bab ii injector hplc

23
BAB I PENDAHULUAN Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. Pada HPLC terdapat injektor yang merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Injeksi sampel untuk dianalisis dengan metoda HPLC merupakan tahap yang penting, karena meskipun kolom telah memadai, hasil kromatogram yang ditampilkan tidak akan memadai kalau injeksi sampel tidak dilakukan dengan tepat. Keadaan

Upload: tuti-tzu

Post on 14-Aug-2015

172 views

Category:

Documents


9 download

DESCRIPTION

injector HPLC

TRANSCRIPT

Page 1: BAB II injector HPLC

BAB I

PENDAHULUAN

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut

dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode

yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan

kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-

protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,

produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan

farmasi.

Pada HPLC terdapat injektor yang merupakan tempat untuk memasukkkan

sempel ke kolom. Injeksi sampel untuk dianalisis dengan metoda HPLC

merupakan tahap yang penting, karena meskipun kolom telah memadai, hasil

kromatogram yang ditampilkan tidak akan memadai kalau injeksi sampel tidak

dilakukan dengan tepat. Keadaan ini akan menjadi suatu keharusan apabila yang

dituju analisis kuantitatif dengan HPLC.

Kebanyakan pemasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan

band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil

mungkin, beberapa puluh microliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem

HPLC melalui injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan. Oleh sebab

itu, dalam makalah ini akan dibahas berbagai sistem injektor HPLC yang umum

dipakai.

Page 2: BAB II injector HPLC

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

I. Injektor/ Injection Port

Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom.

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju

detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan

waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian

puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda

memiliki waktu retensi yang berbeda.

Pada alat HPLC biasanya dilengkapi dengan penyampel otomatis

(automatic sampler). Penyampel otomatis dapat diprogram untuk

mereaksikan atau menginjeksikan sampel. Volume sampel berkisar dari 1 - 5

µl. Injektor yang baik harus mudah digunakan dan dapat bekerja walaupun

ada tekanan balik . Injeksi sample seluruhnya otomatis. Karena proses ini

meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas , maka tidak

akan diketahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.

Page 3: BAB II injector HPLC

I.1 Injeksi syringe

Alat untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan

melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan

tekanan sampai 1500psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit

labih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.

Gambar 1. Syringe

I.2 Injeksi ‘stop-flow’

Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi disini aliran

pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan

cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambungkan

kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

I.3 Kran cuplikan/loop

Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak

digunakan. Untuk memasukan cuplikan kedalam aliran fasa gerak perlu dua

langkah:

a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan kedalam loop dalam posisi

“load”, cuplikan masih berada dalam loop.

Page 4: BAB II injector HPLC

b. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi”

dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-

ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengan

sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan

pada tekanan 7000psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia

dengan volume 0,5 hingga 5µL.

Gambar 2. Tipe injector katup putaran

Injektor :

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit

mungkin

Mudah digunakan

Keberulangan tinggi

Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

II. Fase Gerak (Mobile phase)

Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak

selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor,

juga dapat berinteraksi dengan solut-solut.

Page 5: BAB II injector HPLC

Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus

memenuhi beberapa persyaratan berikut:

a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang

akan dianalisis.

b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang

dapat mengganggu interpretasi kromatogram.

c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada

kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran

diameter 0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring

partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas

dapat mengganggu base line.

d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak

beracun.

e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi

Poise).

f. Sesuai dengan detektor.

Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis

dalam keberhasilan pemisahan. Sayangnya, teori interaksi fasa gerak dengan

sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih

sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan

atas eksperimen trial and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut

hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak

yang baik memberikan faktor kapasitas “k‟ pada rentang yang sesuai. Untuk

Page 6: BAB II injector HPLC

cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang

memberikan “k‟ antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen,

waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasanya beberapa pelarut

atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas

yang cocok. Pemilihan pelarut-pelarut juga bergantung pada faktor

selektifitas (α) untuk komponen cuplikan.

Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,

karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan

banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan.

Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:

a. HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan

fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina,

atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa

gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

b. HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar

dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol,

Page 7: BAB II injector HPLC

atau asetinitril. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas ‘k’

pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen,

sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan ‘k’ antara 2-5.

Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah

pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai

wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak

antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus

dilakukan degassing ( penghilangan gas ) yang ada pada fase gerak, sebab

adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa

dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat

pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan

pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan

lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk

KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam dapat

terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga

dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.

Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu

untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Rohman, 2007).

III. Kolom dan Fase Diam

Jenis HPLC

Page 8: BAB II injector HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika

fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase

terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase

geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC

dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan

berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada

mekanisme

sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana

dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan

kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan

menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian

sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.

Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan

berinteraksi

dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang

berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat

menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang

dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang

Page 9: BAB II injector HPLC

digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-

hidrokarbon

non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan

fenil.

Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS

atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril

dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam

lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH

fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau

protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan

ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut

dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang

mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat

menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak

penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling

luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan

kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena

sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran

misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar

Page 10: BAB II injector HPLC

ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar

garam

total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar

garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini

disebabkan

oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase

gerak

untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk

pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang

melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion

yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi

gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis

senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang

digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus

sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau

berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang

jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-

molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang

jauh

Page 11: BAB II injector HPLC

lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak

melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan

demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi

interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi

yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi

biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus

molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi

yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang

sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein

(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Page 12: BAB II injector HPLC

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara

kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan

divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena

adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-

reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus

silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang

lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika

aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika

yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan

waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air

yang digunakan. 

Page 13: BAB II injector HPLC

Ada dua perbedaan dalam HPLC, dimana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam yaitu (Anonim, 2007):

a) Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

b) Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut (Anonim, 2007).

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom (Anonim, 2007).

Aqueous/Buffer Anion or CationIon Ionics Inorganic Ions

OrganicsSilica, Amino,Cyano, Diol

NormalPhase

Compounds notsoluble in water

Water/Organic Ion-Pair Reagent

C-18, C-8Ion Pair

Ionics, Bases, Acids

Water/Organic Modifiers

C18, C8, C4cyano, amino

ReversedPhase

NeutralsWeak AcidsWeak Bases

Mobile PhaseStationaryPhase

ModeTypes of Compounds

Page 14: BAB II injector HPLC

http://nakhdiahsaisal.blogspot.com/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-

hplc.html

http://informasitips.com/kromatografi-pengertian-dan-jenisnya

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://www.artikelkimia.info/cara-kerja-hplc-21532201072011

“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid

Chromatography)” MAKALAH Fajar Mahda A.S (4301408024)

Diah Ika Rusmawati (4301408054)

Santi Budiarti (4301408069) JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2010

Aqueous/Buffer Anion or CationIon Ionics Inorganic Ions