tugas awal hplc

8/18/2019 tugas awal hplc

1/22

TUGAS AWAL

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(HPLC)

DISUSUN OLEH :

Megawati T.H. R !"

A #$% %& %%&

Ke' ! I

Ke'a* +

A*i*te,

WA-AN ADHI KRESNANDA

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNI ERSITAS TADULAKO

PALU

#/%0


2/22

A. Pe,ge1tia, HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut denganHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif HPLC

secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi

kolom !elain dari pelarut yang menetes melalui kolom di ba"ah pengaruh gra#itasi$

HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan

%&& atm Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat

!aat ini$ HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis

dan pemurnian senya"a tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang$ antara

lain ' farmasi$ lingkungan$ bioteknologi$ polimer$ dan industri industri makanan

eberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain ' miniaturisasi sistem HPLC$

penggunaan HPLC untuk analisis asam asam nukleat$ analisis protein$ analisis

karbohidrat$ dan analisis senya"a senya"a kiral

Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu ' Lo" pressure (tekanan rendah)$

dan High pressure (tekanan tinggi *+ bar biasanya memakai satuan kpa,kilo paskal)

Pada HPLC terdapat o#en untuk pemanas karena pada partikel kecil$ cairan ditekan

terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan

menggunakan pompa kemudian didorong$ jika ditarik cairan masuk) Tekanan harus

*+ bar$ antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur

meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig, ion e-change) karena

ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding Temperatur pada HPLC

digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga K. tetap

+. Je,i*2 Je,i* HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase

diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya) erdasarkan pada kedua

http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt.htmlhttp://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt.html


3/22

pemisahan ini$ sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan

HPLC fase terbalik !elain klasifikasi di atas$ HPLC juga dapat dikelompokkan

berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut$

dengan jenis jenis HPLC sebagai berikut'

/ Kromatografi 0dsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam

kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis Pemisahan kromatografi adsorbsi

biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan

alumina$ meskipun demikian sekitar 1&2 kromatografi ini memakai silika sebagaifase diamnya Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi

dengan solut 3ugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda$

karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang

berekor

4 Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara

kimia"i atau fase terikat !ejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika

adalah hidrokarbon hidrokarbon non polar seperti dengan oktadesilsilana$ oktasilana$

atau dengan fenil 5ase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan

(6.! atau C/7) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik

!ebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau

dengan larutan bufer 8ntuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah$ peranan

pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalamiionisasi atau protonasi Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan

ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk

spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan

terelusi lebih cepat


4/22

9 Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau aniondengan suatu fase gerak 0da banyak penukar ion yang beredar di pasaran$ meskipun

demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin Kebanyakan

pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat

ionisasinya .alam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air alkohol

dan juga pelarut organik Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air$ retensi

puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase

gerak Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut Hal ini

disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak

untuk gugus penukar ion pada resin

% Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel

sampel ionik dan mengatasi masalah masalah yang melekat pada metode penukaran

ion !ampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berla"anan

: Kromatografi ;ksklusi 8kuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat

digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senya"a dengan berat molekul <

4&&& dalton 5ase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat

porus sehingga solut dapat mele"ati porus (le"at diantara partikel)$ atau berdifusi

le"at fase diam =olekul solut yang mempunyai = yang jauh lebih besar$ akan

terelusi terlebih dahulu$ kemudian molekul molekul yang ukuran medium$ danterakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil Hal ini disebabkan solut dengan =

yang besar tidak mele"ati porus$ akan tetapi le"at diantara partikel fase diam

.engan demikian$ dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi

kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain


5/22

+ Kromatografi 0finitas

.alam kasus ini$ pemisahan terjadi karena interaksi interaksi biokimia"i yangsangat spesifik 5ase diam mengandung gugus gugus molekul yang hanya dapat

menyerap sampel jika ada kondisi kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik

tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan

antibodi) Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (en>im)

dari campuran yang sangat kompleks

Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain '

/ HPLC dapat digunakan untuk isolasi >at yang tidak mudah menguap dan >at yang

tidak stabil4 HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi9 Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi% .apat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya: .alam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam

beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit

fase gerak yang dikonsumsi)+ iaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno$ sehingga dapat

menurunkan biaya karya"an* Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar

C. P1i,*i Ke13a HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit analit berdasarkan

kepolarannya$ alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu

sebagai fasa geraknya ?ang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya

adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak Campuran

analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya$ dan kecepatannya untuk sampai ke

detektor ("aktu retensinya) akan berbeda$ hal ini akan teramati pada spektrum yang

puncak puncaknya terpisah


6/22

.engan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector

Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan .i dalam

kolom terjadi pemisahan komponen komponen ampuran Karena perbedaan kekuatan

interaksi antara solut solut terhadap fasa diam !olut solut yang kurang kuat

interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu !ebaliknya$ solute

solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute solut tersebut akan keluar

dari kolom lebih lama !etiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh

detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram

8rutan skala polaritas ' golongan fluorocarbon @ golongan hidrokarbon @

senya"a terhalogenasi @ golongan eter @ golongan ester @ golongan keton @

golongan alkohol @ golongan asam

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif Pada proses

kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat

Aetention time (AT) Peak yang mempunyai AT yang sama dengan standard


7/22

umumnya adalah sebagai peak milik analat !elain melihat AT hal lain yang perlu

dilihat adalah spektrum 9. dari signal kromatogram Bat yang sama akan mempunyai

spektrum 9. yang juga sama !ehingga jika spektrum 9. antara dua >at berbeda$

maka kedua >at tersebut juga dipastikan adalah >at yang berlainan$ meskipun

memiliki AT yang sama

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang

dianalisis di dalam sampel ?ang berperan dalam proses separasi pada system HPLC

adalah kolom 0da kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa$ misalnya

kolom C/7 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid$ protein$ lo#astatin$ dan

sebagainya amun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu$

seperti kolom Borba- carbohydrat (0gilent) yang khusus digunakan untuk analisa

karbohidrat (mono $ di $ polysakarida) Keberhasilan proses separasi sangat

dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil

!etelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan$ tahap selanjutnya adalah proses

identifikasi Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram .alam

kromatogram akan terdapat peak peak yang menggambarkan banyaknya jenis

komponen dalam sample

!ample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak ahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk

(o#erlap) Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi

6leh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample

yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih

dari impuritis !ample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandungkomponen selain >at aktif !ample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja

D. I,*t1"!e,t HPLC


8/22

Dnstrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas' "adah fase gerak (Aeser#oir) $

pompa$ alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi)$ kolom$ detektor$ "adah

penampung buangan fase gerak$ dan suatu komputer atau integrator atau perekam

.iagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di ba"ah ini '

Eadah fase gerak (Aeser#oir)

Eadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert) Eadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai "adah fase gerak Eadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara / sampai 4 liter pelarut 5ase gerak

sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase

gerak !ebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan

mengacaukan hasil analisis 5ase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang

dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi

.aya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut$ polaritas

fase diam$ dan sifat komponen komponen sampel 8ntuk fase normal (fase diamlebih polar daripada fase gerak)$ kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut !ementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase

gerak)$ kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut

5ase 3erak


9/22

5ase gerak dalam HPLC adalah berupa >at cair dan disebut juga eluen atau

pelarut !elain berfungsi sebagai pemba"a komponen komponen campuran

campuran menuju detector$ fase gerak dapat berinteraksi dengan solut solut 6leh

karena itu$ fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan

proses pemisahan

Persyaratan fase gerak HPLC'/ Bat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan

dianalisis4 Bat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang

dapat mengganggu interpretasi kromatografi9 Bat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom% Bat cair harus mudah diperoleh$ murah$ tidak mudah terbakar$ dan tidak

beracun: Bat air tidak kental 8mumnya kekentalan tidak melebihi &$: cP (centi Poise)+ !esuai dengan detector

Fenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak'a HPLC fase normal' HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan

fase gerak non polar 5ase diam yang digunakan seperti silica$ alumina$ atau

trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica !edangkan fase gerak

yang digunakan adalah heksana atau i propileter b HPLC fase terbalik' HPLC dengan kombinasi antara fase diam non polar dan

fase gerak polar 5ase gerak yang digunakan seperti air$ methanol$ atau

asetinitril

5ase gerak yang baik memberikan factor kapasitas kG pada rentang yang

sesuai 8ntuk cuplikan dengan 4 9 komponen$ sebaiknya menggunakan fase gerak

yang memberikan kG antara 4 :

E. P ! a

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai

syarat sebagaimana syarat "adah pelarut yakni' pompa harus inert terhadap fase


10/22

gerak ahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas$ baja tahan karat$ Teflon$

dan batu nilam Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan

sampai :&&& psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 9

mL,menit 8ntuk tujuan preparatif$ pompa yang digunakan harus mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 4& mL,menit

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk

menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat$ reprodusibel$

konstan$ dan bebas dari gangguan 0da 4 jenis pompa dalam HPLC yaitu' pompa

dengan tekanan konstan$ dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan Tipe

pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkandengan tipe pompa dengan tekanan konstan

• Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC'a Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara

gerakan piston mundur maju yang dijalankan oleh motor Piston berupa gelas dan

berkontak langsung dengan pelarut Ketika piston mundur maka bola gelas ba"ah

terangkat dan pelarut masuk$ sebaliknya ketika piston maju maka bola ba"ah

menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong

masuk ke dalam kolom


11/22

b Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi

pendorong yang digerakkan oleh motor Pompa ini juga menghasilkan aliran yang

cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan #iskositas pelarut

c Pompa pneumatic

.alam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi Pompa jenis ini

murah dan bebas pulsa 0kan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan

yang dihasilkan (@4&&& psi) serta kecepatan alir bergantung pada #iskositas pelarut

dan takanan balik kolom

F. Te! at I,3e *i

!ampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom$ harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom !ampel yang akan dipisahkan

dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi olume


12/22

injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan #ariabel #olume

(misalnya 4& I :&& JL)

• 0da tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan 'a !top 5lo"' 0liran dihentikan$ injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir$ sistem

tertutup$ dan aliran dilanjutkan lagi Teknik ini bisa digunakan karena difusi di

dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi b !eptum' !eptum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan

pada Kromtografi 3as Dnjektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai +&

*& atmosfir Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut pelarut

Kromatografi Cair Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jaruminjektor) dapat menyebabkan penyumbatan

c Loop al#e' Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi #olume

lebih besar dari /& J dan dilakukan dengan cara automatis (dengan

menggunakan adaptor yang sesuai$ #olume yang lebih kecil dapat diinjeksifan

secara manual) Pada posisi L60.$ sampel diisi kedalam loop pada kinerja

atmosfir$ bila 0L ; difungsikan$ maka sampel akan masuk ke dalam kolom• !yarat syarat injektor yang baik '

.apat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin=udah digunakanKeberulangan tinggi.apat bekerja "alaupun ada tekanan balik

• Pemasukan cuplikan

eberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC'

/ Dnjeksi syringe

!yringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang

syringe yang tahan tekanan sampai /:&& psi akan tetapi keterulangan injeksi syringe

ini sedikit lebih baik dari 4 92 dan sering lebih jelek

4 Dnjeksi stop flo"G


13/22

Dnjeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut

dihentikan sementara$ sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan

langsung ke dalam ujung kolom !etelah menyambungkan kembali kolom maka

pelarut dialirkan kembali

9 Kran cuplikan

Fenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop 8ntuk memasukkan cuplikan

ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah'

a !ejumlah #olume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi loadM$

cuplikan masih berada dalam loop b Kran diputar untuk mengubah posisi loadM menjadi posisi injeksiM dan fasa

gerak memba"a cuplikan ke dalam kolom


14/22


15/22

Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan

alkilklorosilana (reaksi silanisasi) '

6ktadesil silika (6.! atau C/7) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senya"a senya"a dengan kepolaran yang

rendah$ sedang$ maupun tinggi 6ktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebihsesuai untuk solut yang polar !ilika silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih

cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi !ilika yang tidak

dimodifikasi akan memberikan "aktu retensi yang ber#ariasi disebabkan karena

adanya kandungan air yang digunakan

H. Dete t 1

.etektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 4 golongan yaitu' detektor

uni#ersal (yang mampu mendeteksi >at secara umum$ tidak bersifat spesifik$ dan

tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massaN

dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara

spesifik dan selektif$ seperti detektor 8 is$ detektor fluoresensi$ dan elektrokimia

Ddealnya$ suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut'

a mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibelN

b mempunyai sensitifitas yang tinggi$ yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecilN

c stabil dalam pengopersiannyaNd mempunyai sel #olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pitaN


16/22

e signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier)Nf tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Karakteristik detector HPLC'

.asar

Pendeteksian

Fenis =aksimum

sensitifitas

Peka terhadap

kecepatan alir

!ensiti#itas

suhu

0bsorbsi 8 !pesifik 4 - /& /+ Tidak Aendah

0bsorbsi DA !pesifik /& + Tidak Aendah

5lourometri !pesifik /& // Tidak Aendah

Dndek bias 8mum / - /& * Tidak O /& % & C

Konduktometri !pesifik /& 7 ?a 42 &C

!pektometri

massa

8mum /& /& Tidak Tidak ada

elektrokimia !pesifik /& /4 ?a /$:2 &C

I. A,a'i*a K"a'itati4 5a, K"a,titati4

0plikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan

kuantitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada "aktu retensi

untuk identifikasi Ddentifikasi dapat diandalkan apabila "aktu retensi sampel

dibandingkan dengan larutan standar !edangkan beberapa hal yang harus

diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif

adalah'

/ Parameter percobaan sama antara standar dan sampel4 Penentuan berdasarkan "aktu retensi sampel dan standar yang sama


17/22

9 Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada "aktu retensi tertentu ?aitu berdasarkan

area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram .alam

kromatogram akan terdapat peak peak yang menggambarkan banyaknya jenis

komponen dalam sample !ample yang mengandung banyak komponen didalamnya

akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak ahkan tak jarang antar peak

saling bertumpuk (o#erlap) Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan

perhitungan konsentrasi 6leh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan

tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke

HPLC sudah cukup bersih dari impuritis !ample farmasi biasanya jauh lebih mudah

karena sedikit mengandung komponen selain >at aktif !ample ini umumnya hanya

melalui proses pelarutan saja

Contoh hasil analisa HPLC


18/22

!eperti pada kromatografi gas$ jumlah peak menyatakan jumlah kompone

sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran Komputer

dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta

mengolah data hasil pengukuran HPLC ;fisiensi kolom biasanya dinyatakan secara

matematika dengan istilah plet teori$ konsep yang dipinjam dari teori distilasi

Penerapannya dalam kromatografi$ jumlah teori plat $ untuk kolom ditentukan dari

lebar peak dan "aktu retensi

8ntuk peak peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan peak peak

kromatografi gas$ jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai'

t r menyatakan "aktu retensi dan W ½ menyatakan leher peak pada setengah tinggi

0kan tetapi untuk peak peak yang tidak simetri disarankan menggunakan persamaan'


19/22

Peak asimetri dengan parameter 0 dan untuk menghitung haraga

erdasarkan gambar$ t r adalah "aktu retensi$ W 0,1 adalah lebar peak padaketinggian /&2 atau 0O $ 0 adalah lebar sebelah kanan$ dan adalah lebar setengah

peak sebelah kiri

Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan

kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna .erajat pemisahan

(As) dalam kromatografi cair kinerja tinggi pun dinyatakan dengan istilah resolusi

yang di formulasi sebagai berikut'

erdasarkan persamaan di atas$ terlihat bah"a resolusi dipengaruhi oleh tiga

factor yaitu efisiensi ( )$ selekti#itas ( )$ dan retensi (kG) lebih sederhana dari

kromatografi gas$ di sini selekti#itas cukup dinyatakan sebagai'

.imana'

α adalah selekti#itas$ k’ 1 dan k’ 2 adalah masing masing factor kapasitas senya"a /

dan senya"a 4 Harga selekti#itas dapat sama dengan satu atau lebih besar dari satu


20/22

ila harga α = 1 berarti senya"a / dan 4 keluar dari kolom bersama sama .engan

kata lain senya"a / tidak dapat dipisahkan dari senya"a 4$ sebaliknya bila harga α

> 1 maka senya"a / keluar dari kolom lebih cepat dari pada senya"a 4 !emakin

besar harga α $ semakin baik pemisahan

J. E4i*ie,*i Pe!i*a6a,

Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek peak kromatogram yang dihasilkan !emakin lebar suatu peak kromatogram maka dapat

dikatakan pemisahan semakin kurang efisien Parameter efisiensi pemisahan

dinyatakan dlam bentuk H;TP (height equi#alent to a theoretical plate) yang

diformulasikan sebagai berikut'

.imana' H Q H;TP (height equi#alent to a theoretical plate)

L ' panjang kolom dalam centimeter

' jumlah total theoretical plate

ilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang

kolom ilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai yang

besar 6bjek yang paling penting dalam KCKT adalah meminimalkan nilai H

sehingga nilai maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi

ilai H menurun dengan'

/ 8kuran partikel kolom yang kecil


21/22

4 Laju alir fase gerak yang rendah9 5ase gerak yang kurang kental

% Pemisahan pada temperature tinggi: =olekul molekul sample yang kecil+ =eningkatkan panjang kolom

Farak diantara puncak maksimal menunjukkan selekti#itas system Lebar

punak kromatografi menunjukkan efisiensi ;fisiensi dan selekti#itas merupakan

descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter parameter kromatografi yang

berbeda beda ;fisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom$ ukuran

partikel$ laju alir$ dan optimasi instrumental$ sedangkan selekti#itas lebih tergantung

pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri

K. Ke",t",ga, 5a, ete17ata*a, HPLC

0da beberapa keuntungan HPLC$ yaitu'

/ .apat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil dengan

pemanasan4 Dnteraksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak dan fasa

diam berperan dalam proses kromatografi9 erbagai jenis kolom yang selektif% =enghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi: Eaktu analisis yang cepat+ Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menjamin

presisi kuantitatif* Aesiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan7 Keragaman kolom dan detector berarti bah"a selekti#itas metode tersebut dapat

disesuaikan dengan mudah

Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senya"a$ kecuali jika HPLdihubungkan dengan spektrofotometer massa (=!) !elain itu$ keterbatasan lainnya

adalah jika sample dianalisis sangat kompleks$ maka resolusi yang baik sulit

diperoleh


22/22

tugas awal hplc

Documents