Makalah Tentang high performance liquid chromatograPHy

Disusun Oleh:Nama : ROBERTO Kelas : KA01 NIM : 1512022

KIMIA DASAR 2HANAFIAH

SEKOLAH TINGGI MANAJEMEN INDUSTRIJl.Letjend Suprapto No.26 Cempaka Putih,Jakarta Pusat 10510

KATA PENGANTAR

Salam Sejahtera bagi kita semua. Suatu kelegaan dan kebahagiaan bagi saya, bahwa saya telah berhasil menyelesaikan penulisan makalah tentang High Performance Liquid Chromatography. Makalah ini saya kembangkan dengan model penyajian yang menarik agar dapat dipahami secara utuh. Pendekatan dan penyajian makalah ini pada prinsipnya tetap membahas kegunaan,prinsip cara kerja alat, perawatan dan cara pemeliharaan, serta kelebihan dan kekurangan High Performance Liquid Chromatography (Kromatografi Cair Berkinerja Tinggi). Saya menyadari bahwa tak ada gading yang tak retak, begitu juga makalah ini tidak luput dari kekurangan. Oleh karena itu, kritik, saran, dan masukan dari para teman-teman sangat saya harapkan. Ucapan terima kasih saya hanturkan kepada semua pihak yang telah membantu proses penulisan dan penyelesaian makalah ini. Semoga makalah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan tentang bagi teman-teman dan para pembaca sekalian.

Jakarta, Juni 2013 Penulis

ROBERTO

BAB IPENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat dalam berbagai jenisbenda material.Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi menjadi berbagai macam lagi. Salah satunya yaituKromatografiCairKinerjaTinggiatau yang biasa di kenal HPLC.Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil (3m hingga 50m), yang memungkinkan tercapainya keseimbangan secara cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fasa gerak pada tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai laju aliran beberapa ml per menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20g) untuk isi kolom tersebut di atas, maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada kromatografi gas, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat menguap.Fase diam dapat berupa cairan atau polimer, yang disalut atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis, yang mengurangi hambatan terhadap pemindahan masa, sehingga keseimbangan antara fase gerak dan fase diam dapat tercapai dengan cepat. Suatu fase diam cair harus mempunyai sifat praktis tak bercampur dengan fase gerak, umumnya fasa gerak perlu dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase diam cair, agar fase diam tidak terbawa dari kolom. Fase diam berupa polimer yang disalutkan pada penyangga umumnya lebih dapat bertahan. Suatu fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga lebih mudah pemakaiannya dengan beraneka ragam pelarut serta suhu yang lebih tinggi.Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat. Komposisi dapat mempunyai pengaruh yang jauh lebih besar terdadap faktor kapasitas daripada suhu, (faktor kapasitas =kadalah perbandingan waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang diperlukan selama berada dalam fase gerak).Bahan pengisi kolom lainnya dengan diameter yang lebih kecil, antara 3m hingga 10m, hampir seluruhnya berpori dan memberikan pemisahan yang lebih efisien dari pada partikel pengisi kolom berukuran antara 30m hingga 50m. Partikel tersebut dapat pula dibuat bersifat adsorpsi atau dilapisi dengan suatu fase diam. Dalam hal ini pengisian ke dalam kolom harus dibuat dalam bentuk bubur untuk mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi, berbeda dengan partikel berukuran antara 30m hingga 50m yang dapat diisikan dalam bentuk kering.Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan :1.Kromatografi penukar ion terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. Fase diam pada kromatografi penukar ion umumnya resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-beda. Pada resin penukar kation terdapat gugus aktif yang bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk pemisahan zat-zat bersifat basa, misalnya amina. Sebaliknya pada resin penukar anion teredapat gugus aktif bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat, sulfonat atau karboksilat, yang bermuatan negatif. Senyawa larut air yang ionik atau yang dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin, dan perbedaan dalam afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. pH fase gerak, suhu, jenis ion, konsentrasi ionik, dan senyawa organik tertentu yang berfungsi untuk memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut, dan variabel-variabel tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang diinginkan.2.Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non-polar, dikenal sebagai kromatografi fase balik, maka senyawa non-polar yang larut dalam hidrokarbon, dengan bobot molekul kurang dari 1000, seperti vitamin larut lemak dan antrakinon, dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. Jika fase gerak bersifat non polar dan fase diam polar, maka zat yang bersifat polar, seperti golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Fase gerak yang non-polar dapat dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar, untuk mengurangi retensi dan mengubah pemisahan.3.Beraneka ragam senyawa non ionik dapat dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi, dengan memilih fase diam dan fase gerak yang tepat. FASE GERAK

FASE DIAMZAT CAIRGAS

ZAT PADATKromatografi cair-padat (KCKT)Kromatografi gas-padat (KGP)

ZAT CAIRKromatografi cair-cair (KCC)Kromatografi gas-cair(KGC)

KROMATOGRAFIKROMATOGRAFI GASKROMATOGRAFI CAIRGAS-CAIRKROMATOGRAFI PARTISIPENYERAPAN CAIR-PADATPERTUKARAN IONEKSKLUSIGAS-PADATKROMATOGRAFI KERTASKROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

1.2 TUJUANMakalah ini disusun guna memenuhi tugas kelompok mata kuliah Kimia Dasar 2 oleh Bpk. Hanafiah. Adapun tujuan lain adalah sebagai berikut:1. Mengenalkan teknik High Performance Liquid Chromatography, termasuk operasional dasar instrumen dan mempelajari pengaruh pengaturan sejumlah parameter.2. Mengetahui prinsip dasar dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).3. Mengetahui proses Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) secara kualitatif dan kuantitatif.4. Mengetahui instrumenisasi dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).

1.3 MANFAATDari makalah ini, diharapkan dapat :1. Menambah pengetahuan bagi penulis dan pembaca mengenai metode analisis instrumen khususnya Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif.2. Memudahkan mahasiswa dalam kegiatan analisis instrumen Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).

BAB IIPEMBAHASAN 2.1 PENGERTIAN HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.

2.2 JENIS-JENIS HPLCPemisahan denganHPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kaliHPLC dikelompokkan menjadiHPLC fase normal danHPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 2.3 BEBERAPA KEGUNAAN HPLC

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

Aplikasi dalam ilmiahPerkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC).This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as one.Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satupasangan basa.The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology.Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide(SNPs).Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotidapolimorfisme(SNP).These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population.Ini adalah satu dasarpasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi, They can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC: Analisis Diazepam dalam darah Diazepam (Valium)merupakanSenyawagolongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air,rumus kimiaC23H27N. Diazepam termasuk obat antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. MempunyaiIndikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dansebagai obat penenang.Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

2.4 PRINSIP KERJA HPLC

Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

INSTRUMEN ALATInstrumentasiHPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

a. Fasa gerakFasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.Persyaratan fasa gerak HPLC:1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).6. Sesuai dengan detector. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k antara 2-5.a. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)2. Keluaran bebas pulsa3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit4. Bahan tahan korosiTiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:a) Pompa reciprocatingPompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.c) Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (