TUGAS PUSTAKA PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI ANALITIK (FA - 3231)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

DALAM ANALISIS JAMU DAN EKSTRAK TUMBUHAN SUKU ZINGIBERACEAE

[dikumpulkan tanggal 19 Februari 2008]

Disusun oleh

Kelompok VI (Selasa)

Ega wulandari Dian Pertiwi (10705101)

Mei Nurul Fitri (10705102)Rama Rupama (10705113)Yusy Novia (10705118)Annisa Rahma (10705122)

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI ANALITIKSEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2008

BAB I

PENDAHULUAN

Jamu dan ekstrak merupakan obat tradisional yang sering digunakan masyarakat

Indonesia. Namun dalam pemakaiannya masyarakat hanya akan tahu khasiat yang

dirasakan dari jamu dan ekstrak tersebut tanpa mengetahui kemungkinan adanya zat-zat

lain yang bersifat racun didalamnya. Bahkan hampir sebagian masyarakat tidak

mengetahui zat aktif apa dari jamu dan ekstrak tersebut yang bisa membuat mereka

terbebas dari penyakit.

Sebagaimana telah disebutkan diatas bahwa tidak semua jamu dan ekstrak cukup

aman untuk dikonsumsi. Kemungkinan masih ada zat-zat racun yang tertinggal di

dalamnya sehingga mungkin menimbulkan efek samping yang cukup signifikan bagi

tubuh. Oleh katrena itu perlu dilakukan suatu analisis yang tepat untuk bisa memisahkan

dan menganalisis senyawa yang terkandung di dalam jamu maupun ekstrak tersebut.

Metode yang biasa dilakukan untuk menganalisis kandungan zat tersebut adalah

kromatografi. Kromatografi merupakan metode pemisahan suatu zat dengan

menggunakan prinsip polaritas. Kromatografi ada beberapa macam, namun yang sering

digunakan dalam analisis kandungan zat adalah kromatografi cair dan lapis tipis.

Kromatografi cair kinerja tinggi dan lapis tipis banyak digunakan karena hasilnya

cukup akurat dan khusus untuk kromatografi lapis tipis dapat dijangkau dengan biaya

yang rendah.

BAB II

URAIAN

I. Jamu dan Ekstrak

I.1. Jamu

Jamu adalah Obat Tradisional Indonesia ( Konsep Pengembangan Obat Asli

Indonesia, Ditjen POM, Dep. Kesehatan RI, 2000 ). Sedangkan pengertian obat

tradisional (OT) adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan

hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dari bahan-bahan tersebut, yang

secara turun temurun telah digunakan untuk obat berdasarkan pengalaman, Obat Asli

Indonesia (OAI) adalah bahan atau ramuan bahan berkhasiat obat yang memiliki

komposisi sepenuhnya adau lebih dari 75% bobotnya terdiri dari bahan tumbuhan, bahan

hewan, bahan mineral atau sediaan sarian (galenik) yang berasal dari alam Indonesia (PP.

No 17 tahun 1986 tentang Kewenangan Pengaturan, Pembinaan, dan Pengembangan

Industri).

Kemanjuran suatu produk jamu akan meningkatkan keberhasilan produk jamu

dalam pemasarannya. Penambahan bahan sintetik merupakan salah satu upaya

meningkatkan kemanjuran suatu produk jamu. Obat-obat analgetik perifer, antipiretik,

vitamin B kompleks dan kortikosteroid sering ditambahkan pada jamu pegal linu, obat

kuat atau penambah nafsu makan. Penambahan bahan sintetik ke dalam sediaan jamu

termasuk salah satu bentuk pemalsuan jamu. Penambahan bahan sintetik ke dalam jamu

tidak dapat dibenarkan karena ditinjau dari aspek posologi dan penandaan kemungkinan

besar sudah tidak sesuai lagi. Penambahan bahan sintetik dalam bahan jamu, merupakan

salah satu bentuk penipuan karena apabila pasien langsung membeli sediaan obat yang

mengandung bahan sintetik tersebut kemungkinan akan mendapatkannya dengan harga

yang lebih murah. Untuk menghindari adanya kerugian pada pihak konsumen akibat

penambahan bahan-bahan sintetik tersebut maka dilakukan analisis kualitatif untuk

mengetahui ada / tidaknya bahan kimia dalam produk jamu. Yang menjadi acuan dalam

analisis adalah Farmakope Indonesia, USP, dan MMI. Analisis kualitatif tersebut dapat

dilakukan dengan bermacam-macam cara, diantaranya: uji dengan spektrum serapan infra

merah atau serapan ultra violet, pengamatan mikroskopik, uji menggunakan

kromatografi lapis tipis, uji identifikasi umum, pemijaran, dan lain-lain.

I.2. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengesktraksi zat aktif dari

simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian

semua atau hamper semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa

diperlakukan sedemikian rupa sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Sebagian

besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku secara perkolasi. Seluruh bagian

perkolat biasanya dipekatkan dengan cara destilasi dengan pengurangan tekanan, agar

bahan utama obat sesedikit mungkin terkena panas.

Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol

sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai keduanya. Jika tidak dinyatakan lain

pada masing-masing monografi, tiap ml ekstrak mengandung bahan aktif dari 1 g

simplisia yang memenuhi syarat. Ekstrak cair cenderung membentuk endapan dapat

didiamkan dan disaring atau bagian yang bening dienaptuangkan. Beningan yang

diperoleh memenuhi persyaratan farmakope.

II. Kromatografi

Definisi kromatografi menurut Farmakope Indonesia IV : kromatografi adalah

suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam

sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara

berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan

perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan,

tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion.

Metode kromatografi dipakai secara luas baik untuk pemisahan analitik dan

preparatif. Kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan

senyawa, sedangkan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi

murni dari campuran.

Pemisahan suatu campuran senyawa dengan metode kromatografi dilakukan

dengan memanfaatkan berbagai sifat fisika dari molekul, antara lain :

1. Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)

2. Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi)

3. Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian)

Prinsip dasar kromatografi adalah mengubah keadaan distribusi statik menjadi

sistem kesetimbangan yang dinamik. Hal ini dilakukan dengan cara menggerakkan satu

fase secara mekanis (fase gerak) relatif terhadap fase yang lainnya (fase diam) dalam

suatu sistem kesetimbangan. Fase gerak dapat berupa zat cair atau gas, sedangkan fase

diam dapat berupa lapisan tipis cairan yang melekat pada penyangga atau permukaan zat

padat yang berfungsi sebagai penyangga. Jika suatu campuran zat A+B dimasukkan

dalam sistem, kedua senyawa akan terdistribusi di antara kedua fase menurut sifat

masing-masing. Senyawa yang memiliki afinitas lebih besar terhadap fase gerak (atau

afinitas yang lebih kecil terhadap fase diam) akan bergerak lebih cepat daripada senyawa

yang memiliki sifat sebaliknya. Perbedaan laju perpindahan ini merupakan dasar dari

semua pemisahan secara kromatografi.

a. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia dengan fasa gerak

(larutan pengembang yang cocok), dan fasa diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada

peyangga berupa pelat gelas atau lapisan yang cocok.

Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil

pengembangan dideteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan

cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling kecil.

Metode kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mendeteksi kemungkinan

adanya pemalsuan dalam sediaan jamu. Selain digunakan untuk pemisahan senyawa,

KLT (kromatografi lapis tipis) juga dapat digunakan untuk identifikasi senyawa.

Parameter utama dalam KLT adalah faktor retardasi (Rf) yaitu perbandingan antara jarak

migrasi sampel dengan jarak migrasi fase gerak, yang dipengaruhi oleh:

1. fase diam: kualitas, keberadaan pengotor, ketidakseragaman ketebalan, aktivasi pelat,

2. fase gerak: kemurnian pelarut,

3. bejana pengembang: ukuran bejana, kuantitas pelarut, kejenuhan,

4. suhu,

5. jarak pengembangan,

6. kuantitas sampel.

Fasa diam (lapisan penjerap)

Jika dilihat dalam sinar jatuh dan sinar lewat, lapisan yang kering mempunyai

wadah yang seragam dan membentuk ikatan yang baik dengan penyangga. Panjang

lapisan 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1 – 0,3 mm,

biasanya 0,2 mm. Contoh umum : silika gel, alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan

turunannya, poliamida, dll.

Fasa gerak

Merupakan medium angkut dan terdiri dari satu/beberapa pelarut. Fasa gerak

bergerak dalam fasa diam karena adanya gaya kapiler. Pada kromatografi penjerap,

pelarut perngembang dapat dikelompokkan ke dalam deret eluotropik berdasarkan efek

elusinya. Efek elusi naik dengan seiring kepolaran pelarut. Misal : heksana nonpolar

mempunyai efek elusi lemah, kloroform cukup kuat dan methanol yang polar efek

elusinya kuat. Tetapan dielektrik juga memberi informasi tentang kepolaran suatu

senyawa.

Bejana pemisah, penjenuhan, aras pengisian

Bejana harus dapat menampung pelat 200x200 mm dan harus tertutup rapat. Aras

pengisian fasa gerak harus 5-8 mm sesuai dengan kedalaman lapisan yang terpendam.

Untuk kromatografi dalam bejana yang jenuh, secarik kertas saring bersih yang lebarnya

18-20 cm dan panjangnya 45 cm ditaruh pada di dinding sebelah dalam bejana berbentuk

U dan dibasahi dengan pelarut pengembang. Kertas saring berfungsi untuk mencegah

terjadinya penguapan dari lapisan fasa diam.

Awal dan jumlah cuplikan

Bercak atau pita ditotolkan pada jarak 15 mm dari tepi bawah lapisan. Jarak suatu

bercak awal berjarak 3-5 mm dari bercak lain dan berjarak sekurang-kurangnya 10 mm

dari tepi. Biasanya ditotolkan 1-10 µl larutan cuplikan 0,1-1%.

Pengembangan

Pengembangan adalah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut

pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal, yaitu jarak

antar garis awal dan garis depan, ialah 10 mm.

Ada bermacam-macam teknik pengembangan, yaitu :

- Pengembangan satu arah

- Pengembangan alir-sinambung

- Pengembangan landaian

- Pengembangan ganda

- Pengembangan dua arah

- Pengembangan lingkar

- Pengembangan carik baji

Larutan pembanding (campuran uji atau baku)

Merupakan campuran yang terdiri dari 1-5 senyawa yang diketahui, dengan

konsentrasi yang diketahui pula. Bila mungkin, senyawa pembanding ini sama dengan

senyawa yang terdapat di dalam larutan cuplikan.

Larutan cuplikan

Merupakan larutan senyawa obat yang akan dianalisis. Jumlah senyawa obat yang

terlarut pada pelarut harus sama dengan yang terdapat pada sediaan.

Deteksi senyawa yang dipisah

Lampu UV untuk eksitasi fluoresensi

Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa itu menunjukkan penyerapan pada daerah

UV gelombang pendek (radiasi utama kira-kira 254 nm) atau jika senyawa dapat

dieksitasi ke fluorosensi radiasi UV gelombang pendek dan/ atau gelombang panjang

(365 nm). Selain itu juga bisa dengan pereaksi semprot dan deteksi biologi..

Penilaian dan dokumentasi kromatogram

Kualitatif : dengan penilaian visual

Hal yang dapat diamati : jarak pengembangan komponen larutan cuplikan (dengan

merujuk pada angka Rf atau hRf pada KLT)

Rf = jarak titik pusat bercak dari titik awal/ jarak garis depan dari titik awal

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua decimal. hRf

adalah angka Rf dikalikan faktor 100(h), menghasilkan nilai berjangka antara 0 dan 100.

Harga Rf tergantung kelembaban atmosfer dan sifat penjerap. Jika hRf lebih

tinggi daripada hRf pada pustaka maka kepolaran pelarut harus dikurangi; jika hRf lebih

rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan.

Kromatografi lapis tipis paling cocok untuk analisis obat di farmasi karena :

- Investasi yang kecil untuk perlengkapan

- Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)

- Analit/cuplikan yang dibutuhkan hanya sedikit ( + 0,1 g)

- Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak

mungkin

- Kebutuhan ruangan minimum

- Penanganannya sederhana

Analisis KLT banyak digunakan karena :

1. Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

2. Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen

utama obat

3. Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian obat.

4. Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis

kombinasi obat dari sediaan herbal.

kromatografi cair kinerja tinggi (kckt)

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor

yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu

sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai

kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom

berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa

partikel kecil (3m hingga 50 m), yang memungkinkan tercapainya keseimbangan

secara cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom partikel kecil ini

memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fasa gerak pada

tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai laju aliran beberapa ml per menit. Oleh

karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20 g)

untuk isi kolom tersebut di atas, maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan

teknologi ini kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang

sangat cepat seperti pada kromatografi gas, dengan keunggulan zat-zat yang tidak

menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya

membuat derivat yang dapat menguap.

Fase diam dapat berupa cairan atau polimer, yang disalut atau terikat secara kimia

pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis, yang mengurangi hambatan terhadap

pemindahan masa, sehingga keseimbangan antara fase gerak dan fase diam dapat tercapai

dengan cepat. Suatu fase diam cair harus mempunyai sifat praktis tak bercampur dengan

fase gerak, umumnya fasa gerak perlu dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase diam cair,

agar fase diam tidak terbawa dari kolom. Fase diam berupa polimer yang disalutkan pada

penyangga umumnya lebih dapat bertahan. Suatu fase diam yang terikat secara kimia

pada penyangga lebih mudah pemakaiannya dengan beraneka ragam pelarut serta suhu

yang lebih tinggi.

Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus

dikendalikan dengan cermat. Komposisi dapat mempunyai pengaruh yang jauh lebih

besar terdadap faktor kapasitas daripada suhu, (faktor kapasitas = k adalah perbandingan

waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang diperlukan

selama berada dalam fase gerak).

Fase gerak haruslah:

- murni, tanpa cemaran

- tidak bereaksi dengan kemasan

- sesuai dengan detektor

- dapat melarutkan cuplikan

- mempunyai viskositas yang rendah

- memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan

- harganya wajar.

Bahan pengisi kolom lainnya dengan diameter yang lebih kecil, antara 3 m

hingga 10 m, hampir seluruhnya berpori dan memberikan pemisahan yang lebih efisien

dari pada partikel pengisi kolom berukuran antara 30 m hingga 50 m. Partikel tersebut

dapat pula dibuat bersifat adsorpsi atau dilapisi dengan suatu fase diam. Dalam hal ini

pengisian ke dalam kolom harus dibuat dalam bentuk bubur untuk mendapatkan efisiensi

kolom yang tinggi, berbeda dengan partikel berukuran antara 30 m hingga 50 m yang

dapat diisikan dalam bentuk kering.

Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan :

1. Kromatografi penukar ion terutama digunakan

untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan

bobot molekul kurang dari 1500. Fase diam pada kromatografi penukar ion umumnya

resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-beda. Pada resin penukar

kation terdapat gugus aktif yang bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk

pemisahan zat-zat bersifat basa, misalnya amina. Sebaliknya pada resin penukar anion

teredapat gugus aktif bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat,

sulfonat atau karboksilat, yang bermuatan negatif. Senyawa larut air yang ionik atau

yang dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin, dan perbedaan dalam

afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. pH fase gerak, suhu,

jenis ion, konsentrasi ionik, dan senyawa organik tertentu yang berfungsi untuk

memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut, dan variabel-variabel

tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang diinginkan.

2. Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan

fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam

non-polar, dikenal sebagai kromatografi fase balik, maka senyawa non-polar yang

larut dalam hidrokarbon, dengan bobot molekul kurang dari 1000, seperti vitamin

larut lemak dan antrakinon, dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap

fase diam. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar

menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. Jika fase

gerak bersifat non polar dan fase diam polar, maka zat yang bersifat polar, seperti

golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Fase gerak yang non-polar dapat

dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar, untuk mengurangi retensi dan

mengubah pemisahan.

3. Beraneka ragam senyawa non ionik dapat

dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi, dengan memilih fase diam dan fase

gerak yang tepat.

Keuntungan KCKT

KCKT mempunyai banyak keuntungan bila dibandingkan dengan kromatografi cair

tradisional, yaitu:

a. cepat

b. daya pisahnya baik

c. peka, detektor unik

d. kolom dapat dipakai kembali

e. ideal untuk molekul besar dan ion

f. mudah memperoleh kembali cuplikan.

Alat

Pada dasarnya alat kromatografi cair terdiri dari :

1. Pompa

Fase gerak dalam KCKT sudah tentu cair, dan untuk menggerakkannya melalui

kolom, diperlukan alat. Ada dua jenis utama pompa, yang digunakan: tekanan-

tetap dan pendesakan-tetap.

2. Injektor

Cuplikan harus dimasukan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan

agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada dua macam teknik utama :

a. Aliran-henti

b. Pelarut mengalir.

Teknik-teknik tersebut dapat dilakukan menggunakan alat suntik atau katup

penyuntik. Untuk teknik penyuntikan dengan alat suntik, dapat digunakan suatu

septum (injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor yang lazim

dipakai pada kromatografi gas) apabila tekanan pada bagian atas kolom kurang

dari 70 atmosfer (lebih kurang 1000 psi). Pada tekanan yang lebih tinggi dapat

digunakan suatu katup penyuntik untuk memasukkan zat uji. Beberapa sistem

katup mempunyai suatu tabung lingkar terkalibrasi yang diisi dengan zat uji, yang

kemudian dipindahkan oleh sistem katup ke dalam arus fase gerak yang mengalir.

Sistem katup lainnya memungkinkan analit dimasukkan ke dalam suatu rongga

dengan menggunakan alat suntik. Rongga yang telah terisi tersebut kemudian oleh

sistem katup dialihkan ke dalam arus bertekanan tinggi. Pada teknik “aliran

berhenti”, aliran kolom dihentikan, dan setelah tekanan pada tempat penyuntikan

turun hingga nol, tempat penyuntikan dibuka dan analit disuntikkan dengan

memakai alat suntik. Kemudian tempat penyuntikan ditutup dan pompa

dijalankan kembali. Tekanan tinggi dengan cepat tercapai kembali dan zone

penyebaran kecil dalam proses ini. Teknik “aliran berhenti” memberikan

keberulangan penyuntikan pada tekanan tinggi yang lebih baik daripada kalau

menggunakan septum. Masalah rusaknya septum oleh berbagai pelarut dengan

demikian juga dapat dihindari.

3. Kolom

Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis

bergantung pada pilihan kolom, dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi

menjadi 2 kelompok:

a. Kolom analitik : diameter 2-6mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan,

untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100cm. Untuk kemasan

mikro partikel berpori biasanya 10-30cm.

b. Kolom preparatif : umumnya berdiameter 6mm atau lebih besar, dan panjang

25-100cm. Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat

Kolom dapat dipanaskan agar dihasilkan pemisahan yang lebih efisien, akan

tetapi suhu di atas 600 jarang digunakan, oleh karena mungkin terjadi penguraian

fase diam ataupun penguapan fase gerak pada suhu yang lebih tinggi tersebut,

terutama dalam kromatografi pertukaran ion dan kromatografi ekslusi. Jika tidak

dinyatakan lain dalam monografi, kolom dipertahankan pada suhu kamar.

4. Detektor

Detektor yang biasa dipakai mencakup :

a. Fotometer ultraviolet raksa tekanan rendah merupakan detektor yang umum

dan stabil, tetapi penggunaannya terbatas pada deteksi bahan yang menyerap

radiasi pada panjang gelombang 254 nm. Batas kepekaan untuk senyawa yang

menyerap cahaya ultraviolet dengan kuat lebih kurang 1 ng. Senyawa yang

tidak menyerap cahaya pada 254 nm secara berarti, dapat diubah menjadi

derivat yang sesuai yang menyerap panjang gelombang ini, sehingga dengan

demikian memperluas ruang lingkup penggunaan detektor panjang gelombang

tunggal tersebut. Ruang lingkup deteksi ultraviolet bertambah luas lagi dengan

pemakain spektrofotometer yang dilengkapi dengan kuvet mikro serta

detektor yang dapat dioperasikan pada panjang gelombang lain.

b. Refraktometer diferensial mendeteksi perbedaan indeks bias pelarut murni dan

indeks bias larutan zat yang diuji dalam pelarut itu. Sekalipun penggunaannya

lebih umum, detektor ini kurang peka, batas deteksinya lebih kurang 1 m

serta peka terhadap perubahan yang kecil dalam kompiosis pelarut, laju aliran

dan suhu, sehingga mungkin perlu dipakai suatu kolom dan aliran fase gerak

pembanding untuk memperoleh garis dasar yang memuaskan.

c. Fluorometer merupakan detektor yang peka untuk senyawa yang dapat

berfluoresensi atau dapat diubah menjadi derivat yang berfluoresensi dengan

jalan perubahan kimia atau dengan reaksi penggabungan dengan pereaksi

yang berfluoresensi pada gugus fungsional yang spesifik. Untuk beberapa

pereaksi, pembuatan derivat dilakukan sebelum pemisahan kromatografi. Pada

pendekatan lain, pereaksi dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dan bereaksi

langsung dengan analit secara in situ, dan derivat yang diukur oleh detektor.

Pada umumnya, sinyal yang berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu

sebelum disampaikan pada alat perekam otomatik yang sesuai, biasanya berupa suatu

perekam potensiometrik; dalam hal ini sinyal merupakan fungsi dari waktu. Dapat pula

sinyal dikirimkan kepada suatu integrator digital elektronik untuk mengukur luas puncak

kromatogram secara otomatik.

5. Elusi landaian

Elusi landaian ialah peningkatan kekuatan fase gerak selama analisis

kromatografi. Hasil elusi landaian ialah perpendekan waktu lambat senyawa yang

ditahan dengan kuat dalam kolom. Elusi landaian mempunyai beberapa

keuntungan:

a. Waktu analisis keseluruhan dapat dikurangi secara berarit

b. Daya pisah keseluruhan per satuan waktu campuran ditingkatkan

c. Bentuk puncak diperbaiki (pembentukan ekor lebih kecil)

d. Kepekaan efektif ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam

Prinsip kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Bagan kerja instrumen KCKT

Instrumen KCKT

Kromatografi Lapis Tipis Dalam Analisis Jamu Dan Ekstrak

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan teknik fisikokimia yang sering

digunakan untuk menganalisis bahan-bahan dari tumbuhan obat dan campurannya.

Teknik ini dapat digunakan dalam waktu relatif singkat, hanya memerlukan jumlah analit

dan pelarut yang sedikit dan perlatan yang digunakan relatif murah. Selain itu, kebutuhan

ruang dari pelaksanaan KLT minimum dan mudah dilakukan.

Untuk analisis jamu dan ekstrak dengan KLT, sistem KLT yang sesuai harus

dicari terlebih dahulu. Setelah didapatkan sistem KLT yang sesuai, dilakukan

pelaksanaan analisis dengan KLT yang meliputi penyiapan adsorben, penjenuhan bejana

kromatografi, penotolan larutan uji dan larutan pembanding, pengembangan

kromatogram, dan pengamatan serta interpretasi kromatogram.

Untuk mengamati kromatogram yang dihasilkan, dapat dilakukan dengan

dokumentasi foto hasil pewarnaan lempeng kromatografi dengan pereaksi yang sesuai

atau dengan melihat kromatogram hasil perekaman menggunakan instrumen densitometer

(TLC – scanner). Perekaman dapat dilakukan secara absorbsi-refleksi pada panjang

gelmombang 256nm, 365nm, dan 415 nm atau pada panjang gelombang lain yang

spesifik untuk suatu komponen yang telah diketahui. Apabila bercak yang dihasilkan oleh

larutan uji berbeda dengan pembanding maka bercak khas itu diisolasi untuk identifikasi

lebih lanjut menggunakan alat yang dapat mengidentifikasi struktur seperti nuclear

magnetic resonance (NMR).

Penentuan kadar dapat dilakukan dengan spektrofotometri UV. Pita zat yang

terbentuk dikerok dan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai kemudia disaring untuk

memisahkan zat identitas dengan fasa diam. Setelah itu, sampel dan pembanding diukur

pada panjang gelombang maksimum zat identitas sehingga diperoleh absrorbansi.

Penentuan kadar dapat juga dilakukan dengan spektrofotodensitometer. Bercak zat

identitas sampel dan pembanding diukur pada panjang gelombang maksimum zat

identitas. Bercak yang terbentuk tidak boleh rusak oleh penampak bercak. Dari

pengukuran akan didapat luas area dibawah puncak dan absorbansi.

Contoh prosedur pemisahan pada rimpang Costus speciosus Smith.

Timbang 600 mg serbuk rimpang dengan 5 mL metanol P dan panaskan di atas

tangas air selama 2 menit, dinginkan dan saring. Cuci endapan dengan metanol P

secukupnya sehingga diperoleh 5 mL filtrat. Pada titik pertama, kedua dan ketiga

lempeng KLT, totolkan masing-masing sebanyak 40 uL filtrat. Pada titik keempat

totolkan 5 uL zat warna I LP. Eluasi dengan dikloroetana P dengan jarak rambat 15 cm.

Keringkan lempeng tersebut di udara selama 10 menit, eluasi kembali dengan toluena P

dengan arah eluasi dan jarak rambat yang sama. Amati dengan sinar biasa dan dengan

sinar ultra violet 366 nm. Selanjutnya semprot dengan reaksi anisaldehid-asam sulfat LP,

panaskan pada suhu 1100C selama 10 menit. Amati lagi dengan sinar biasa dan sinar

ultraviolet 366 nm. Dengan perlakuan yang sama seperti cara kerja di atas dilakukan juga

penyemprotan dengan pereaksi AlCl3 LP. Pada kromatogram tampak bercak-bercak

dengan warna dan hRx sebagai berikut :

No. hRx Dengan sinar biasa Dengan sinar UV 366 nm

Tanpa

pereaksi

Dengan pereaksi Tanpa

pereaksi

Dengan pereaksi

I II I II

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

7-12

19-25

28-31

39-43

47-51

89-94

131-137

-

-

-

-

-

-

-

Violet

Violet

Violet

Violet

Violet

Violet

Violet

-

-

-

-

-

-

-

-

Ungu

-

-

-

-

-

Ungu

Ungu

biru

Ungu

ungu

ungu

ungu

-

Ungu

-

-

-

-

-

Catatan : harga Rx dihitung terhadap bercak warna merah (yang diamati dengan sinar

biasa atau warna ungu dengan sinar uv 366 nm).

hRf bercak warna merah =65

Tanda I = pereaksi anisaldehid-asam sulfat LP.

II= pereaksi AlCl3 LP.

Zingiber officinale

larutan uji. Tambahkan 5 mL metanol R ke dalam 1 g serbuk obat (710). Kocok

selama 15 menit, kemudian saring.

Larutan pembanding. Larutkan 10µL citral R dan 10 mg resorcinol R dalam 10

mL metanol R. siapkan larutan segera sebelum akan digunakan.

Totolkan masing-masing sebanyak 20µL larutan pada plat dalam bentuk pita.

Develop over a path of 15 cm di dalam chamber kromatografi yang tidak jenuh

menggunakan campuran 40 bagian volume heksana R dan 60 bagian volume eter R.

biarkan lat mengering di udara. Semprot plat dengan menggunakan 10 g/L campuran

vanilin R dalam asam sulfat R dan periksa di bawah cahaya matahari selama pemanasan

pada suhu 100-1050C selama 10 menit. Kromatogram yang didapatkan dari larutan

pembanding menunjukkan intensitas daerah merah (resorsinol) yang kuat di setengah

bagian bawah dan di setengah bagian atas terdapat dua daerah violet (sitral).

Kromatogram yang didapatkan dari larutan uji menunjukkan bahwa di bawah zona

resorsinol pada kromatogram yang didapatkan dari larutan pembanding, terdapat dua

zona violet (gingerol) yang intensitasnya kuat dan di bagian tengah, antara zona

resorsinol dan zona sitrol pada kromatogram yang didapatkan dari larutan pembanding,

terdapat dua zona violet (shogaol) yang intensitasnya lemah. Mungkin juga terdapat zona

lain.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Analisis Jamu Dan Ekstrak

Baik jamu maupun ekstrak, keduanya mengandung banyak komponen.

Komponen-komponen tersebut ada yang terdapat dalam jumlah besar (mayor) ada pula

yang terdapat dalam jumlah kecil (minor). Komponen-komponen tersebut berada dalam

tingkat kepolaran yang berbeda, ada yang bersifat polar, nonplora maupun semipolar.

Oleh sebab itu analisis jamu dan ekstrak dengan kromatografi cair kinerja tinggi harus

dilakukan dengan elusi gradien.

Sistem deteksi yang biasa digunakan adalah UV-Visibel, fluorometri dan indeks

bias (refraktometri). dengan spektrofotometer, alat merekam pada panjang gelombang

tertentu. Pada panjang gelombang tersebut, pelarut sedikit atau sama sekali tidak

menyerap sinar sedangkan analit mampu menyerap dengan kuat. Deteksi secara

spektrofluororesensi digunakan jika dibutuhkan pola kromatogram yang selektif dan

khusus pada golongan kandungan kimia. Refraktometri dapat digunakan apabila indeks

bias pelarut dan indeks bias analit berbeda. Refraktometer diferensial mengukur

perbedaan antara indeks bias cuplikan pelarut pengelusi yang murni dan indeks bias

pelarut yang keluar dari kolom. Akan tetapi, refraktometer tidak dapat digunakan apabila

sistem menggunakan elusi gradien karena adanya perbedaan komposisi pelarut.

Contoh pemisahan Kurkuminoid pada Curcuma domestica Vahl. ( rimpang

kunyit)

Degradasi ini dapat diamati dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi pada

kolom nucleosil-NH2 dengan fasa gerak etanol 96% pada pH alkalis dengan masa

inkubasi 5 menit dan 28jam (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Reaksi degradasi kurkumin

dalam suasana basa dapat dilihat pada gambar dibawah, sedangkan kromatogram KCKT

yang mengamati peristiwa tersebut dapat dilihat pada gambar (dibawah).

Dengan memperhatikan hal tersebut warna merah kurkumin dalam suasana basa

dapat dipastikan mempunyai kestabilan yang rendah dan perlu dipertimbangkan dalam

penggunaannya.

Sifat kurkuminoid lain yang penting adalah sensitifitasnya terhadap cahaya. Bila

kurkumin terkena cahaya akan terjadi dekomposisi struktur berupa siklisasi kurkumin

atau terjadi degradasi struktur (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Rangkaian reaksi

dekomposisi struktur ini dapat dilihat pada gambar dibawah.

Peristiwa degradasi kurkuminoid oleh cahaya ini dibuktikan oleh sidik (1985)

yang melakukan penelitian penetapan kadar kurkuminoid pada rimpang temulawak yang

dikeringkan dengan sinar matahari langsung dan yang dikeringkan tanpa pemanasan sinar

matahari langsung. Rimpang yang dikeringkan dibawah sinar matahari langsung

berwarna lebih gelap dibandingkan dengan rimpang yang dikeringkan tanpa sinar

matahari yang warnanya kuning terang. Penelitian ini menunjukkan bahwa kadar

kurkumnoid rimpang yang dikeringkan dengan sinar matahari langsung lebih kecil

daripada rimpang yang dikeringkan tanpa sinar matahari. Sifatnya fotosensitif ini,

memungkinkan penggunaan kurkuminoid sebagai stabilisator bagi senyawa-senyawa

yang fotosensitif.

BAB III

RINGKASAN

Jamu dan ekstrak merupakan obat tradisional yang banyak digunakan di

Indonesia, sehingga disebut sebagai obat asli Indonesia. Jamu dan ekstrak dianggap

sebagai obat yang berkhasiat dan tidak memiliki efek samping. Namun hal itu sangat

diragukan kebenarannya, tidak semua jamu dan ekstrak merupakan obat berkhasiat,

karena kandungan zat yang ada di dalamnya tidak semua memiliki efek menyembuhkan,

tapi mungkin saja efek yang berbahaya yang bisa menyebabkan kematian. Oleh karena

itu perlu adanya suatu metode analisis yang harus dilakukan untuk mengidentifikasi dan

memisahkan kandungan yang terdapat dalam jamu dan ekstrak tersebut, sehingga dapat

dipisahkan mana yang bermanfaat dan mana yang berbahaya. Metode analisis yang biasa

digunakan adalah kromatografi, kromatografi merupakan metode analisis yang

didasarkan pada kepolaran zat.

Kromatografi banyak digunakan dalam metode analisis baik itu dalam

identifikasi zat maupun pemisahan zat. Hal ini dikarenakan hasilnya cukup akurat dan

mudah dilakukan. Kromatografi ada berbagai macam, namun yang banyak digunakan

adalah KCKT dan KLT.

Analisis jamu dan ekstrak dengan menggunakan KCKT dan KLT

I. DAFTAR PUSTAKA

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Direktorat Jenderal Pengawasan

Obat dan Makanan. 1999. Peraturan perundang-undangan obat

tradisional. Jakarta : Departemen Kesehatan RI.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Direktorat Jenderal Pengawasan

Obat dan Makanan. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi 4. Jakarta :

Departemen Kesehatan RI.

_____. Farmakope Indonesia. Edisi ketiga. 1979. Departemen Kesehatan

Republik Indonesia.

_____. Farmakope Indonesia. Edisi IV. 1995. Departemen Kesehatan

Republik Indonesia.

Materia Medika Indonesia. Jilid IV. 1980. Depkes RI. Hal.144-147

Sidik,dkk. 1985. Seri pustaka Tanaman Obat:Temulawak.Phyto

Medica.hal.29-31.

Materia Medika Indonesia. Jilid V. 1989. Depkes RI. Hal 163. Jakarta : Dirjen

BPOM.