BAB IPENDAHULUAN

1.1. Tujuan Percobaan PraktikumPemisahan senyawa dengan metode hight performance liquid chromatografy (HPLC).

1.2. Prinsip Kerja HPLCHPLC menggunakan kolom yang mengandung partikel-partikel kecil-kecil dari fase tetap dank arena luas permukaan yang lebih besar dari fase tetap maka sampel dalam HPLC terpisah dengan sangat baik dengan efisiensi yang tinggi. Mekanisme pemisahan yang berbeda dengan cepat dilakukan mengikatkan gugus-gugus kimia yang berbeda pada permukaan partikel silika yang disebut denganfase terikat. Secara teoritis HPLC itu identik dengan Liquid Solid Choromatografy. Liquid Choromatografy dan ion excange Choromatografy.

1.3. Landasan Teori1.3.1. ULTRAFILTRASI ALIRAN SILANG UNTUK PEMURNIAN GULA STEVIA.

PENDAHULUAN

Industri makanan, minuman, dan suplemen sering menggunakan pemanis sebagai penambah cita rasa pada produknya. Bahan pemanis alami yang biasa digunakan adalah gula sukrosa atau gula tebu. Namun gula tersebut memiliki beberapa kelemahan yaitu memiliki nilai kalori tinggi yang dapat menyebabkan kegemukan dan diabetes. Salah satu alternatif pemanis alami yang memiliki tingkat kemanisan yang tinggi, rendah kalori dan tidak bersifat karsinogenik adalah gula stevia dari daun tanaman stevia. Gula stevia dapat diperoleh secara ekstraksi dari daun stevia menggunakan metanol, etanol, atau spiritus. Pelarut ini dikhawatirkan masih tersisa pada produk. Untuk itu dicari pelarut polar yang lebih aman.Pemurnian gula stevia umumnya dilakukan menggunakan proses pertukaran ion, kromatografi, fixed-bed reaktor menggunakan zeolite atau adsorben (Mantovaneli et al., 2004). Sebelum pemurnian dilakukan, penghilangan ion1990). Proses tersebut cukup kompleks dan menggunakan banyak bahan kimia dan menghasilkan residu, sehingga perlu dilakukan modifikasi proses yang dapat mengurangi penggunaan bahan kimia dan residu. Proses membran filtrasi dapat memisahkan kotoran bukan gula dari larutan stevia tanpa menggunakan bahan kimia. Penggunaan umpan aliran diharapkan akan menekan efek fouling dan polarisasi konsentrasi sehingga dapat meningkatkan fluksi.

Pada penelitian ini pemurnian ekstrak daun stevia menggunakan ultrafiltrasi aliran silang. Parameter tekanan transmembran dan laju alir terbaik diamati untuk mendapatkan larutan stevia dengan fluksi dan tingkat kejernihan tertinggi serta kehilangan (loss) steviosida terendah.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat alat yang digunakan adalah oven, kipas, waterbath, gelas piala, termometer, saringan 65 mesh, timbangan analitik, cawan porselen, desikator, spektrofotometer UV (Thermospectronic V4.60), gelas ukur, labu takar, pipet mohr, penangas, vortex, modul membran ultrafiltrasi yang berbentuk hollow fiber dan HPLC (Waters, USA) dengan kolom yang digunakan adalah NH2-10, fasa gerak yang terdiri atas campuran 76% acetonitril dan 24% air dan kecepatan 1,5 mL/menit.

Bahan utama yang digunakan adalah daun stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) dari Perkebunan Ciomas, air destilata pH 7, membran polyethersulfone (PES) MWCO 20 kDa. Bahan analisa antara lain fenol 5%, H2SO4 P.A dan NaOH 0,1%.

Persiapan Bahan BakuPengeringan Daun Stevia

Daun stevia basah dikeringkan pada suhu 60, 80 dan 100oC hingga mencapai kadar air 10%. Bahan selanjutnya dikemas di dalam plastik, lalu disimpan pada suhu 4oC.

Ekstraksi Stevia

Daun stevia diekstraksi dengan pelarut air (pH 7). Untuk pemilihan suhu ekstraksi, masing-masing daun bubuk kering ditimbang sebanyak 1 g dalam 20 mL air. Proses ekstraksi dilakukan dengan metode Food Sanitation Association Food Research Laboratory (Zairisman, 1985). Pada larutan hasil ekstraksi stevia dilakukan pengukuran kadar steviosida dan kadar gula.

Daun stevia yang telah dikeringkan ditimbang sebanyak 50 g dan 80 g, dilarutkan dalam 1000 mL dan 1600 mL air kemudian dipanaskan di dalam waterbath dengan suhu 100oC selama 1 jam. Campuran ini disaring dengan kertas saring Whatman ukuran 42. Filtrat dipisahkan dan residu dicuci dengan air panas beberapa kali, kemudian filtrat dan air cucian dicampurkan. Konsentrasi kejernihan steviosida pada hasil ekstraksi diukur menggunakan spektrofotometer (= 210 nm). Selanjutnya dilakukan pemurnian larutan.

Pemurnian Larutan Stevia

Pada ultrafiltrasi diamati nilai fluksi permeat dan rejeksi dengan parameter tekanan transmembran, kecepatan alir (kecepatan crossflow) dan konsentrasi umpan (konsentrasi steviosida dalam larutan stevia).

Penentuan Fluksi Air

Penentuan fluksi air bertujuan untuk mengetahui kondisi membran baik sebelum dan setelah digunakan. Air disirkulasikan selama 30 menit pada suhu 40oC dengan tekanan transmembran 1,87 bar dan kecepatan alir 0,04 m/detik. Fluksi dapat dihitung dengan perhitungan:

Penentuan Kondisi Tunak Fluksi Larutan Stevia

Larutan stevia disirkulasi pada ultrafiltrasi. selama 30 menit hingga dicapai keadaan tunak. Kondisi tunak diamati pada tekanan transmembran 1,23 bar, kecepatan alir 0,02 m/detik, konsentrasi larutan umpan stevia 28,7 g/L pada suhu 40oC.

Pengaruh Variabel Operasi Terhadap Fluksi

Kondisi proses diamati pada tekanan transmembran 1,49; 1,61; 1,65 dan 1,87 bar dengan kecepatan alir antara 0,029-0,02 m/detik, serta konsentrasi larutan stevia sebesar 20,4 dan 28,7 g/L. Persentase tahanan membran dan kenaikan umpan dihitung dengan rumus di bawah ini:

Analisis Karakteristik Larutan Steviosida

Karakteristik larutan steviosida meliputi nilai pH (AOAC, 1984), konsentrasi steviosida (Nikolova et al., 1994), kadar gula total (AOAC, 1984), persen kejernihan (%T) (AOAC, 1984), kadar abu (AOAC, 1984) dan analisa larutan stevia dengan

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Zairisman, 1985).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Persiapan Bahan Baku

Pengeringan stevia bertujuan untuk menurunkan kadar air, sehingga mikroorganisme, kapang serta enzim tidak berkembang. Hubungan kadar air dengan suhu pengeringan ditunjukkan pada Gambar 1. Pada Gambar 1 terlihat bahwa proses pengeringan daun berlangsung dengan cepat seiring meningkatnya suhu pengeringan. Hal ini disebabkan karena dengan meningkatnya suhu maka penguapan air dalam bahan akan lebih cepat. Kadar air pada daun diharapkan maksimum 10%. Pada ketiga suhu pengeringan dapat dicapai kadar air di bawah 10% dalam waktu yang berbeda. Kadar air terendah yang dicapai pada pengeringan 60oC sebesar 5,5% diperoleh pada jam ke- 3,5. Sedangkan untuk pengeringan pada suhu 80 dan 100oC diperoleh kadar 3,13 dan 7,34% dalam waktu 2,5 dan 2 jam. Semakin rendah kadar air daun stevia kering

menunjukkan daya simpan dan kerusakan akibat aktifitas serangga, jamur, dan enzim semakin kecil.

Gambar 1. Penurunan kadar air daun stevia selama pengeringan

Perlakuan suhu pengeringan turut mempengaruhi penampakan daun kering yang dihasilkan. Pada suhu 60oC warna daun masih hijau sedangkan pengeringan di atas 60oC menyebabkan daun menjadi coklat. Hal ini sesuai dengan pengamatan Atmawinata (1986) yang menghasilkan warna daun hijau kecoklatan pada suhu di atas 80oC. Perubahan warna ini diakibatkan terjadinya reaksi maillard yaitu reaksi antara gula pereduksi dengan asam amino. Kemungkinan lain adalah terbentuknya senyawa pheophytin akibat reaksi antara klorofil dengan semua asam yang menguap pada waktu proses pengeringan. Untuk mendapatkan daun kering yang berkadar air rendah, kadar steviosida tidak berubah dan masih berwarna hijau dan maka dipilih suhu 60oC.

Ekstraksi stevia dilakukan menggunakan air yang bersifat polar seperti senyawa glikosida. Pada fase ini, gula molekul yang lebih besar serta protein akan terhidrolisis. Filtrat yang diperoleh berwarna coklat kemerahan. Warna ini diperkirakan berasal dari senyawa bukan gula yang terkandung pada daun stevia (Tabel 1) seperti klorofil, alkaloid, tanin, steroid, flavonoid dan makromolekul yang larut dalam air.

Kandungan fitokimia daun stevia terbesar adalah glikosida, steroid n tannin. Cramer dan Ikan (1986) menyatakan bahwa daun tanaman stevia rebaudiana mengandung campuran dari diterpen, triterpen, tanin, stigmasterol, minyak yang mudah menguap dan delapan senyawa manis diterpen glikosida. Delapan glikosida diterpen yang menyebabkan daun tersebut terasa manis, yaitu steviosida, steviolbiosida, rebaudiosida A E dan dulkosida A. Selain itu juga stevia mengandung protein, karbohidrat, fosfor, besi, kalsium, potasium, sodium, flavonoid, zinc (Seng), vitamin C dan vitamin A (Elkins, 1997). Hasil fitokimia daun stevia di atas (Tabel 1) menunjukkan kandungan glikosida yang positif kuat sekali, hal ini mengindikasikan bahwa daun stevia yang di gunakan dalam penelitian ini memiliki tingkat kemanisan yang tinggi

Hasil pengukuran kadar steviosida untuk ketiga jenis bahan baku kering pada berbagai suhu ekstraksi ditunjukkan pada Gambar 2. Sedangkan kadar gula total untuk berbagai kondisi ekstraksi ditunjukkan pada Gambar 3.

Pada Gambar 2 dan 3 dapat diketahui bahwa konsentrasi steviosida dan kadar gula tertinggi diperoleh pada suhu ekstraksi 100oC dan suhu pengeringan 60oC masing-masing sebesar 8,9 g/L dan 2,48 g/L.

Penentuan Waktu Tunak Fluksi Larutan SteviaKonsentrasi umpan yang digunakan untuk mengetahui kondisi tunak pada konsentrasi steviosida dalam larutan stevia adalah 28,7 g/L (Gambar 5). Kondisi tunak larutan stevia tercapai dengan cepat pada menit ke-10 dengan nilai fluksi25,50 L/m2.jam (Gambar 5). Waktu ketika fluksi mulai mengalami kondisi tunak dapat digunakan untuk mengetahui pengaruh ketiga peubah yang akan diamati.

Pengaruh Variabel Operasi Terhadap FluksiFluksi aliran stevia dipengaruhi olehtekanan transmembran, konsentrasi umpan dan kecepatan alir. Semakin tinggi tekanan transmembran (Gambar 6) dan kecepatan alir (Gambar 7) maka fluksi yang dihasilkan semakin meningkat. Sedangkan semakin tinggi konsentrasi umpan maka fluksi semakin rendah (Gambar 6, 7 dan 8).

Widoretno (2005) menyatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi dalam umpan dapat meningkatkan viskositas pada permukaan membran sehingga dapat mengurangi daya difusi larutan melewati membran. Nilai fluksi tertinggi diperoleh pada konsentrasi umpan 20,4 g/L, tekanan 1,87 bar dan kecepatan alir 0,02 m/detik sebesar 60,00L/m2.jam. Namun pada titik kecepatan alir 0,011 m/detik (Gambar 7) dan 0,02 m/detik (Gambar 6) pada konsentrasi umpan 0,02 m/detik dan tekanan 1,06 psi.

Gambar 4. Hubungan antara lama filtrasi dengan fluksi pada air destilata pada tekanan 1,87 bar, kecepatan alir 0,04 m/detik.

Gambar 5. Hubungan antara lama filtrasi larutan stevia dengan fluksi pada tekanan 1,23 bar, konsentrasi umpan 28,7 g/L dan kecepatan 0,02 m/detik

Hal itu disebabkan semakin banyak partikelpartikel besar dipermukaan membran yang dapat digeser sedangkan partikelpartikel yang memiliki ukuran lebih kecil atau mendekati ukuran pori membran akan lebih cepat menimbulkan penyumbatan daripada partikel yang lebih besar. Hal tersebut yang dapat menyebabkan terjadinya fouling dan penurunan fluksi. Tingkat rejeksi larutan stevia antara 36,769,3% (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa pemanis stevia yang memiliki bobot molekul senyawa pemanis stevia berkisar 318,44 804,90 (lebih kecil dari ukuran membran yang digunakan untuk 20 kDa) masih ada yang tertahan oleh membrane.Hasil ini menunjukkan bahwa membran ultrafiltrasi masih kurang optimal untuk meloloskanpemanis stevia. Pada larutan umpan diduga masih terdapat partikelpartikel terlarut yang memiliki bobot molekul yang lebih besar sehingga telah terakumulasi di atas permukaan membran. Molekul gula yang tertahan oleh membran dapat disebabkan karena telah terjadi polarisasi konsentrasi sehingga molekul stevia sukar lolos dari membran.

Kenaikan konsentrasi steviosida pada larutan retentat adalah sekitar 4,3 6,6%. Semakin tinggi konsentrasi umpan, semakin banyak pula partikel terlarut yang dapat menghalangi laju difusi larutan ke membran sehingga produk yang diinginkan sulit lolos melewati membran. Hubungan antara konsentrasi larutan dan tekanan transmembran disajikan pada Tabel 3.

Analisis Karakteristik Larutan SteviaKarakteristik larutan steviosida dipengaruhioleh konsentrasi steviosida pada larutan, tekanan dan kecepatan alir umpan. Pengaruh konsentrasi steviosida pada larutan, tekanan dan kecepatan alir umpan disajikan pada Tabel 4 dan 5.Semakin tinggi konsentrasi, tekanan dan kecepatan alir maka nilai pH akan semakin meningkat. pH larutan stevia setelah filtrasi tidak berubah secara signifikan yaitu berkisar antara 5,35 5,79 Anonim (2004) menyatakan bahwa pemanis stevia tidak akan berubah jika dipanaskan pada suhu 100oC selama 1 jam dan stabil pada pH 3pH9.Hasil pH ini dikarenakan tidak adanya perlakuan kimiawi selama proses filtrasi.Konsentrasi steviosida setelah difiltrasi dengan membrane mengalami penurunan pada konsentrasi 20,4 g/L sebesar 37%-62%, sedangkan konsentrasi 28,7 penurunannya sebesar 65%73%.Steviosida juga dapat tertahan oleh membran bersama partikel besar lainnya, walaupun memiliki ukuran lebih kecil dari pori membran. Penggunaan tekanan dan laju alir yang besar dapat meningkatkan steviosida yang lolos melewati membran.Kadar gula total pada tiap tekanan menunjukkan kecenderungan naik namun jumlah yang dihasilkan sedikit dibandingkan dengan steviosida. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemanisan larutan stevia tidak ditentukan oleh kandungan gula di dalamnya.

Persen kejernihan (%T) pada larutan ekstrak daun stevia menunjukkan bahwa membran ultrafiltrasi mampu memisahkan pengotor-pengotor yang menyebabkan warna dari hasil ekstrak daun stevia. Semakin tinggi persen kejernihan (%T), maka semakin banyak kotoran-kotoran yang tersaring oleh membran. Hal ini tampak pada semakin besar % kejernihan maka % kadar abu semakin rendah. Sedang semakin tinggi tekanan maka persen kejernihan pada permeat semakin tinggi. Persen kejernihan meningkat sebesar 64% pada tekanan 1,87 bar. Sedangkan semakin tinggi kecepatan alir, maka persen kejernihan semakin rendah. Peningkatan persen kejernihan tampak pada kecepatan alir rendah (0,0029 m/detik) sebesar 60%.Larutan ekstrak daun stevia sebelum difiltrasi memiliki kadar abu yang tinggi yaitu sebesar (0,073%). Semakin besar tekanan dan kecepatan alir umpan yang diberikan kadar abu yang dihasilkan semakin menurun. Pada Tabel 4 kadar abu pada tekanan 1,87 bar mengalami penurunan sebesar 62% dan pada Tabel 5 terlihat bahwa pada kecepatan alir yang rendah (0,0029 m/detik) terjadi penurunan kadar abu sebesar 59%. Hal itu menunjukkan bahwa pada kecepatan alir yang rendah, proses terakumulasinya abu pada permukaan membran semakin cepat sehingga dapat menyumbat pori-pori membran. Namun secara keseluruhan dapat diketahui bahwa pengotor pada larutan ekstrak daun stevia dapat difiltrasi dengan ultrafiltrasi aliran silang sehingga larutan stevia menjadi lebih jernih.

Analisa larutan stevia dengan High PerformanceLiquid Chromatography (HPLC)

Larutan stevia yang diekstraksi dengan airdestilata sebelum dijernihkan dengan menggunakan membran dianalisa dengan HPLC untuk membuktikan ada tidaknya kandungan steviosida di dalam ekstrak daun stevia menggunakan pelarut air. Larutan ekstrak daun stevia terbukti mengandung senyawa glikosida yang utama yaitu steviosida dan rebaudiosida A. Pada standar steviosida waktu retensinya 3,14 dan standar rebaudiosida A waktu retensinya 5,26. Larutan stevia sebelum jernihkan diketahui adanya steviosida dimana menghasilkan waktu retensi 3,10 (pada puncak kromatogram no. 4) dan 5,20 pada rebaudiosida A (puncak kromatogram no. 8).Larutan stevia setelah dijernihkan diketahui waktu retensi 3,07 yang menunjukkan steviosida (puncak kromatogram no. 5) dan waktu retensi 5,26 menunjukkan rebaudiosida A (puncak kromatogram no. 12). Selain steviosida dan rebaudiosida A masih ada senyawasenyawa lain yang terkandung di dalam larutan stevia karena ada puncak kromatografi selain senyawa tersebut. Hasil analisa HPLC menunjukkan bahwa steviosida yang banyak terkandung di dalam daun stevia. Keberhasilan dalam penjernihan ekstrak daun stevia belum dapat dikatakan berhasil karena standar yang digunakan hanya pemanis stevia yaitu steviosida dan rebaudiosida A, sehingga pengotor yang terkandung di dalam hasil ekstrak daun tidak dapat diketahui.KESIMPULAN DAN SARAN KesimpulanUltrafiltrasi dapat digunakan untuk pemurnian ekstrak Stevia. Penggunaan membran PES (Ukuran pori 20 kDa) serta laju alir silang 0,02 m/detik dan tekanan transmembran 1,87 bar menghasilkan fluksi tertinggi yaitu 60 L/m2.jam, dan tingkat rejeksi (loss) gula steviosida terendah yaitu36%. Pada kondisi ini diperoleh peningkatan kejernihan larutan tertinggi yaitu sebesar 64% dan pengurangan kadar abu 62%.

SaranUntuk memperbaiki proses dalam mengurangi kehilangan gula steviosida maka perlu dilakukan penjernihan gula stevia menggunakan ukuran membran lebih besar dari 20 kDa, mengingat berat molekul steviosida sebesar 804.90

1.3.2. KromatografyKromatografiadalah suatu teknik pemisahanmolekulberdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakandetektoratau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secaraon-line(on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) denganmass spectrometry(GC-MS dan LC-MS),Fourier-transform infrared spectroscopy(GC-FTIR), dandiode-arrayUV-VIS (HPLC-UV-VIS).

1.3.3 Jenis Jenis Kromatography1. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkanionataumolekulyang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya:reverse phase chromatography,High Performance Liquid Chromatography(HPLC),size exclusion chromatography, sertasupercritical fluid chromatography. 2. Reverse phase chromatographyReverse phase chromatographymerupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifathidrofobikserta rendahnyapolaritasfase stasioner yang terikat secara kimia pada padataninertsepertisilika.Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).

3. High performance liquid chromatographyHigh performance liquid chromatography(HPLC) mempunyai prinsip yang mirip denganreverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar. 4. Size exclusion chromatographySize exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengangel permeationataufiltration chromatographybiasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat.Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil.Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori. 5. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, sepertiasam amino,peptida,protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukarankation(cation exchange) dan pertukarananion(anion exchange).Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatannegatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatanpositif.Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom.Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi.Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentukikatan ionikdengan kolom.Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan denganpHdan kekuatan ionik tertentu.Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.

1.3.4. HPLCPerforma tinggi kromatografi cair (atau tekanan tinggi kromatografi cair, HPLC) merupakan teknik kromatografi yang dapat memisahkan campuran senyawa dan digunakan dalam biokimia dan kimia analitik untuk mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran.HPLC biasanya menggunakan berbagai jenis fasa diam, sebuah pompa yang bergerak fase mobile (s) dan analit melalui kolom, dan detektor untuk menyediakan waktu untuk karakteristik retensi analit. Detektor juga dapat memberikan informasi tambahan yang terkait dengan analit, (/ UV Vis yaitu data spektroskopi untuk analit jika demikian dilengkapi). Waktu retensi analit bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut (s) yang digunakan, dan laju alir fase gerak. Ini adalah bentuk kromatografi cair yang memanfaatkan kolom ukuran lebih kecil, media kecil di dalam kolom, dan tinggi tekanan fase gerak.Dengan HPLC, pompa (bukan gravitasi) memberikan tekanan yang lebih tinggi diperlukan untuk memindahkan fase gerak dan analit melalui kolom padat. Kepadatan meningkat timbul dari ukuran partikel yang lebih kecil. Hal ini memungkinkan untuk pemisahan yang lebih baik pada kolom panjang lebih pendek bila dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa.

OperasiSampel yang akan dianalisis diperkenalkan, dalam volume kecil, ke dalam aliran fase gerak. Solusinya bergerak melalui kolom diperlambat oleh kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam yang hadir di dalam kolom. Kecepatan larutan tergantung pada sifat sampel dan pada komposisi dari fase (kolom) stasioner. Waktu di mana suatu elutes sampel tertentu (yang keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap sebagai karakteristik mengidentifikasi sampel yang diberikan. Penggunaan kemasan ukuran partikel yang lebih kecil kolom (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan kecepatan linier memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk meredakan dalam kolom, meningkatkan resolusi kromatogram. Pelarut yang umum digunakan termasuk kombinasi larut air atau cairan berbagai organik (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril). Air mungkin mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen sampel, atau senyawa seperti asam trifluoroacetic yang bertindak sebagai agen ion pasangan.Pemilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung pada sifat dari kolom dan sampel. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada sampel bersama-sama dengan sejumlah uji coba untuk menemukan metode KCKT yang memberikan pemisahan puncak terbaik.

Partition chromatographyKromatografi partisi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. Prinsip koefisien partisi telah diterapkan di kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, fasa gas dan aplikasi cair-cair. Tahun 1952 Hadiah Nobel di bidang kimia telah diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino. Kromatografi partisi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari sebuah "inert" solid matrik pendukung seperti kromatografi kertas, atau mengambil keuntungan dari somecoulombic dan / atau interaksi hidrogen donor dengan dukungan solid. Molekul menyetimbangkan (partisi) antara fase diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Hidrofilik Interaksi Kromatografi (HILIC) dalam HPLC, metode ini memisahkan analit berdasarkan perbedaan kutub. HILIC paling sering menggunakan fase diam terikat kutub dan air non-polar, larut, fase gerak. HPLC partisi telah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan dari memisahkan zat terlarut asam, dasar dan netral dalam kromatogram tunggal.The polar analit berdifusi ke lapisan air yang diam yang terkait dengan fase diam polar dan karena itu ditahan. Retensi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup muatan (elektrostatik) interaksi dan kemampuan hidrogen donor.Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan pelarut lebih hidrofobik cenderung meningkat kali retensi.Juga dikenal sebagai fase normal HPLC (NP-HPLC), atau kromatografi adsorpsi, metode ini memisahkan analit berdasarkan adsorpsi ke kimia permukaan stasioner dan polaritas. Itu adalah salah satu jenis pertama KCKT yang dikembangkan kimiawan. NP-HPLC menggunakan fasa diam polar dan fase, non-polar mobile non-air, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. Perusahaan asosiasi analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Adsorpsi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor-faktor sterik. Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural. Pelarut polar dalam campuran yang cenderung menonaktifkan fase diam dengan membuat lapisan air yang diam terikat pada permukaan fase diam. Perilaku ini agak aneh bagi fasa normal karena sangat murni mekanisme serap (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan).Partisi dan NP-HPLC jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan HPLC fase-terbalik karena kurangnya reproduksibilitas kali retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi alumina silika atau media kromatografi. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase HILIC terikat yang meningkatkan reproduktifitas.

Pemindahan kromatografiPrinsip dasar kromatografi perpindahan adalah:. Sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk kromatografi matriks (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs yang mengikat, dan dengan demikian menggantikan semua molekul dengan afinitas yang lebih rendah. Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi . Dalam mode elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom dalam sempit, puncak Gaussian. Wide pemisahan puncak, sebaiknya data dasar, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran bergerak ke bawah kolom dalam modus elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk bepergian dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. Parameter operasi disesuaikan untuk memaksimalkan pengaruh dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom rendah. Jadi, dua kelemahan untuk kromatografi elusi mode, terutama pada skala preparatif, kompleksitas operasional, karena gradien memompa pelarut, dan throughput yang rendah, karena beban kolom rendah. Kromatografi Pemindahan memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan dalam zona berturut-turut zat murni bukan "puncak". Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom yang diberikan dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi yang lebih tinggi secara signifikan.

Kromatografi Terbalik-fase (RPC)SimakBaca secara fonetikSimakBaca secara fonetikHPLC fasa terbalik (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase stasioner non-polar dan fase, air bergerak agak polar. Satu fase stasioner umum adalah silika yang telah diobati dengan RMe2SiCl, dimana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C18H37 atau C8H17. Dengan fasa diam, waktu retensi lebih lama bagi molekul yang kurang polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. Pada kelompok polar, seperti OH-, NH2-, COO- atau-NH3+ mengurangi retensi seperti yang terintegrasi dengan baik ke dalam air. Sangat molekul besar, bagaimanapun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah pori-pori memasuki fase diam.Retensi waktu meningkat dengan hidrofobik (non-polar) luas permukaan. senyawa rantai Branched mengelusi lebih cepat dari isomer yang berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Demikian pula senyawa organik dengan satu obligasi CC mengelusi kemudian dibandingkan dengan C = C atau ikatan CC-tiga, sebagai ikatan ganda atau tiga lebih pendek dari ikatan-CC tunggal.Kolom fase terbalik cukup sulit untuk kerusakan dibandingkan dengan kolom silika normal, namun banyak kolom fase balik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan dasar air karena ini akan menghancurkan partikel silika yang mendasarinya. Mereka dapat digunakan dengan air asam, tapi kolom tidak boleh terkena asam terlalu lama, karena dapat menimbulkan korosi bagian logam dari peralatan HPLC. RP-HPLC Kolom ini harus dibilas dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk membuang asam sisa atau buffer, dan disimpan dalam komposisi yang sesuai pelarut. Kandungan logam dari kolom HPLC harus disimpan rendah jika kemampuan terbaik untuk zat yang terpisah harus ditahan.

Ukuran-kromatografi eksklusiUkuran-kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai permeasi kromatografi gel atau kromatografi filtrasi gel, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. Ini umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk, akhir langkah "polishing" dari suatu pemurnian. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuartener protein dimurnikan. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul besar seperti protein atau polimer. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil di pori-pori partikel. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori. Oleh karena itu molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat dari molekul yang lebih kecil, yaitu semakin kecil molekul, semakin lama waktu retensi.Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida.

Ion-exchange chromatography (Pertukaran ion kromatograpy).Dalam kromatografi pertukaran ion, retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Ion dari biaya yang sama tidak termasuk. Jenis penukar ion antara lain Polystyrene resin - ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilitas dari rantai. Linkage Tinggi lintas mengurangi swerving, yang meningkatkan waktu equilibrium dan akhirnya meningkatkan selektivitas. Selulosa dan penukar ion dekstran (gel) - ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan biaya rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein. Terkendali-pori kaca atau silika berporiSecara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya yang lebih tinggi dan radius yang lebih kecil.Peningkatan ion counter (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) mengurangi konsentrasi waktu retensi. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sedangkan penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion.Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut: air pemurnian, prakonsentrasi jejak komponen, pertukaran ligan-kromatografi, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi pH kromatografi pertukaran anion karbohidrat dan oligosakarida, dan lain-lain.SimakBaca secara fonetikIsokratik aliran dan elusi gradienSebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak tetap konstan selama prosedur ini disebut isokratik (makna komposisi konstan). Komposisi fase gerak tidak harus tetap konstan. Program gradien mungkin termasuk tiba-tiba "langkah" peningkatan persentase komponen organik, atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda - semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimal dalam waktu minimum. Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter bagian dalam) perubahan - yaitu, puncak mengelusi dalam urutan yang sama. Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau mengubah laju alir. Kekuatan pendorong dalam kromatografi fase terbalik berasal dalam urutan tinggi struktur air. Peran komponen organik dari fase gerak adalah untuk mengurangi urutan tinggi dan dengan demikian mengurangi kekuatan penghambat dari komponen air.

ParametersInternal diameterDiameter internal (ID) dari sebuah kolom HPLC merupakan parameter penting yang mempengaruhi sensitivitas deteksi dan selektivitas pemisahan di elusi gradien. Hal ini juga menentukan jumlah analit yang dapat dimuat ke kolom. Kolom yang lebih besar biasanya terlihat dalam aplikasi industri, seperti pemurnian produk obat untuk digunakan kemudian. Rendah-ID kolom telah meningkatkan kepekaan dan konsumsi pelarut lebih rendah dengan mengorbankan kapasitas beban. ID kolom lebih besar (lebih dari 10 mm) digunakan untuk memurnikan jumlah yang dapat digunakan bahan karena kapasitas muat besar mereka.Kolom Analytical skala (4,6 mm) telah menjadi jenis yang paling umum kolom, meskipun kolom kecil dengan cepat mendapatkan popularitas. Mereka digunakan dalam analisis kuantitatif tradisional sampel dan sering menggunakan detektor UV-Vis absorbansi. Narrow-menanggung kolom (1-2 mm) digunakan untuk aplikasi ketika sensitivitas lebih diinginkan baik dengan khusus-vis detektor UV, deteksi fluoresensi atau dengan metode pendeteksian lainnya seperti spektrometri massa-kromatografi cair kolom kapiler (di bawah 0,3 mm) digunakan hampir secara eksklusif dengan deteksi alternatif cara seperti spektrometri massa. Mereka biasanya terbuat dari kapiler leburan silika, bukan stainless steel tubing yang mempekerjakan lebih besar kolom.

Particle sizeKebanyakan HPLC tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar kecil partikel silika bulat (manik-manik yang sangat kecil). Partikel ini datang dalam berbagai ukuran dengan 5 manik-manik pM yang paling umum.Partikel yang lebih kecil pada umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk optimal meningkatkan kecepatan linier dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel. Partikel yang lebih besar digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm sampai dengan> 30 cm) dan untuk aplikasi non-HPLC seperti ekstraksi padat-fasa.

Ukuran poriFasa diam Banyak berpori untuk memberikan luas permukaan yang lebih besar. Pori-pori kecil memberikan luas permukaan yang lebih besar sedangkan ukuran pori yang lebih besar memiliki kinetika yang lebih baik, terutama untuk analit yang lebih besar. Sebagai contoh, sebuah protein yang hanya sedikit lebih kecil daripada pori mungkin memasuki pori-pori tetapi tidak mudah meninggalkan begitu dalam.

Tekanan PompaPompa bervariasi dalam kapasitas tekanan, tetapi kinerja mereka diukur pada kemampuan mereka untuk menghasilkan laju alir konsisten dan direproduksi. Tekanan dapat mencapai setinggi 40 MPa (6000 lbf/in2), atau sekitar 400 atmosfer. Modern HPLC sistem telah ditingkatkan untuk bekerja pada tekanan jauh lebih tinggi, dan oleh karena itu dapat menggunakan ukuran partikel jauh lebih kecil di kolom (