HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakanfasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasageraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolomdengan bantuan pompa/tekanan.

Komponen pokok yang ada dalam alat HPLC :

1. Gradien Controller/Solvent Reservoir :Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalamkolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harusdimilipore (pori-pori + 5μm) dan didegass.

2. Pompa :Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.

3. Sample Introductions/Injector :Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel denganbantuan syringe.

4. Kolom :Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlahterjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.

5. Detektor :Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasilpemisahan kolom.

6. Data Output :Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.

Klasik HPLC

- Partikel besar berpori

- 100 - 250

- 10 – 50

- 50 – 200

- 0,1 – 1

- ≤ 0.1- Lama- Besar (preparatif)- 200- 1

- Perikular- Mikropartikulat- 37 – 50- 5 – 10- 1 – 3- 2 – 6- 50 – 100- 10 – 50- 30 – 50- 100 – 200- 0.5 – 5- Cepat- Lebih kecil- 10.000- 7

- Jenis partikel pengisi kolom

- Diameter partikel (μm)

- Diameter kolom (mm)

- Panjang kolom (cm)

- Tekanan (atm)

- Kec Alir (mL/menit)- Waktu Pemisahan- Kapasitas- HETP- Resolusi

Perbandingan Antara Kromatografi Cairan Klasik dan HPLC

KEUNTUNGAN HPLC• Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan

data• Volume sampel kecil• Daya pisah tinggi• Merupakan metode analitis

– Cepat– Peka– Akurat– Tepat– Reproducible

• Juga Preparatif• Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan

non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.• Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

POMPA (Sistem Penyalur Fasa Gerak)

• Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak• Bebas pulsa• Perlu “de gasser”• Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan

dan tekanan lebar• Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien• Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

JENIS – JENIS POMPA

• Pompa bolak – balik (reciprocating pump)– Paling banyak digunakan– Jumlah vol pelarut tidak terbatas– Dapat digunakan untuk elusi gradien– Menghasilkan aliran berpulsa

• Pompa jenis penyuntik (syringe pump)– Kapasitas ruang pelarut 250 – 500 mL– Untuk kolom – kolom kecil (micro bore columns)– Menghasilkan aliran bebas pulsa

Metode Pemisahan Umum dalam HPLC

Tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat ;– Fasa Normal

• Fasa gerak nonpolar• Fasa diam polar

– Fasa Terbalik• Fasa gerak polar• Fasa diam nonpolar

Typical stationary and mobile phases for normal and reverse phase chromatography

DETEKTOR HPLC

Tergantung pada jenis senyawa dalam eluat ;– Spektrofotometer UV – Visible– Indeks bias– Spektrofluorimeter ( zat berfluoresensi )– Konduktivitas listrik ( zat ionik )– Spektrometer infra merah– Spektrometer massa ( LC – MS )– Spektrometer NMR ( LC – NMR )

Jenis Detektor Karakteristik HPLC

Daftar Pustaka

• VOGEL’S, 1989. Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 5th edition. Longman Scientific & Technical. John Wiley & Sons, Inc. New York.

• Albert K., 2002. On-Line LC-NMR and Related Techniques. John Wiley & Sons Ltd. England.

• Sadek P. C., 2002. The HPLC Solvent Guide. 2nd. Wiley Interscience. John Wiley & Sons, Inc. New York.

• Synder, L.R., Kirkland, J.J., Glaich. J. L., Practical HPLC Method Development. 2nd . Wiley-Interscience. New York.

Analisis Kafein dalam Tablet dengan Metode HPLC

Fasa Gerak Siapkan campuran pelarut H2O : MeOH : AcOH (69:28:3) grade HPLC atau PA yang

sudah dimilipore dan didegass.

Larutan Standar Internal

Siapkan larutan asam benzoat dalam metanol dengan konsentrasi kira – kira 6

mg/mL

Larutan Stok Standar

Larutkan secara akurat sejumlah tertentu standar kafein grade USP/PA dengan

pelarut campuran ( MeOH : Asam asetat glacial 95:5 ) dengan konsentrasi kira – kira

0.25 mg / mL

Preparasi Standar

Pindahkan20 mL larutan stok standar dan 3 mL larutan standar internal ke dalam

labu ukur 50 mL, encerkan dengan pelarut campuran seperti diatas sampai tanda

batas, dan dihomogenkan.

Preparasi sample uji kafein Timbang sample kafein yang sudah dihaluskan sekitar 250 mg, dan dimasukkan ke

dalam labu ukur 100 mL. tambahkan 75 mL pelarut campuran, kocok dengan shaker

sekitar 30 menit. Encerkan sampai tanda batas dengan pelarut campuran, dan

dihomogenkan. Pindahkan 2 mL larutan ini dan 3 mL larutan standar internal ke

dalam labu ukur 50 mL,encerkan sampai tanda batas, dan dihomogenkan.

Sistem Kromatografi

HPLC dilengkapi dengan detector UV dengan λ 275 nm dan kolom C-18. Kecepatan

alir eluen sekitar 2 mL /menit.

Prosedur Analisis

Suntikkan sekitar 10 μL larutan preparasi standar dan larutan sample yang sudah

dipreparasi secara terpisah, ke dalam HPLC. Waktu retensi kafein sekitar 0.5, asam

benzoate sekitar 1. Hitung kadar kafein (C8H10N4O2) dalam sample uji dengan rumus;

2500 C ( Rv / Rs )

C ; Konsetrasi dalam mg/mL standar kafein USP / PA dalam preparasi standar

Rv & Rs ; Rasio factor respon puncak analit dan puncak standar internal yang

didapat dari preparasi sample uji kafein dan preparasi standar.

PETUNJUK PENGGUNAAN ALAT

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

HP 1100, AGILENT CHEMSTATION

LABORATORIUM KIMIA BAHAN ALAM DAN LINGKUNGAN JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN

BANDUNG 2007

PERHATIAN !

• SEBELUM MEMAKAI ALAT HARAP KONFIRMASI JADWAL KE

BAGIAN ADMINISTRASI SEKURANG-KURANGNYA SEMINGGU

SEBELUMNYA

• SEBELUM MEMAKAI ALAT, HARAP MENGISI KELENGKAPAN

ADMINISTRASI • UNTUK PEMULA HARAP MEMBACA & MEMAHAMI PETUNJUK

INI SEBELUM MENGOPERASIKAN ALAT

• HARAP UNTUK SELALU MENGIKUTI PETUNJUK PENGGUNAAN

• UNTUK MENGHINDARI HAL-HAL YANG TIDAK DIINGINKAN,

SEBAIKNYA PENGGUNA MINTA PENDAMPING

PENGOPERASIAN MELALUI BAGIAN ADMINISTRASI

• SEMUA ELUEN, SAMPEL YANG DIBAWA HARUS SUDAH

DISARING DENGAN MILLIPORE DAN DIAWAGASKAN

• APABILA TERJADI KESALAHAN ATAU KERUSAKAN SEKECIL

APAPUN PADA ALAT MAUPUN SOFTWARE, HARAP

SECEPATNYA MELAPOR, JANGAN MENCOBA UNTUK

MEMPERBAIKI SENDIRI

• SETELAH SELESAI MENGGUNAKAN ALAT, CHECK ALIRAN

LISTRIK, KEBERSIHAN DAN KERAPIHAN ALAT DAN RUANGAN.

JIKA TIDAK DIGUNAKAN, SAKLAR HARUS SELALU MATI DAN

ALAT SELALU DITUTUP DENGAN PENUTUP YANG TERSEDIA

• SETIAP MENGGUNAKAN ALAT HARUS SELALU MEMAKAI

ALAS KAKI YANG BERSIH DAN KERING, UNTUK

MENGHINDARI SENGATAN LISTRIK

• ALAT TIDAK BOLEH DINYALAKAN KETIKA DI LUAR

RUANGAN SEDANG ADA PETIR, KILAT ATAU HALILINTAR

I. Sekilas Pengenalan Alat HPLC HP 1100.

Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang ada di jurusan

Kimia FMIPA Unpad adalah HPLC type HP 1100 buatan Hewlet

Packard. Alat ini terdiri dari 3 bagian perangkat keras, yaitu:

• Alat HPLC-nya sendiri yang terdiri atas : (penampakan dari atas ke

bawah) botol eluen, injektor, pompa, kolom dan detektor.

• Seperangkat komputer yang terdiri atas : CPU, monitor, keyboard,

mouse dan mouse pad.

• Printer HP Laserjet 6L.

Setiap alat dilengkapi dengan penutupnya yang harus selalu dipasang

jika alat sedang tidak digunakan untuk menghindari debu dan kotoran.

Dalam komputernya, telah dipasangkan pengolah data Agilent

Chemstation dengan dasar MS-Windows NT. Untuk kelancaran

penggunaan, selain mengolah data dilarang memasukkan disket atau

CD ke dalam komputer dan atau mengotak-atik software lain yang

terdapat didalamnya (misalnya menulis dalam notepad).

PEDOMAN PENGGUNAAN

PREPARASI SAMPEL

• Sampel harus dalam bentuk larutan.

• Untuk skala analisis sampel dalam µL, konsentrasi sampel yang

diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.

Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

• Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade

HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.

• Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian

diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk

menghilangkan udara terlarut.

• Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan,

untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

• Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang

digunakan.

PENYALAAN ALAT

• Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung

eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat

gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung

pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat

penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa

kembali seperti semula.

• Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).

• Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).

• Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)

• Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)

• Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

• Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul

tampilan :

Windows NT workstation version 4.00

Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya,

kemudian tekan ENTER.

• Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.

• Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu

diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG

PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !

• Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No

• Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik

pada menu Instrument 1 Online.

Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan

pengolahan data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat

komputernya saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out

kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk melakukan print

ulang kromatogram yang sudah ada.

• Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih

dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan

juga dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram

yang dihasilkan akan bagus.

Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation,

klik menu Run Control. Kemudian :

• Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.

• Klik menu Instrument, klik pada set up pump

>set gradient fasa gerak

>set laju alir

>set waktu run dan post run

catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1

uL/menit untuk menghemat eluen.

• Klik pada kolom, klik control, klik on.

• Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible),

tergantung sample yang akan diinjeksikan.

• Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi

kolom yang diinginkan.

• Klik menu Instrument, klik Set Up DAD Signals untuk mengatur

panjang gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang

gelombang pilihan disertai dengan tanda X.

• Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang

lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.

• Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang

diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT !

Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!

PERSIAPAN INJEKSI

INGAT.....: TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP

TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING

TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI

• Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)

• Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas

• Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan

line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline

pada skala nol tekan BALANCE.

• Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL,

klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut

keterangan sampel.

• Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.

• Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak

utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan

ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit),

pencucian masukkan ke dalam file CUCI.

CARA INJEKSI

• Ambil alat injek (syringe).

• Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya

metanol)

• Kemudian bilas syringe dengan sampel

• Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi

tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau

gelembung udara

• Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar

terpasang loop 20 uL

• Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas),

injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum

syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress

data aquasition.........

• Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk

menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi

puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di

layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data

Analysis”.

• Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka

pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali

sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running

cuci kolom ke dalam file cuci.

PRINT OUT KROMATOGRAM

• Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap

sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA

ANALYSIS.

• Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih

file mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang

diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.

• Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang

dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE.

Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor

yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap

puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga

puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan

waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan

saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK

sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X

merah yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X

merah tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin

ditampilkan.

• Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik

SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang

diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar

sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada

icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.

• Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu

VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL.