“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid Chromatography)”

MAKALAHDisusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Kimia Analisis Instrument

Dosen Pengampu : Ibu Sri Haryani Ibu Sri Wardani

Disusun oleh:Kelompok 4 (empat)

Fajar Mahda A.S (4301408024)Diah Ika Rusmawati (4301408054)Santi Budiarti (4301408069)

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG2010

BAB IPENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANGa. Sejarah

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom. Perlu diketahui bahwa D.T> Day pada kira-kira saat yang sama memakai kromatografi untuk memisahkan berbagai fraksi minyak bumi tetapi Tswett-lah yang pertama kali mengenali dan menafsirkan proses tersebut.

Kromatografi merana selama bertahun-tahun, biasanya dipakai dalam bentuk kromatografi cair-padat (KCP). Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai berkembang. Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov dan Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Karya Martin dan Synge, yang pada tahun 1041 membuahkan hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952, Martin dan James mempublikasikan makalah pertamanya mengenai kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.

FASE GERAK

FA

SE

DIA

M

  ZAT CAIR GAS

ZAT PADAT

Kromatografi cair-padat (KCKT) Kromatografi gas-padat (KGP)

ZAT CAIR Kromatografi cair-cair (KCC) Kromatografi gas-cair(KGC)

b. PengertianKromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur

yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik.

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam.

KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI GASKROMATOGRAFI CAIR

GAS-CAIR

KROMATOGRAFI

PARTISI

PENYERAPAN CAIR-

PADAT

PERTUKARAN ION EKSKLUSIGAS-PADAT

KROMATOGRAFI

KERTAS

KROMATOGRAFI

LAPIS TIPIS

Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik.

Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.

B. TUJUANMakalah ini disusun guna memenuhi tugas kelompok mata kuliah

Kimia Analisis Instrumen yang diampu oleh Ibu Sri Haryani dan Ibu Sri Wardani. Adapun tujuan lain adalah sebagai berikut:1. Mengetahui prinsip dasar dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau

high performance liquid chromatography (HPLC).2. Mengetahui proses Kromatografi cair kinerja tinggi atau high

performance liquid chromatography (HPLC) secara kualitatif dan kuantitatif.

3. Mengetahui instrumenisasi dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).

C. MANFAATDari makalah ini, diharapkan dapat :

1. Menambah pengetahuan bagi penulis dan pembaca mengenai metode analisis instrumen khususnya Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif.

2. Memudahkan mahasiswa dalam kegiatan analisis instrumen Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).

BAB IIKAJIAN PUSTAKA

A. PENGERTIANKromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut

dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.

Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang

berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang

dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat

menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk

pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi

gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus

sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi

biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.Teknik HPLC lebih bermanfaat dibandingkan dengan GC (Gas Chromatography).

Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain :1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap

dan zat yang tidak stabil.2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya

dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)

6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat menurunkan biaya karyawan.

7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

B. PRINSIP DASARPrinsip kerja HPLC :

Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat

berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

C. INSTRUMEN ALAT

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

a. Fasa gerakFasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.Persyaratan fasa gerak HPLC:1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang

akan dianalisis.2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran

yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada

kolom.4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan

tidak beracun.5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi

Poise).6. Sesuai dengan detector. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar

dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k’ antara 2-5.

b. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)2. Keluaran bebas pulsa3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit4. Bahan tahan korosiTiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:a) Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

c. Pemasukan cuplikan

Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC:1. Injeksi syringe

Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.

2. Injeksi ‘stop-flow’Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

3. Kran cuplikanJenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah:a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi

“load”, cuplikan masih berada dalam loopb) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi

“injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

d. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi silanisasi) :

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

Si OH + +HClCl Si R

CH3

CH3

Si O RSi

CH3

CH3

e. Detektor HPLCDetektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:

detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil; c. stabil dalam pengopersiannya;d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita;e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:Dasar Pendeteksian

Jenis Maksimum sensitifitas

Peka terhadap kecepatan alir

Sensitivitas suhu

Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 CKonduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0CSpektometri massa

Umum 10-10 Tidak Tidak ada

elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. ANALISA KUALITATIF dan KUANTITATIFAplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan

penentuan kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Contoh hasil analisa HPLC

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah kompone sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori, konsep yang dipinjam dari teori distilasi. Penerapannya dalam kromatografi, jumlah teori plat N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi.

Untuk peak-peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan peak-peak kromatografi gas, jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai:

menyatakan waktu retensi dan menyatakan leher peak pada

setengah tinggi. Akan tetapi untuk peak-peak yang tidak simetri disarankan menggunakan persamaan:

Gambar grafik asimetri:

Peak asimetri dengan parameter A dan B untuk menghitung haraga

N. Berdasarkan gambar, adalah waktu retensi, adalah lebar peak

pada ketinggian 10% atau A+B, A adalah lebar sebelah kanan, dan B adalah lebar setengah peak sebelah kiri.

Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna. Derajat pemisahan (Rs) dalam kromatografi cair kinerja tinggi-pun dinyatakan dengan istilah resolusi yang di formulasi sebagai berikut:

Berdasarkan persamaan di atas, terlihat bahwa resolusi dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas (α), dan retensi (k’). lebih sederhana dari kromatografi gas, di sini selektivitas cukup dinyatakan sebagai:

Dimana:

α adalah selektivitas, dan adalah masing-masing factor

kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2. Harga selektivitas dapat sama dengan

satu atau lebih besar dari satu. Bila harga berarti senyawa 1 dan 2

keluar dari kolom bersama-sama. Dengan kata lain senyawa 1 tidak dapat

dipisahkan dari senyawa 2, sebaliknya bila harga maka senyawa 1

keluar dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. Semakin besar harga

, semakin baik pemisahan.

Efisiensi Pemisahan:Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada

pek-peak kromatogram yang dihasilkan. Semakin lebar suatu peak kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. Parameter efisiensi pemisahan dinyatakan dlam bentuk HETP (height equivalent to a theoretical plate) yang diformulasikan sebagai berikut:

Dimana: H : HETP (height equivalent to a theoretical plate)L : panjang kolom dalam centimeter

N : jumlah total theoretical plate

Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi.Nilai H menurun dengan:1. Ukuran partikel kolom yang kecil2. Laju alir fase gerak yang rendah3. Fase gerak yang kurang kental4. Pemisahan pada temperature tinggi5. Molekul-molekul sample yang kecil6. Meningkatkan panjang kolom.

Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system. Lebar punak kromatografi menunjukkan efisiensi. Efisiensi dan selektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. Efisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, dan optimasi instrumental, sedangkan selektivitas lebih tergantung pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri.

Keuntungan dan keterbatasan HPLCAda beberapa keuntungan HPLC, yaitu:1. Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak

stabil dengan pemanasan.2. Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak

dan fasa diam berperan dalam proses kromatografi.3. Berbagai jenis kolom yang selektif.4. Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.5. Waktu analisis yang cepat.6. Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga

menjamin presisi kuantitatif.7. Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan

pemanasan.8. Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metode

tersebut dapat disesuaikan dengan mudah.Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika

HPL dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu,

keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

BAB IIISIMPULAN

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi: Kromatografi fase normal dan fase terbalik. Beberapa kegunaan HPLC yaitu HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Alat yang berperan penting di dalamnya, antara lain yaitu pompa, injektor, kolom, deterktor, dan fase gerak. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

DAFTAR PUSTAKAGritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB

Bandung.Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang:

IKIP Semarang Press. . 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya Offset.

Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB Bandung.

Bella, Lisa.2009. Skripsi ‘Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) | Chem-Is-Try.Org | Situs Kimia Indonesia |HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ LansidaDasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa