HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC)

1. Tujuan percobaan :

o Dapat menjelaskan dan menggunakan HPLC

o Dapat menganalisa sample dengan menggunakan HPLC

2. Perincian kerja :

Membuat larutan standar dan sample

Membuat kurva kalibrasi

Menganalisa sample

3. Peralatan yang Digunakan :

HPLC

Labu takar

Gelas kimia

Labu semprot

4. Bahan yang Digunakan :

Methanol

Aquadest

Kafein

5. Dasar Teori :

Dalam kimia analisis, HPLC kini sudah berkembang menjadi suatu

teknik yang dapat diandalkan terutama untuk penentuan analit-analit dalam

matriks yang kompleks. Pemisahan yang baik dapat dicapai dengan kolom

HPLC yang baik, didukung dengan kondisi eluen yang sesuai. Sedangkan

pengukuran yang selektif di lakukan di dalam detector.

Injection port

Pump

Detector

Recorder

Adapun diagram alat HPLC adalah sebagai berikut ;

column

chromatogram

solvent

perkembangan teknologi untuk HPLC memang dapat diamati dari

beberapa sudut pandang. Yang sudah pasti diketahui bahwa kondisi dan sifat

permukaan fasa diam yang disusun di dalam kolom, banyak menentukan

keberhasilan suatu analisis pemisahan. Dalam kimia analisis, HPLC adalah

suatu jenis kromatografi yang dipercepat dengan tekanan tinggi.

Kromatografi padatan-cairan dimana fasa yang diam disusun dalam suatu

kolom yang kecil, jadi untuk menggerakkan fasa gerak (pelarut) digunakan

tekanan tinggi yang dihasilkan oleh suatu pompa

jadi pada dasarnya HPLC merupakan teknik (peningkatan) dari

kromatografi cairan. Pada HPLC komponen-komponen yang telah dipisahkan

dialirkan melalui detector dan hasilnya direkam oleh suatu rekorder. Sistim

pelarutan kromatografi ini ada dua yaitu : sistim Gradien yang menggunakan

dua macam pelarut (eluen) yang berbeda dan komposisi campuran eluen

tersebut dari awal berubah sesuai yang telah diprogramkan dan sistim yang

lain adalah sistim isokratik yang hanya bekerja dengan satu macam eluen

atau campuran eluen komposisinya tetap.

Komposisi dari pelarut juga akan mempengaruhi pemisahan, sehingga

pelarut yang digunakan harus bersifat :

Dapat melarutkan contoh

Mempunyai viskositas yang rendah

Dapat membuat contoh yang diperoleh kembali bila diinginkan

Cocok dengan detector

Tidak merubah kolom dan sifat kolom

Berada dalam keadaan murni dan tidak terkontaminasi serta mudah

didapat secara komersil dengan harga yang layak

Bebas dari gas, karena gas yang larut akan membentuk gelembung-

gelembung udara di dalam detector pada alat HPLC

Keunggulan dari HPLC adalah :

Dalam hal kecepatan

Pemisahan yang baik

Kepekaan yang tinggi

Kolom dapat di pakai berulang kali

Kolom yang telah digunakan untuk pemisahan secara bertahap

(gradient elution) dapat dibersihkan melalui cara pembilasan dengan

sejumlah fasa gerak yang digunakan. Kolom yang berdiameter kecil

umumnya lebih mudah digunakan dan hasilnya lebih baik daripada kolom

yang berdiameter besar, begitu juga kolom yang lebih panjang lebih baik

daripada kolom yang ukurannya sangat pendek, dan untuk kecepatan, pada

HPLC digunakan partikel-partikel yang lebih kecil sebagai absorben dan

kolom yang relatife kecil, maka dengan pemberian tekanan yang tinggi akan

mempercepat waktu.

Yang perlu diperhatikan dalam HPLC adalah : kolom, pelarut, dan

detector

Kolom

Kata kolom bagi kimiawan analisis akan langsung dikaitkan

dengan sistem pemisahan kromatografi. Keuntungan dari penggunaan

kolom mikro ialah bahwa kepekaannya lebih tinggi, lebih menghemat

pelarut dipakai dan memperluas kemampuan detector. Kolom yang tepat

dengan kondisi yang baik pula, akan menghasilkan pemisahan yang baik

dan puncak-puncak yang dapat terpisah pada kromatogram.

Kolom yang baik adalah :

Yang tahan karat

Dibuat dari baja

Dan berisi butir-butir zat padat sebagai fasa diam

Pelarut (Fasa Gerak)

Pada fasa gerak yang perlu diperhatikan adalah gas-gas yang

terlarut di dalamnya. Jadi sebelum digunakan fasa gerak tersebut,

terlebih dahulu harus dibebaskan dari suatu gas tersebut. Ini dapat

dilakukan dengan proses degassing, ataukah dengan cara dirakumkan

dengan getaran ultra sonic dan dengan pemanasan sambil diaduk. Ini

penting untuk menghindari terjadinya penyumbatan pada kolom dan

terganggunya kepekaan detector.

Menurut Scott dan kucera (1977) bahwa komponen cuplikan tidak

dapat berinteraksi langsung dengan gagasan hokum fasa diam. Dan

mekanisme yang terjadi adalah partisi karena komponen berinteraksi

dengan lapisan pelarut teradsorpsi pada permukaan fasa terikat.

Sebagai contoh untuk campuran fasa gerak methanol/air, dimana

air tidak dapat membasahi fasa diam , tetapi fasa diam tersebut dengan

mudah dapat terbasahi oleh methanol

Detector

Salah satu detector HPLC yang khusus adalah detector

spektofotometer, detector ini merupakan detector yang selektif, artinya

hanya memberikan respon kepada analit (KCYA) yang menyerap sinar

dengan penggunaan gelombang tertentu. Zat lain yang tidak menyerap

pada λ tersebut, tidak akan terdeteksi. λ itu dapat kita pilih sedemikian

rupa sehingga detector hanya mendeteksi analit dan tidak mendeteksi

pelarut, pereaksi atau zat-zat yang biasanya mengganggu.

Sehingga detector pada HPLC memerlukan beberapa persyaratan

antara lain :

Mempunyai kepekaan yang tinggi

Mempunyai respon yang cepat

Memiliki presisi yang cukup baik

Tidak memberikan akibat pada pelebaran puncak kromatogram

Dapat mengatasi berbagai pengaruh yang disebabkan oleh

perubahan-perubahan yang terjadi dalm : pelarut, pH, suhu,

komposisi dan lain-lain.

6. Prosedur Kerja :

A. Persiapan

1. Menghubungkan kabel power ke sumber listrik. Menghidupkan UPS

2. Menyiapkan kebutuhan analisa (baku, sampel, fase gerak dan

peralatan lain)

3. Menghidupkan SPD-20A, LC-20AD, dan CBM-20A

4. Memasukkan suction filter ke dalam botol fase gerak masing-masing

yang akan digunakan (purging jika perlu)

5. Menghidupkan CPU, monitor dan printer. Ditunggu hingga muncul

menu utama windows

B. Instrument

1. Pada menu utama windows, klik icon bergambar huruf S, akan

muncul tampilan “LCsolution”

2. Klik angka 1 akan muncul tampilan “Lab Solution”

3. Klik OK akan terdengar bunyi yang menandakan koneksi antara

HPLC dengan software. Akan muncul menu utama “Real Time

Analysis”

4. Klik File, New Method File untuk membuat file metode baru

5. Isi parameter sesuai kondisi analisa yang diinginkan (untuk

parameter LC Stop Time isi dengan 0.01)

6. Simpan parameter yang telah diset ke dalam nama filenmetode

tertentu dengan cara mengklik File, Save Method File As, tentukan

folder penyimpanan, isi nama file, klik Save

7. Klik “downLoad” untuk mengirim parameter ke system HPLC

8. Hidupkan instrument dengan mengklik icon pada tollbar baris kedua

sebelah kiri atas, semua unit akan aktif

9. Tunggu hingga baseline stabil. Untuk menolkan baseline, klik icon

ke empat pada tollbar baris ke dua

10. Untuk mengetahui tingkat kelinieran baseline, lakukan Baseline

Check dengan mengklik icon yang bergambar grafik

11. Tunggu hingga kolom Result menunjukkan Pass

C. Seting Parameter Data Proses

1. Pada jendela Real Time Analysis klik Method Data Analysis

Parameter (Detektor A)

2. Klik tab Quantitative, isikan parameter metode perhitungan yang

akan digunakan berikut unitnya

3. Klik tab Compound Table, isikan kolom sesuai nama peaknya dan

waktu retensi masing-masing beserta konsentrasinya

4. Klik Ok kemudian klik download

D. Injeksi Tunggal

1. Klik icon “single start”

2. Isi parameter yang diinginkan (sample Name, Sample ID, terutama

parameter Data File, tentukan folder penyimpanan). Beri tanda √

pada kolom Auto Increment untuk pengulangan nama secara

berseri.

3. Klik Ok

4. Lakukan injeksi baku dengan cara memutar tuas injector Rheodyne

ke posisi Load, injeksikan ± 80 larutan baku, putar tuas ke posisi

INJECT. Analisis akan segera berlangsung sesuai dengan waktu

analisis yang telah diset

5. Ulangi langkah di atas (point 2-5) untuk injeksi baku berikutnya

E. Mencetak Laporan

1. Pada menu utama Real Time Analysis, klik “Report Format”

2. Drag/tarik format report yang akan kita gunakan ke sebelah kanan

3. Kemudian pilih data yang akan di cetak dengan mengklik tab Data

pada jendela Data Explorernya

4. Klik data filenya dan drag ke sebelah kanan. Untuk melihat tampilan

klik Preview dan klik Print untuk mencetak

6. Data pengamatan :

Luas Area

Standar 1 : 213,188

Standar 2 : 376, 257

Standar 3 : 774,702

Sample : 219,413

7. Pembahasan :

Dari kurva dapat dilihat bahwa konsentrasi berbanding lurus dengan

luas area, tetapi dalam praktikum kali ini terdapat 1 titik yang

menyimpang yaitu pada srandar 2, hal ini mungkin di karenakan

kesalahan pada saat pembuatan larutan standar

Analisa kualitatif pada HPLC dapat dilakukan dengan

membandingkan retention time yaitu waktu antara injeksi sampai

keluarnya “peak”. Dengan membandingkan retention time contoh dan

standar dapat diketahui senyawa dalam contoh

Analisa kuantitatif dilakukan dengan membuat kurva antara

konsentrasi dengan luas area dari larutan standar, lalu luas area contoh

diplotkan.

8. Kesimpulan :

HPLC merupakan teknik atau peningkatan dari kromatografi cairan.

Pada HPLC komponen-komponen yang telah dipisahkan dialirkan

melalui detector dan hasilnya direkam oleh suatu rekorder. Yang

perlu diperhatikan dalam HPLC adalah : kolom, pelarut, dan detector

Dari hasil memplot luas area contoh pada kurva standar di dapatkan

konsentrasi larutan contoh adalah 105 ppm

9. Daftar Pustaka :

Kasdira kasman, 2007, “Kromatografi gas dan KCKT” kelas 4, khusus

Sekolah Menengah Analis Kimia. Makassar,

Prosedur Pengoperasian HPLC (SHIMADZU LC-20 SERIES USING LC-

SOLUTION SOFTWARE)