KIMIA ANALISIS DASAR

KROMATROGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

DISUSUN OLEH :

AGUNG NURSYAWALY ( 061440421741 )SILVA ANGGRAINI ( 061440421759 )

DOSEN PEMBIMBING :

Dr. Ir. RUSDIANASARI, M.Si.

POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA

2014 / 2015

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami haturkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan rahmat, taufik, dan hidayah-Nya kepada kita sehingga penyusunan Makalah Kimia Analisis Dasar tentang Kromatrografi Cair Kinerja Tinggi ini dapat diselesaikan. Makalah ini disusun berdasarkan sumber – sumber yang telah dikembangkan sesuai dengan perkembangan zaman, sehingga dapat dipakai oleh peserta didik dan guru.

Makalah ini disajikan berdasarkan maksud dan tujuan penulis yaitu untuk mengetahui tentang Kromatrografi Cair Kinerja Tinggi yang mengacu peserta didik untuk lebih aktif dan kreatif sehingga bisa menguasai keterampilan mengenai kromatografi cair kinerja tinggi.

Akhirnya kami berharap makalah ini bermanfaat bagi kita dalam proses belajar dan mengajar.

Palembang, November 2014

Penulis

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Macam kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran zat-zat kimia yang terkandung dalam tumbuhan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi.

HPLC adalah metode kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam padat/bahan pendukung untuk melakukan pemisahan suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi utama yaitu, HPLC yang terdiri dari eluen polar dan fase diam non-polar atau eluen non-polar dan fase diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai metodereversed-phase dannormal-phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai dalam eksperimen ini menggunakan kolom octadecylsilane (ODS) dan partisi absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.

Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya

2

sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

B. Rumusan Masalah

1. Apa karakteristik KCKT?

2. Apa saja jenis-jenis KCKT?

3. Apa saja instrument dari KCKT?

4. Bagaimana cara kerja KCKT?

5. Apa saja kelebihan dan kekurangan KCKT?

6. Bagaimana aplikasi KCKT dalam kehidupan sehari-hari?

C. Tujuan

Tujuan penyusunan makalah kromatografi cair kinerja tinggi yaitu

untuk memisahkan dan menentukan komposisi suatu campuran

komponen-komponen senyawa organik secara kualitatif dan kuantitatif

dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

I. Karakteristik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut

dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan

metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis

kualitatif dan kuantitatif. Yang paling membedakan HPLC dengan

kromatografi lainnya adalah pada KCKT digunakan tekanan tinggi untuk

mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan

kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu

retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang

puncak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode kromatografi adalah

memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya

diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-

masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal

utama yang menjadi krusial point dalam metode KCKT. Yang pertama

adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses

identifikasi. Dua hal ini menjadi faktor yang sangat penting dalam

keberhasilan proses analisa.

Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini

dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya

dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada

setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N).

4

Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :

1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase

gerak, fase diam, dan sampel.

2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.

Sedangkan Interaksi yang terjadi pada kromatografi, yaitu :

1. Adsorbsi, dengan melihat perbedaan stereochemistry

2. Partisi, dengan melihat kelarutan

3. Afinitas, dengan melihat BM

4. Ion Exchange, berdasrkan perbedaan muatan

II. Jenis-Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

2.1. Kromatografi padat-cair

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben

yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis

(TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati

atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular

(berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat

untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ .

Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam

pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat

untuk pemisahan isomer-isomer.

2.2 Kromatografi partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut

yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa

diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari

kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama

seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau

nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah

5

kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk

kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC).

Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih

tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan

secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini

disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography).

BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari

KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila

fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak

lebih polar dari pada fase diam.

2.3. Kromatografi penukar ion

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara

fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-

mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus

fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan

jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan

resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences

dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai

untuk keduanya kation dan anion.

2.4. Kromatografi adsorbsi

Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-

senyawa yang bersifat agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina

biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini

menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut juga

kromatografi fasa normal.

6

2.5. Kromatografi fasa terikat

Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling

penting dan paling banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann

kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan.

Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang

dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada

kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan

zat cair non polar.

Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :

1) Merupakan fasa yang stabil

2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan

berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi

3) Kolom mempunyai umur panjang

4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik

5) Lebih ekonomis

7

BAB III

INSTRUMENTASI

I. Instrumen KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada

Gambar dibawah ini :

3.1. Pompa (Pump)

Fase gerak d

1.1. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui

kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan

(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).

Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating

dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang

berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa

atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line)

detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan

utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe

memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

8

1.2. Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada

kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang

terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis

(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil

dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi

kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka

sampel akan masuK ke dalam kolom.

1. 3. Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu

analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang

sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang

yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros

mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

9

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar

dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya

dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan

temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan

kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT

yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid

Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution

Chromatography, EC)

1.4. Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen

sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya

(analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi,

gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi

respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap

aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat

diperoleh.

Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu :

detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak

bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan

detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang

hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor

UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :

1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar

dari 10-8 hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan.

2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik

3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi

4) Waktu respon yang singkat

10

5) Kemudahan pada penggunaan

6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran

puncak.

Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil

3. Stabil dalam pengoperasiannya

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8µl atau

lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih

kecil lagi

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :

1) Detektor Absorban (UV-Vis) Pada detektor absorban, aliran akan

mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk

meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume

yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 – 10 μl dengan

panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan

tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan

diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.

2) Detektor Fluorescens Detektor fluorescens yang digunakan sama

halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer. Detektor paling

sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan

filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu

Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan gratting

sebagai monokromatornya.

11

3) Detektor Refraktif Indeks Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur

nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan mengukur

indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara

bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.

4) Detektor Elektrokimia Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada

pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu

dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan

detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.

5) Detektor Spektra Massa Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom

dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan alir 10 – 50

μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan

diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan

menghasilkan spektrum massa.

1.5. Tendon pelarut

Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon

harus lembam terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja

anti karat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika

harus bertekanan, hindari menggunakan gelas. Daya tampung tendon harus

lebih besar dari 500 ml yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan

alir yang umumnya 1 – 2 ml/menit.

1.6. Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa

gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien

adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan

kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

12

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi

Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini

menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi

cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi

sebelum dan sesudah pompa.

Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien

Gradien Mode Solven Gradien

Kromatografi Cair padat (LSC) Ya

Kromatografi ekslusi Tidak

Kromatografi Penukar Ion (IEC) Ya

Kromatografi Cair Cair (LLC) Tidak

Kromatografi Fasa Terikat (BPC) Ya

1.8. Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam

bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat

pada Gambar 3. 2 berikut ini

Gambar 3.2 : kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida

13

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui

/ dihitung. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif

suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan

tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat

digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

1.9. Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak

adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat

variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi

ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah

II. Fase dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya)

dibedakan menjadi:

a. Kromatografi fase normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana terdiri atas :

Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel

Fase gerak : bersifat non polar

14

Contohnya adalah sebuah kolom sederhana diisi dengan partikel silika

yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat

lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non

polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat

melewati kolom.

b. Kromatografi fase terbalik

Kromatografi fase terbalik terdiri atas :

Fase diam yang sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan

dengan klorosilan, dan

Fase gerak yang bersifat polar

Contoh kasusnya yaitu silika yang dimodifikasi menjadi

non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada

permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau

18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air

dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara

pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui

kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-

rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan

molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-

molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya

untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung

membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya

van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut

karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya

senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol

misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan

15

waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti

bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Keuntungan kromatografi fase terbalik :

Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya

Senyawa ionic dapat dipisahkan

Air dapat digunakan sebagi pelarut

III Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam)

dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan

HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan

tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah

berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor

(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang

puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan

hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <

golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada

proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah

dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang

sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain

melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal

kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga

sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat

tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT

yang sama.

16

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar

komponen yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses

separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan

untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan

untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada

juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti

kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa

karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi

sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap

selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh

dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat

peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam

sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan

mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar

peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam

identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk

sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar

sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung

komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses

pelarutan saja.

Seleksi Tipe KCKT

17

Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus

membuat keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan

informasi yang diinginkan.

Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi

tipe KCKT . Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan

pemelihan tipe KCKT yang memberikan para analis untuk memutuskan

pemilihan tipe KCKT yang memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan

yang diinginkan. Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown) akan

menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.

Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat

Molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data

spektroskopik seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red

spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai

petunjuk bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

3. Kelebihan dan Kekurangan KCKT

18

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas

(KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk

memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi

diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi

dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak

menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti

KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih

besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer

pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah

sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis

yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang

tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa

dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua

rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang

mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama

dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi

secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT

memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang

diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan

dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9

gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan

Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12

gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks

Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.

19

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom

kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali

(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang

sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven

dan jenis solven yang digunakan.

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang

tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya

diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe

eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat

tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan

dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada

komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel

tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati

detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali

untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Dismping kelebihan diatas, KCKT juga memiliki kekurangan, yaitu :

Mahal

Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit

Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

20

BAB IV

APLIKASI DALAM INDUSTRI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi biasanya digunakan dalam :

A. Penggunaan KCKT dalam Farmasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu

metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan

sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya

adalah untuk analisis senyawa - senyawa yang tidak mudah menguap dan

tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi

Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari

senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk

analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif

dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang

mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979 KCKT belum

digunakan sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif.

Padahal di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti

Farmakope Amerika Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI),

Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches Arzneibuch 10).

Daftar Obat – obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT

diantaranya adalah :

1. Tablet Asetazolamida

2. Asetilsistein

3. Larutan Asetilsistein

4. Tablet Asetosal

5. Asam Aminokaproat

6. Asam Aminosalisilat

7. Asam Folat '

8. Tablet Asam Folat

21

9. Asam Mefenarnat

10. Kapsul Asam Mefenamat

11. Asiklovir

12. Tablet Allopurinol

13. Alprozolam

14. Tablet Alprozolam

15. Amikasin Sulfat

16. Injeksi Amikasin Sulfat

17. Aminofilin

18. Amoksihn .

19. Kapsul Armoksilin

20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

B. Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan

golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol,

alkaloid, lipid dan gula.

22

BAB V

PENUTUP

Karakteristik dari KCKT yang membedaknnya dengan kromatografi lainnya

yaitu pada KCKT digunakan pompa yang dapa diatur pada tekanan tinggi untuk

mendorong fasa gerak. Jenis-jenis KCKT antara lain kromatografi padatan cair,

kromatografi partisi, kromatografi penukar ion (IEC), kromatografi eksklusi,

kromatografi pasangan ion (IPC).

Instrumentasi pada KCKT terdiri atas : pompa, injector, kolom, detector,

system penyuntik, tendon pelarut. Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan analit-

analit berdasarkan kepolarannya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan

kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)

akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya

terpisah.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain: Cepat, Resolusi, Sensitivitas detector, Kolom yang dapat

digunakan kembali, Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik, Mudah

rekoveri sampel.

DAFTAR PUSTAKA

https://www.academia.edu/7765761/Makalah_Kromatografi_Cair_Kinerja_Tinggi

http://rafizanisa.blogspot.com/2009/12/analisis-hplc-dan-aplikasinya.html

http://ekaandrians.blogspot.com/2013/04/hplc.html

http://blogger-ulin.blogspot.com/2014/01/aplikasi-kromatografi-hplc.html

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf