analisis dengan teknik kromatogaf cair hplc (1)
DESCRIPTION
analisis dengan teknik kromatograf cairTRANSCRIPT
2
Kromatografi Kromatografi merupakan metode pemisahan yang
mengandalkan perbedaan perilaku interaksi analit antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen dalam campuran.
Komponen yang berinteraksi sangat kuat ke fase diam memerlukan waktu lama di dalam kolom dan terpisahkan dari komponen yang berinteraksi kuat di fase gerak yang melewati kolom lebih cepat.
3
Kromatografi Komponen yang keluar dari ujung kolom
dideteksi dan diukur oleh detektor. Instrumen analitis dapat dikombinasikan
antara metode pemisahan dengan analisis on-line.
Contoh: Kromatografi gas dan cair dengan spektrometri
massa (GC-MS dan LC-MS) atau GCMSMS, LCMSMS
Fourier-transform spektroskopi inframerah (GC-FTIR).
Diode-array UV-VIS absorpsi spektroskopi(HPLC-UV- VIS).
4
KromatografiMekanisme interaksi dalam kromatografi
Mekanisme Fasa diamAdsorpsi padatPartisi cairIon exchange anion atau kation yang
berikatan kovalen pada resinMolekul Size gelAfinitas zat aktif yang melekat pada zat
padat pendukung
5
HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Kromatografi padat-cair dan cair-cair. Fasa diam (stationer) permukaan aktifnya
dapat berupa padat, cairan, resin penukar ion atau polimer
Proses pemisahan komponen sampel berdasarkan pada interaksi komponen sampel dan fasa diam.
Interaksi dapat berupa absorpsi (fasa diam padat) atau partisi (fasa diam cairan), pertukran ion, molekuler eksklusi atau afinitas.
6
Perkembangan LCUHPLC : Ultra High Performance Liquid
ChromatographyFHPLC : Fast High Performance Liquid
ChromatographyUPLC : Ultra Performance Liquid
Chromatography
Pilih HPLC atau UHPLC ?
7
Peralatan :
8
Pemilihan Fasa Gerak (mobil) Fasa gerak mengatur interaksi fasa terlarut dan
fasa diam, maka pemilihan fasa gerak adalah penting.
Fasa mobil yang digunakan harus berkualitas “HPLC” atau minimal Spektrofotometri
Untuk mencegah rusaknya peralatan (pompa, detector atau kolom pakcing dll), tidak boleh digunakan sebagai fasa mobil : asam kuat, basa dan larutan halida.
9
Pemilihan Fasa Gerak Fasa mobil di saring dengan ukuran
filter 0,2 mm Tujuan penyaringan Pelarut :
Menghilangkan partikulat dan bakteri agar :Membantu kerja pompa agar awetMembantu kerja kolom agar awet tidak tersumbat.
10
Pemilihan Fasa Gerak Pelarut harus dilakukan “degassing” untuk
mencegah kemungkinan terbentuknya gelembung gas didalam kolom atau aliran ke detektor.
Oksigen pada tekanan tinggi dapat mengakibatkan hal yang serius dalam sistem ini, karena dapat merusak kolom.
Cara melakukan degassing : Diaerasi dengan gas lain yang kelarutannya kecil Divakum Dipanaskan
11
Pemilihan Fasa Gerak Volatilitas harus dipertimbangkan jika tujuan
utamanya adalah “recovery” sampel.
Viskositas harus rendah (kurang dari 0,5 sentipoise), agar tekanan pompa tidak terlalu tinggi dan tidak mengurangi transfer massa antara fasa pelarut dan fasa diam.
Jika digunakan untuk fasa mobil pada LC / MS atau MSMS harus dipilih larutan buffer yang mudah menguap “volatile”.
12
Pengendalian Fasa Gerak Isokratik cara penggunaan aliran fasa
mobil yang hanya memerlukan 1 macam komposisi pelarut baik palarut tunggal maupun pelarut campuran selama dilakukan analisis.
Gradien elusi cara penggunaan aliran fasa mobil 2 jenis pelarut atau lebih yang diprogram secara otomatis sehingga komposisinya berubah sesuai Program yang telah dirancang, agar diperoleh pemisahan yang lebih baik
13
Sistem Pompa
Pompa Reciprocating
Sistem Pompa Pompa jenis ini banyak digunakan Biasanya digunakan dua buah pompa Satu pompa bergerak menghisap sedangkan
pompa yang lain bergerak mendorong pelarut Dengan cara ini fluktuasi tekanan menjadi sangat
kecil
14
15
Sistem injeksi sampel Sistem dalam HPLC mempunyai tekanan yang
sangat tinggi 300 atm cara menginjeksikan sampel yang paling sesuai yaitu “Sampling Loop”
16
Sistem injeksi sampel Diagram Valve
17
Sistem injeksi sampel
Diagram Valve
18
Sistem injeksi sampel (manual)
19
Sistem injeksi sampel (automatic)
20
Sistem injeksi sampel (automatic)
21
Kolom
Kolom HPLC
Merupakan bagian yang sangat penting dalam HPLC
22
Penggunaan Kolom Kromatografi fasa normal (normal
phase).Dalam sistem ini digunakan fasa gerak non polar misalnya Heksana atau isopropil- eter, dan fasa diamnya lebih polar misalnya Trietilen-glikol atau air.
Kromatografi fasa terbalik (Reversed phase).Dalam sistem ini digunakan fasa gerak lebih polar misalnya, air, metanol atau asetonitril, sedangkan fasa diamnya non polar misalnya Hidrokarbon (C-18) oktadekana.
Jenis kolom HPLC dan kegunaannya Jenis sampel Mode Tipe Fasa mobil Contoh
1. Kepolaran rendah & larut dalam hidrokarbon
Reverse phase
-C18 Metanol/air,asetoni tril/ air, asetonitril/ THF, THF/metylen klorida
Polinuklear hidrokarbon aromatik, trigliserida lipid, ester, vitamin dalam lemak, steroid, hidroquinon, alkaloid.
2. Kepolaran medium & larut dalam alkaloid
Normal phase
-CN Asetonitril, metilen klorida, heksana, karbontetra klorida
Vitamin larut dalam lemak, steroid, alkohol, aromatik, amina, ester, lipid.
-NH2 Heksana, metilen klorida, asetonitril
Amina aromatik, ester, pestisida klorinasi, asam karboksilat, nukleotida, asam phtalat, polinuklear aromatik.
Reverse phase
-ODS -C8 -CN
-TMS -NH2
Metanol, air, asetonitril
Steroid, bahan alam yang larut dalam alkohol, vitamin, asam aromatik, xanthin, antibiotik, anti oksidant, zat aditif karbohidrat. 23
Jenis kolom HPLC dan kegunaannya
3. Kepolaran tinggi & larut dalam lemak
Reverse phase
-C8-CN
-TMS
Metanol, air, asetonitril, larutan buffer.
Vitamin larut dalam air, amina, alkohol aromatik, analgesik, antibiotik, aditif makanan.
Penukar kation
-SO3 Air, larutan buffer Kation anorganik, karbamat, vitamin, asam amino, nukleotida, glikosida.
Penukar anion
-NR3+
-NH2
Sitrat, buffer phosfat pH 2-7.
Nukleotida, anion anorganik, gula, asam organik.
Pasangan ion
-ODS -C8
Air, metanol, setonitril.
Asam, katekol, amina, sulfonat.
24
Jenis kolom HPLC dan kegunaannya4. Kepolaran
tinggi & larut dalam lemak
Reverse phase
-C8-CN
-TMS
Metanol, air, asetonitril, larutan buffer.
Vitamin larut dalam air, amina, alkohol aromatik, analgesik, antibiotik, aditif makanan.
Penukar kation
-SO3 Air, larutan buffer Kation anorganik, karbamat, vitamin, asam amino, nukleotida, glikosida.
Penukar anion
-NR3+
-NH2
Sitrat, buffer phosfat pH 2-7.
Nukleotida, anion anorganik, gula, asam organik.
Pasangan Ion
-ODS -C8
Air, metanol, setonitril. Asam, katekol, amina, sulfonat.
25
26
Detektor Indek Refraksi
27
Detektor Detektor UV-Vis
28
Kromatogram 2D Conditions:
Cartridge column 20x2.1mm HAISIL HL C18
200µL/min 15% acetonitrile/
10mM phosphate buffer (pH 2.2)Detector: 210nm
Contoh : Analisis minuman ringan
Detektor
29
Kromatogram 3D
30Contoh : Kromatogram 3D
31
Kromatogram 3D
32
MS ATAU MSMS
33
Total Ion Chromatogram (TIC)
34
Kromatogram Massa Q1
35
Kromatogram Massa Q1 dan Q3
36
Pemecahan Massa Terpilih
37
Kromatogram Massa Q3
38
Analisis Sampel Sampel sering merupakan campuran dari banyak
komponen dalam matriks yang kompleks.
Sampel mengandung banyak senyawa yang tidak diketahui, metode analisis yang digunakan harus dapat memisahkan satu sama lain sehingga setiap komponen individual dapat diidentifikasi.
Campuran dapat dipisahkan dengan mengguna kan perbedaan sifat fisik atau sifat kimia dari komponen individu.
39
Analisis Sampel Beberapa sifat senyawa yang dapat digunakan
untuk pemisahan adalah kelarutan, titik didih, tekanan uap, adsorbsi, ukuran partikel dan lain-lain
Sifat komponen dalam campuran adalah tetap jika kondisinya konstan, sehingga campuran dapat dipisahkan dan diidentifikasi.
Pemisahan dan identifikasi adalah cara khas dalam teknik analisis kromatografi dan elektroforesis
40
Prosedur analisisDalam analisis dengan teknik kromatografi agar didapatkan hasil yang optimal perlu dilakukan dalam beberapa tahapan.
Tahap 1 – Ekstraksi Tahap 2 – Clean Up (Pembersihan) Tahap 3 – Analisis
41
Tahap1 : Ekstraksi Setelah sampel diukur berat atau volumenya lalu
dilakukan ekstraksi.
Ekstraksi sampel berfungsi untuk pemekatan atau merubah dari satu fasa (padat) ke fasa yang lain (cair)
Memisahkan analit dengan matrik pengotornya agar beban kolom lebih ringan dan gangguan matrik menjadi berkurang.
Karena sampel lebih “bersih”, analisis menjadi lebih cepat, teliti dan akurat.
42
Macam Ekstraksi Jenis ekstraksi yang dapat dilakukan
pada sampel:
Ekstraksi Cair-cair (Liquid-Liquid Extraction)
SoxhletEkstraksi Fasa Padat/Solid Phase
Extraction (SPE)Ekstraksi Fluida Superkritis
43
Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair menggunakan dua pelarut yang
tidak saling melarutkan, untuk memisahkan analit dari satu pelarut ke pelarut yang lain.
Menurut teori partisi, distribusi dari zat terlarut antara dua fase adalah kondisi kesetimbangan.
Dilaboratorium, biasanya ekstraksi senyawa organik dari fase air masuk ke fasa organik.
44
Ekstraksi Cair-Cair Jika sampel berbentuk padatan biasanya perlu
dilarutkan dulu atau dihaluskan.
Analisis Organik seringkali jauh lebih rumit.
Sampel dapat berada dalam matriks yang sangat rumit sehingga memerlukan prosedur ekstraksi berhati-hati untuk mendapatkan analit dalam bentuk yang dapat dianalisis.
45Ekstraksi dengan corong pisah
Ekstraksi Cair-Cair
46
Ekstraksi Cair-Cair
47
Ekstraksi Cair-Cair
48
Ekstraksi Soxhlet Dalam metode ini, sampel ditempatkan dalam
kantong kertas saring. Kantong ditempatkan di ruang ekstraksi (2),
yang ditempatkan di atas tabung yang berisi pelarut (1) dan di bawah kondensor (3).
Labu ini dipanaskan, pelarut menguap dan bergerak naik ke kondensor.
Uap diubah menjadi cairan yang menetes ke ruang ekstraksi yang berisi sampel.
Ruang ekstraksi dirancang sedemikian rupa sehingga ketika pelarut sekitar sampel melebihi tingkat tertentu akan melimpah dan mengalir kembali ke dalam labu didih.
Proses ekstraksi dapat berlangsung beberapa jam.
49
Ekstraksi Soxhlet
50
Ekstraksi fluida Superkritis Teknik ini relatif baru sebagai metode
ekstraksi
Ekstraksi fluida superkritis (SFE) telah diterapkan untuk persiapan sampel pada skala analitis.
Teknik ini mirip ekstraksi Soxhlet kecuali bahwa pelarut yang digunakan adalah cairan superkritis. (material pada suhu dan tekanan kritis).
Keuntungan utama menggunakan SFE adalah tidak digunakan pelarut organik, sehingga mengurangi masalah limbah di laboratorium.
51
Ekstraksi fluida Superkritis
Diagram fasa sistem tiga komponen
52
Ekstraksi fluida Superkritis Critical properties of various solvents (Reid et al, 1987)
Solvent Molecular weight g/mol
Critical temperature K
Critical pressure MPa (atm)
Critical density g/cm3
Carbon dioxide (CO2) 44.01 304.1 7.38 (72.8) 0.469
Water (H2O) 18.02 647.3 22.12 (218.3) 0.348
Methane (CH4) 16.04 190.4 4.60 (45.4) 0.162
Ethane (C2H6) 30.07 305.3 4.87 (48.1) 0.203
Propane (C3H8) 44.09 369.8 4.25 (41.9) 0.217
Ethylene (C2H4) 28.05 282.4 5.04 (49.7) 0.215
Propylene (C3H6) 42.08 364.9 4.60 (45.4) 0.232
Methanol (CH3OH) 32.04 512.6 8.09 (79.8) 0.272
Ethanol (C2H5OH) 46.07 513.9 6.14 (60.6) 0.276
Acetone (C3H6O) 58.08 508.1 4.70 (46.4) 0.278
53
Ekstraksi fluida Superkritis Ekstraksi ini memanfaatkan sifat khas dari CO2
dimana gas ini bersifat nonpolar dan mudah mencair dengan memberikan tekanan.
Sifat nonpolar gas CO2 menyebabkan mudah melarutkan banyak senyawa organik yang pada umumnya bersifat nonpolar.
Daya larut CO2 dapat ditingkatkan atau dikurangi dengan memvariasikan tekanan dan temperatur.
Kepolaran CO2 dapat ditingkatkan dengan menambahkan sedikit pelarut lain (modifier) seperti metanol, isopropanol, asetonitril, air atau benzena.
54
Ekstraksi fluida SuperkritisKeutungan cara ekstraksi fluida super kritis :
Ekstraksi hanya memerlukan waktu yang sangat singkat antara 30 menit sampai 2 jam.Dapat menghasilkan persen ekstraksi yang mendekati 100 % sehingga seluruh zat dapat terekstrak seluruhnya dari matriknya.
Cara (teknik) analisis lebih sederhana dan biaya relatif murah karena harga CO2 yang murni jauh lebih murah dibandingkan pelarut-pelarut yang lain.
Sangat cocok untuk megekstraksi zat yang tidak tahan panas.
Tidak membahayakan lingkungan karena CO2 tidak beracun.
55
Ekstraksi fluida SuperkritisZat yang diekstraksi Waktu ekstraksi
Soxhlet Fluida Super KritisPoli Hidrokarbon aromatik/ PAH
24 jam 15 menit
Lilin (Wax) 16 jam 45 menitLemak 7 jam 10 menitAlkana 48 jam 15 menitdioksin 20 jam 2 jam
56
Ekstraksi fluida Superkritis
Prinsip Instrumentasi Ekstraksi SFE
57
Tahap 2 : Clean Up Ekstraksi Fasa Padat/SPE Ekstraksi fasa padat/Solid phase extractions (SPE)
adalah metode ekstraksi yang menggunakan fase padat dan fase cair untuk mengisolasi satu, atau satu jenis analit dari larutannya.
Hal ini biasanya digunakan untuk “membersihkan” sampel sebelum menggunakan metode analisis kromatografi atau lainnya.
Prosedur umum: memasukan larutan ke fase SPE, mencuci komponen dari yang tidak diinginkan, kemudian membilas dengan pelarut analit yang diinginkan dan ditampung ke dalam tabung koleksi.
58
Ekstraksi Fasa Padat/SPE Ekstraksi Fasa Padat menggunakan jenis fasa
diam yang sama seperti yang digunakan dalam kromatografi kolom cair.
Fasa diam ditempatkan didalam kolom gelas atau kolom plastik di atas wol atau kaca berpori.
Ujung kolom mungkin berlobang atau memiliki kran (stopcock) untuk mengontrol aliran pelarut melalui kolom.
SPE komersial kapasitas kartridnya 1-10 mL dan dibuang setelah digunakan..
59
Ekstraksi Fasa Padat/SPE
Tahapan prosedur SPE
60
Ekstraksi Fasa Padat/SPE
Cartridge SPE
61
Ekstraksi Fasa Padat/SPE
Cartridge SPE komersial sekali pakai
62
Ekstraksi Fasa Padat/SPE Gambar di bawah menunjukkan cartridge yg
dipasang pada vacuum manifold, untuk meningkatkan laju alir pelarut yang melalui cartridge.
Sebuah tabung koleksi ditempatkan di bawah kartrid SPE (di dalam vacuum manifold untuk contoh pada gambar) untuk mengumpulkan cairan yang keluar dari ujung cartridge.
63
Ekstraksi Fasa Padat/SPE
Vacuum manifold SPE
64
Analisis Kualitatif Tingkat kompleksitas sampel ditunjukkan
dengan jumlah puncak yang muncul.
Informasi kualitatif tentang komposisi sampel diperoleh dengan membandingkan posisi puncak dengan senyawa standar (dengan membandingkan waktu retensi)
Jika digunakan detektor MS atau MSMS, analisis kualitatif dapat diperoleh dari : Waktu retensi, Q1 dan Q2 Dirujuk dari data spektrum senyawa yang tersimpan
di Komputer.
65
Analisis Kualitatif
66
Analisis Kualitatif
67
Analisis Kualitatif
68
Analisis Kualitatif
69
Analisis Kuantitatif Penilaian kuantitatif, konsentrasi relatif dari
komponen diperoleh dari perbandingan luas puncak terhadap senyawa standar yang kadarnya diketahui.
Ada 4 metode penentuan kuantitatif Normalisasi luas puncak Eksternal standar Internal standar Standar addisi
70
71
Normalisasi luas puncak Suntikkan campuran dengan jumlah yang
sama dari semua komponen
Luas masing-masing puncak diukur tepatReplikasi (5 +) suntikanPerlu presisi yang baikSalah satu komponen dipilih sebagai acuan
Luas puncak yang satu dinormalisasikan terhadap luas puncak yang lainDidapatkan faktor Respon detektor (DRF)
72
NORMALISASI LUAS PUNCAK
73
External Standard Injeksikan standar sebelum dan / atau setelah
menganalisis sampel
Standar akan berada pada kromatogram yang berbeda
Tergantung pada kemampuan bereproduksi injeksi yang baik
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan luas puncak sampel dengan puncak senyawa standar.
74
External Standard
75
Internal Standard Menghilangkan kesalahan yang disebabkan
penyuntikan yang tidak akurat
Sebuah senyawa standar sebagai acuan disertakan dalam setiap sampel dengan konsentrasi yang diketahui secara akurat
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan luas puncak sampel dengan puncak senyawa standar.
76
Standar Addisi Sampel dianalisis
Senyawa standar yang diketahui kadarnya ditambahkan ke dalam sampel, dilakukan analisis ulang
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan luas puncak sampel dengan puncak senyawa standar.
Dapat digunakan untuk verifikasi linearitas
77
Standar Addisi
78
Standar Addisi
79
TERIMAKASIH