.

4.4 Pelaksanaan Penelitian

Pelaksanaan percobaan terdiri dari dua tahap yakni uji aktivitas antimikroba

dengan pembuatan ekstrak daun kemangi, pemeriksaan parameter ekstrak uji, serta

pengujian aktivitas antimikroba pada bakteri E. coli dan jamur A. niger. Tahap

28

kedua adalah uji aplikasi pada mi basah menggunakan konsentrasi terbaik ekstrak

etanol daun kemangi hasil uji aktivitas antimikroba.

4.4.1 Pembuatan Simplisia Daun Kemangi

Daun kemangi (O. sanctum L) yang digunakan pada penelitian ini diperoleh

dari Kp. Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan Parongpong Kabupaten Bandung

Barat. Bahan uji daun kemangi dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium

Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. Hasil determinasi dapat dilihat di

Lampiran 2.

Daun kemangi segar disortasi dan dicuci dengan air mengalir yang

bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang mungkin menempel pada daun

kemangi. Pengeringan daun kemangi dilakukan dengan cara di angin-anginkan dan

terlindung dari matahari langsung untuk mempertahankan kandungan volatil dalam

daun kemangi (Soemari, 2017). Selanjutnya dilakukan sortasi kering yang

bertujuan untuk memisahkan benda asing seperti benang, rambut, dan pengotor lain

yang mungkin menempel selama proses pengeringan.

Daun kemangi yang telah kering kemudian dilakukan pengecilan ukuran

untuk memperbesar luas permukaan sehingga kontak dengan pelarut menjadi lebih

optimal. Pengecilan ukuran dilakukan menggunakan grinder atau blender dengan

waktu yang sangat singkat agar simplisia daun kemangi tidak sampai halus,

sehingga saat dilakukan proses penyaringan bubuk daun kemangi dapat tersaring

secara optimum dan meminimalisir kemungkinan adanya bubuk daun kemangi

yang terbawa saat evaporasi (Depkes RI, 2000). Selanjutnya penyimpanan

29

simplisia daun kemangi dalam wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari

matahari langsung pada suhu kamar (Soemari, 2017). Diagram proses pembuatan

simplisia daun kemangi dapat dilihat pada Gambar 6.

(Modifikasi Soemari, 2017)

4.4.2 Pembuatan Ekstrak Daun Kemangi

Simplisia kering daun kemangi yang telah jadi kemudian dimaserasi

menggunakan etanol 70% sampai semua serbuk kemangi terendam dengan

perbandingan berat sampel dan etanol 70% adalah 1:5 (b/v). Perendaman dilakukan

selama 2-3 hari dengan pengadukan setiap hari atau sesering mungkin. Setelah

dimaserasi, disaring menggunakan vacuum filter, sehingga diperoleh filtrat dan

ampas.. Filtrat kemudian dikentalkan menggunakan rotary evaporator dengan

Gambar 6. Diagram Proses Pembuatan Simplisia Daun Kemangi

Daun

Kemangi Determinasi Tanaman

Sortasi dan Pencucian

Pengeringan

T : 6-7 hari

l

Sortasi Kering

Pengecilan Ukuran

Simplisia Daun

Kemangi

30

suhu heating bath sebesar 400C dan suhu chiller + 30C, selama + 1,5 jam atau

tergantung banyaknya larutan sehingga diperoleh ekstrak kental (Yulianingtyas dan

Bambang, 2016). Diagram proses pembuatan ekstrak daun kemangi dapat dilihat

pada Gambar 7.

(Modifikasi Atikah, 2013)

4.4.3 Parameter Ekstrak Uji

Ekstrak daun kemangi kemudian diuji berdasarkan parameter spesifik

berupa uji kadar air dan parameter non spesifik berupa uji organoleptik sebagai

berikut:

1) Uji Kadar Air (AOAC, 2006)

Gambar 7. Diagram Proses Ekstrak Daun Kemangi

Maserasi dengan

etanol 70%

T : 2-3 hari

Simplisia

daun kemangi

Penyaringan filtrat

Evaporasi

T : 400C ; t : + 1,5 jam

Ekstrak kental

daun kemangi

Ampas

31

a. Disiapkan cawan kosong dan dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada

suhu 105oC.

b. Cawan didinginkan dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang hingga

berat yang dihasilkan konstan.

c. Sampel ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam cawan.

d. Cawan berisi sampel dimasukkan ke dalam oven selama + 3 jam pada suhu

105oC + 2oC.

e. Cawan yang berisi sampel dikeluarkan dari oven lalu dimasukkan ke dalam

desikator selama + 15 menit dan ditimbang.

f. Pengeringan dilakukan sampai didapatkan berat yang konstan dengan

selisih 0,2% dari berat sampel kering sebelumnya.

g. Perhitungan kadar air dilakukan menggunakan rumus berikut:

Kadar air (%bb) = 𝑎−𝑏

𝑎 x 100%

Keterangan:

- a = berat awal sampel (g)

- b = berat sampel setelah dikeringkan (g)

2) Uji organoleptik yang dilakukan menggunakan panca indera meliputi bentuk,

warna, dan bau (Depkes RI, 2000).

4.4.4 Pengujian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Kemangi

4.4.4.1 Persiapan Kultur Mikroba Uji

Persiapan kultur mikroba uji dilakukan untuk menumbuhkan bakteri

maupun jamur uji agar dapat berkembang saat dicampurkan dengan media padat

dalam uji aktivitas antimikroba.

32

1) Pembuatan Suspensi E.coli

Bakteri disuspensikan dalam 9 mL larutan NaCl fis 0,85% lalu dibandingkan

dengan McFarland 0,5. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi suspensi

menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm sampai

diperoleh absorbansi 0,08 - 0,13 (setara dengan 1,5x108 CFU/mL). Diagram proses

pembuatan suspensi E. coli dapat dilihat pada Gambar 8.

(Biologicals, 2014)

2) Pembuatan Suspensi A. niger

Jamur yang telah diinkubasi selama 3-5 hari kemudian diluruhkan

menggunakan NaCl fis 0,85% lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril untuk

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 530 nm dan distandarisasi

9 mL NaCl fis

0,85%

Pencampuran sampai kekeruhan

menyerupai McFarland 0,5

Sterilisasi dalam autoklaf

T = 1210C, t = 15 menit

Uji absorbansi menggunakan

spektrofotometer pada panjang

gelombang 600 nm

Suspensi E. coli

Kultur murni E.

coli

Gambar 8. Diagram Proses Pembuatan Suspensi E. coli

33

menggunakan larutan McFarland untuk memperoleh inokulum sebanyak 1 x 108

CFU/mL menggunakan spektrofotometer dengan larutan NaCl fis 0,85% sebagai

blanko. Diagram proses pembuatan suspensi A. niger dapat dilihat pada Gambar 9.

(Modifikasi Cappuccino dan Sherman, 2001)

4.4.4.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba

Aktivitas antibakteri dan antijamur dapat ditentukan dengan metode difusi

agar. Sebanyak 0,1 mL suspensi bakteri dan jamur uji dimasukkan ke dalam cawan

petri yang telah berisi medium NA steril untuk bakteri dan PDA untuk jamur.

Kemudian letakkan cakram kertas dan tetesi larutan uji konsentrasi 0%, 25%, 50%,

75% dan 100% sebanyak 40 µL pada permukaan agar. Pengenceran dilakukan

menggunakan aquades karena konsentrasi terbaik akan diaplikasikan pada mi

basah, sehingga larutan pengencer harus aman untuk dikonsumsi. Diinkubasi

selama 1 – 2 hari pada suhu 37oC untuk bakteri dan 3 – 5 hari pada suhu 25oC –

Kultur murni A.

niger

Peluruhan

Uji absorbansi menggunakan

spektrofotometer pada panjang

gelombang 530 nm

Suspensi A. niger

NaCl fis

0,85%

Standarisasi

McFarland 0,5

Gambar 9. Diagram Proses Pembuatan Suspensi A. niger

34

28oC untuk jamur. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan zona bening yang

terbentuk disekeliling kertas cakram. Diagram proses dapat dilihat pada Gambar

10.

(Modifikasi Atikah, 2013)

Penuangan ke cawan

petri dan dibiarkan

membeku

0.1 mL suspensi bakteri yang

telah diukur absorbansinya,

diinokulasi pada medium NA

Peletakkan dan penetesan cakram

kertas dengan konsentrasi 0%,

25%, 50%, 75%, dan 100% pada

permukaan medium NA

Inkubasi selama 3-5 hari, suhu

25-280C (jamur) Inkubasi selama 1-2 hari,

suhu 370C (bakteri)

0.1 mL suspensi jamur yang

telah diukur absorbansinya,

diinokulasi pada media PDA

Peletakkan dan penetesan cakram

kertas dengan konsentrasi 0%,

25%, 50%, 75%, dan 100% pada

permukaan medium PDA

Pengukuran diameter zona

hambat yang terbentuk

Medium Nutrient Agar (NA)

dan Potato Dextrose Agar

(PDA)

Data diameter

zona hambat / mm

Gambar 10. Diagram Proses Uji Aktivitas Antimikroba

35

4.4.4.3 Penentuan Aktivitas Antimikroba pada Mi Basah

Pembuatan mi basah matang dilakukan berdasarkan Pahrudin (2006),

dengan melakukan penimbangan tepung terigu (100%), garam (1%), Na2CO3

(0,6%), dan air (34%) untuk 1 adonan. Kemudian dilakukan pengadukan bahan-

bahan kering selama + 1 menit lalu ditambahkan air sedikit demi sedikit dan

ditambahkan berbagai perlakuan yakni ekstrak daun kemangi konsentrasi terbaik,

formalin 0,05% (Pransiska & Taty, 2016) sebagai kontrol positif, dan tanpa

pemberian apapun sebagai kontrol negatif. Masing-masing adonan diaduk kembali

selama + 4-5 menit lalu digiling hingga membentuk lembaran dan dilakukan

pemotongan menggunakan pasta maker hingga didapatkan bentuk mi yang

diinginkan. Selanjutnya dilakukan perebusan menggunakan air sebanyak 4 kali

lipat dari jumlah mi yang telah diberi minyak kelapa (10% dari air rebusan)

(Sihombing, 2007).

Mi basah dengan berbagai perlakuan kemudian ditutup dengan cling wrap

dan disimpan pada suhu kamar (+ 25oC). Kemudian dilakukan pengamatan dengan

uji mikrobiologi, uji mutu kimia, dan uji organoleptik mi basah dengan waktu

interval adalah setiap hari selama 4 hari. Diagram alir aplikasi ekstrak daun

kemangi dapat dilihat pada Gambar 11.

36

Gambar 11. Diagram Proses Aplikasi Ekstrak Daun Kemangi

(Modifikasi Sihombing, 2007)

Bahan baku mi basah

Pengadukan bahan-bahan kering

(t : 1 menit)

Tanpa perlakuan

(kontrol -)

Penambahan

ekstrak daun

kemangi

konsentrasi terbaik

Penambahan

formalin 0,05%

(kontrol +)

Pembentukan lembaran

Perebusan

(t : + 2 menit)

Mi basah

matang

Pencampuran air sedikit demi sedikit

Pengadukan adonan

(t : 4-5 menit)

(

Pemotongan mi menggunakan pasta maker

37

4.5 Kriteria Pengamatan

Kriteria pengamatan yang dilakukan terbagi menjadi dua pengamatan yakni

pengamatan terhadap uji aktivitas antimikroba dan uji kualitas mi basah sebagai

berikut:

1) Uji Aktivitas Antimikroba (Modifikasi Atikah, 2013)

a. Perhitungan diameter zona hambat antimikroba

2) Uji Kualitas Mi Basah

a. Uji mikrobiologi meliputi uji Total Mikroba (Badan Standarisasi Nasional,

2014), total coliform (Badan Standarisasi Nasional, 2008), dan total kapang

(Badan Standarisasi Nasional, 2015).

b. Mutu kimia mi basah yang meliputi uji kadar air (AOAC, 2006).

c. Uji organoleptik mi basah berdasarkan panca indera yang meliputi warna,

aroma, dan tekstur yang dilakukan setiap hari selama 4 hari (Depkes

RI,2000). Metode yang akan digunakan adalah uji mutu hedonik dengan

panelis semi terlatih sebanyak 15 orang (Soekarto, 1985).