Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) BAB I PENDAHULUAN

1.1             Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern,  baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik  merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik

1.2 Rumusan Masalah

1.    Pengertian HPLC

2.    Jenis- jenis HPLC

3.    Instrument HPLC

4.    Prinsip kerja HPLC

5.    Aplikasi HPLC

6.    Manfaat Penggunaan HPLC

7.    Kelebihan dan Kekurangan HPLC

1.3 Tujuana.       Mengetahui Pengertian HPLC

b.      Mengetahui Jenis- jenis HPLC

c.       Mengetahui Instrument HPLC

d.      Mengetahui Prinsip kerja HPLC

e.       Mengetahui Aplikasi HPLC

f.       Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC

g.      Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC

BAB II PEMBAHASAN

2.1. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan

dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar merupakan

sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes

melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat

memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan

komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara

luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang,

antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa

perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk

analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa

kiral.

2.2 Jenis- Jenis HPLC

          Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih

polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar

dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC

dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas,

HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada

mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom

dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase

normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%

kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus

hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas

yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak

yang berekor.

 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi

atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-

hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam

yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan

pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan

larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah  atau basa lemah, peranan pH sangat krusial

karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.

Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi

lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies

yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion

dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian

yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi

ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal

digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi

penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau

kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan

retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion

fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik

dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup

dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan

untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam

yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat

melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang

mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul

yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut

dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.

Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia

antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat

spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika

ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai

(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat

digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.3 Instrument HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa,

alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan

fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem

kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

2.3.1 Wadah fase gerak (Reservoir)

          Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu

laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung

fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan

deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak

akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya

terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam

daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi

menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

  Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

  Persyaratan fase gerak HPLC:

1.    Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.2.    Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.3.    Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.4.    Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.5.    Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).6.    Sesuai dengan detector.

  Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a)    HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.b)   HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.     Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’  pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

2.3.2 Pompa

          Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang

umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang

digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan

fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan

harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses

penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari

gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa

dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh

ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

  Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

a)      Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston

mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan

pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya

ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di

ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. 

b)      Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong

yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak

bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c)      Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan

bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000

psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

2.3.3 Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).

  Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :a)   Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhib)   Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi

septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.c)    Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

  Syarat- syarat injektor yang baik : Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin Mudah digunakan Keberulangan tinggi Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

2.3.4 Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom

merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan

solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

  Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom

konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100

μl/menit).

  Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika

digabung dengan spektrometer massa.

  Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom

ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional

dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

  Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika

yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah

polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi

secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan

bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan

karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun

tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-

silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak

dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi

disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

2.3.5 Detektor

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti

detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang

hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor

fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a.    mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;

b.    mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat

kecil;

c.    stabil dalam pengopersiannya;

d.   mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;

e.    signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas

(kisaran dinamis linier);

f.     tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Pendeteksian Jenis Maksimum sensitifitas Peka terhadap kecepatan alirAbsorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak Konduktometri Spesifik 10-8 Ya Spektometri massa Umum 10-10 Tidak elektrokimia Spesifik 10-12 Ya

2.4 Prinsip Kerja HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram

dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan

menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk

sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap

diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih

mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya

melalui proses pelarutan saja.

Diposkan oleh Ramazona Nababan di 05.34 Kirimkan Ini lewat Email BlogThis! Berbagi ke Twitter Berbagi ke Facebook Bagikan ke Pinterest http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt.html

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.

Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.

e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu  tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT. f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat. 

http://paramita-kromatografi.blogspot.co.id/2012/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt_6.html

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan

melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan

cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran.

Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam.

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom

lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka

solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam

dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah

peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan

untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil

pengukuran HPLC.

http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

Pengertian HPLC

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography,

HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai

dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan

perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan

merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat

berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa

mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan

bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram

memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

 

1.      JENIS- JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih

polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non

polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering

kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam

dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai

berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan

kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase

normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar

90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina

terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika

mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga

dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau

fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-

hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase

diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan

pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan

bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial

karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.

Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi

lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya

spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan

suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang

paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.

Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena

sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan

juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak

dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan

kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan

kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan

mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup

dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk

memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut

dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut

yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-

molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini

disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel

fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi

kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.

Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada

kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai

(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang

sangat kompleks.

2.      Beberapa kegunaan dari HPLC :

         HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan

pestisida.

         Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat

dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

         Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

         Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

         Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

         Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

         Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

3.      Aplikasi dalam ilmiah

Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC

denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that

differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang

berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per

sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has

made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology.

Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat

dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk

berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the

detection of single nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal

nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can

give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar

pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi

genetik dalam suatu populasi,  They can also help to identify the genes that cause certain

human diseases.dan  juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang

menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC

adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.

Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:

         Analisis Diazepam dalam darah

Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini

berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC23H27N.

Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi

untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang

demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan

mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian

sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

1.      Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut

merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah

yang tinggi.

         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

         Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

         Kolom dapat digunakan kembali.

         Waktu analisa cukup singkat.

         HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang

tidak stabil.

         Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

         Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

         Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

         Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

         Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3

mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali

dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

2.      Prinsip kerja

Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan

kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC

memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan

antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat

sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan

yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan

pemisahan yang sebaik-baiknya.

 

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui

yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama

halnya dengan kromatografi gas.

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor

disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel

diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari

senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk

beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran

partikel)

         komposisi yang tepat dari pelarut

         temperatur pada kolom

DetektorAda beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang

melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak

mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk

membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

  1.      Perawatan HPLC

Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,

namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum,  kolom yang sering

digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan

fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.

         Stabilitas pH

kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran

harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC

kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan

sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga

dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat

kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu

menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.

         Teknik Stabilitas

Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam

kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari

40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran

dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram

           Eluen

Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran

pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan

mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.

           Penyimpanan Kolom

  Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang

digunakan dalam terakhir analisis.

  Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan,

kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan

mikroba.

  Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan

dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang

terbaik adalah pelarut Asetonitril.

 

Daftar Pustaka

http: / /www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/ kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/

diakses pada tanggal 26 Januari 2011.

http://ilmu-kedokteran.blogspot.com/2007/11/kromatografi.htmldiakses pada tanggal 28 Januari 2011

http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi_cair_berperforma_tinggidiakses pada tanggal 26 Januari 2011

http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10048919diakses pada tanggal 26 Januari 2011

http://www.nestgrp.com/pdf/colcare.pdfdiakses pada tanggal 20 Januari 2011http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/high-performance-liquid-chromatography.html

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

00.49  LANSIDA  60 comments

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerakWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)

 Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. PompaPompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampelSampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diamAda 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak

dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

5. Detektor HPLCDetektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil.3. Stabil dalam pengopersiannya.4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas (g/ml)

Kisaran linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-visFotometer filterSpektrofotometerspektrometer photo-diode array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien

ElektrokimiaKonduktimetriAmperometri

10-8

10-12104

105Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

JENIS HPLCPemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLCDerivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan

menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7)Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang

dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi

dengan UV-VisReagen untuk dapat

dideteksi dengan FluoresenAsam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfat

p-nitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (DNBDI); p-bromofenasil bromida (PBPB)

4-bromometil-7-asetoksikumarin; 4-bromometil-7-metoksikumarin;

Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).

Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA);

Dansil hidrazin

Amin primer Fluoresamino-ftalaldehid (OPA)

Amin primer (1o) dan sekunder (2o)

3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA); N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).

7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil klorida

Asam-asam amino (peptida)

4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)

Fluoresamino-ftalaldehid (OPA)7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

Referensi:1. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for

Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.2. Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography,

4th Ed., John Wiley & Sons, New York.3. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry,

BIOS Scientific Publishers Limited, New York.4. Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC

Press, U.S.A.5. Snyder, L. R.,  Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC

Method Development, John Wiley & Son, New York.

6. Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press, Surabaya.

7. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.