bab ii injector hplc
DESCRIPTION
injector HPLCTRANSCRIPT
BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode
yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-
protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan
farmasi.
Pada HPLC terdapat injektor yang merupakan tempat untuk memasukkkan
sempel ke kolom. Injeksi sampel untuk dianalisis dengan metoda HPLC
merupakan tahap yang penting, karena meskipun kolom telah memadai, hasil
kromatogram yang ditampilkan tidak akan memadai kalau injeksi sampel tidak
dilakukan dengan tepat. Keadaan ini akan menjadi suatu keharusan apabila yang
dituju analisis kuantitatif dengan HPLC.
Kebanyakan pemasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan
band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh microliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem
HPLC melalui injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan. Oleh sebab
itu, dalam makalah ini akan dibahas berbagai sistem injektor HPLC yang umum
dipakai.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
I. Injektor/ Injection Port
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom.
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan
waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda
memiliki waktu retensi yang berbeda.
Pada alat HPLC biasanya dilengkapi dengan penyampel otomatis
(automatic sampler). Penyampel otomatis dapat diprogram untuk
mereaksikan atau menginjeksikan sampel. Volume sampel berkisar dari 1 - 5
µl. Injektor yang baik harus mudah digunakan dan dapat bekerja walaupun
ada tekanan balik . Injeksi sample seluruhnya otomatis. Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas , maka tidak
akan diketahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.
I.1 Injeksi syringe
Alat untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan
melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan
tekanan sampai 1500psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit
labih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.
Gambar 1. Syringe
I.2 Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi disini aliran
pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambungkan
kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
I.3 Kran cuplikan/loop
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak
digunakan. Untuk memasukan cuplikan kedalam aliran fasa gerak perlu dua
langkah:
a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan kedalam loop dalam posisi
“load”, cuplikan masih berada dalam loop.
b. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi”
dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-
ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengan
sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan
pada tekanan 7000psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia
dengan volume 0,5 hingga 5µL.
Gambar 2. Tipe injector katup putaran
Injektor :
Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit
mungkin
Mudah digunakan
Keberulangan tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
II. Fase Gerak (Mobile phase)
Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak
selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor,
juga dapat berinteraksi dengan solut-solut.
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus
memenuhi beberapa persyaratan berikut:
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akan dianalisis.
b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran
diameter 0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring
partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas
dapat mengganggu base line.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak
beracun.
e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
f. Sesuai dengan detektor.
Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis
dalam keberhasilan pemisahan. Sayangnya, teori interaksi fasa gerak dengan
sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih
sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan
atas eksperimen trial and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut
hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak
yang baik memberikan faktor kapasitas “k‟ pada rentang yang sesuai. Untuk
cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang
memberikan “k‟ antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen,
waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasanya beberapa pelarut
atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas
yang cocok. Pemilihan pelarut-pelarut juga bergantung pada faktor
selektifitas (α) untuk komponen cuplikan.
Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan
banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan.
Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:
a. HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan
fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina,
atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa
gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b. HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar
dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol,
atau asetinitril. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas ‘k’
pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen,
sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan ‘k’ antara 2-5.
Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah
pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai
wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan degassing ( penghilangan gas ) yang ada pada fase gerak, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa
dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat
pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan
lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk
KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam dapat
terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga
dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.
Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu
untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Rohman, 2007).
III. Kolom dan Fase Diam
Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika
fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase
terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase
geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme
sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana
dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan
fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril
dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam
lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut
dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat
menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak
penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar
garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase
gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang
melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion
yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi
gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis
senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang
jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-
molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang
jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan
demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi
yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena
adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang
lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.
Ada dua perbedaan dalam HPLC, dimana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam yaitu (Anonim, 2007):
a) Fase normal HPLC
Ini secara esensial sama dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
b) Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut (Anonim, 2007).
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom (Anonim, 2007).
Aqueous/Buffer Anion or CationIon Ionics Inorganic Ions
OrganicsSilica, Amino,Cyano, Diol
NormalPhase
Compounds notsoluble in water
Water/Organic Ion-Pair Reagent
C-18, C-8Ion Pair
Ionics, Bases, Acids
Water/Organic Modifiers
C18, C8, C4cyano, amino
ReversedPhase
NeutralsWeak AcidsWeak Bases
Mobile PhaseStationaryPhase
ModeTypes of Compounds
http://nakhdiahsaisal.blogspot.com/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-
hplc.html
http://informasitips.com/kromatografi-pengertian-dan-jenisnya
http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://www.artikelkimia.info/cara-kerja-hplc-21532201072011
“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid
Chromatography)” MAKALAH Fajar Mahda A.S (4301408024)
Diah Ika Rusmawati (4301408054)
Santi Budiarti (4301408069) JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2010
Aqueous/Buffer Anion or CationIon Ionics Inorganic Ions