Pertemuan IBiologi Molekuler

Tekhnologi DNA rekombinan

Rafika Sari, M.Farm., AptProdi Farmasi

Universitas Tanjungpura

Substansi1. Definisi

2. Purifikasi DNA3. Enzim2 utk manipulasi DNA

4. Plasmid5. Tehnik DNA rekombinan (kloning)

6. Seleksi sel transgenik7. Produk DNA rekombinan

1. Definisi

DNA rekombinan = Molekul DNA gabungan dari sekuens berbagai spesies yang berbeda

Rekayasa genetika = proses pemindahan gen dari organisme asal ke organisme lain

2. Purifikasi DNA

• melalui ekstraksi DNA (kimia,enzim)

• Terjadi lisis sel• Untuk memisahkan DNA dari

protein-protein sel dilakukan dengan penambahan fenol

• DNA pekat diperoleh dngn penambahan etanol dan penmabahan ribonuklease utk menghIlangkan RNA

3. Enzim2 utk manipulasi DNA

1. Enzim Endonuklease Restriksi- Memotong DNA untai ganda menjadi sekuens

spesifik serta untuk melindungi dari virus bakteri

-Menghasilkan sekuens palindrom “MOM”

2. DNA ligase- Menggabungkan DNA ujung 5’ PO4 dgn ujung 3’OH

Contoh Enzim Restriksi

4. Plasmid

• DNA ekstra kromosom dalam sel bakteri yg dapat bereplikasi sendiri tetapi tidak dapat berintegrasi dalam kromosom

• Mengandung multiple cloning site yg dapat dikenali oleh enzim endonuklease restriksi

5. Tehnik DNA rekombinan (kloning)

Tahapan Rekayasa Genetika

6. Seleksi sel transgenik

1. ditanam dalam media pertumbuhan

2. elektroforesis

Seleksi dengan media pertumbuhan

1. ditanam dalam media pertumbuhan2. elektroforesis

Keterangan gambar

• X-gal merupakan senyawa organik mengandung galaktosa yg dapat dihidrolisis oleh enzim β-galaktosidase dengan memutuskan ikatan β-glikosidik membentuk senyawa berwarna biru

• Sel transgenik akan menjadi tidak berwarna karena Lac-Z telah disisipi gen resisten sehingga sudah tidak berfungsi akibatnya ketika ditumbuhkan pada media yang mengadung ampisislin akan terbntuk koloni yg tidak berwarna

Lanjutan keterangan gambar

• Plasmid sebagai vektor mengandung gen resisten Ampisilin

• Sel-sel yg berhasil ditransformasi dgn gen resisten Ampisilin akan dapat tumbuh pada media agar (medium yg mengandung Ampisilin).

Seleksi dengan elektroforesis

a. Elektroforesis dengan Agarosa

Prinsip kerja Elektroforesis

b.elektroforesis dengan poliakrilamid

7. Produk DNA Rekombinan

1. Gene therapy2. Vaksin3. Antibodi monoklonal4. Homeopoietic Growth factor5. Interleukins n interferon6. Insulin7. Growth hormon

Kuliah IITEKNIK DALAM

REKAYASA GENETIKA

Rafika Sari M.Farm., Apt

Substansi

A. Polymerase Chain ReactionB. Teknik pelacakan molekularC. Teknik sekuensing DNA

A.Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Ditemukan Karry Mullis thn 1993• Proses sintesis enzimatik fragmen DNA secara

invitro• Pelipatgandaan fragmen DNA dilakukan dgn

cepat• Komponen reaksi yg digunakan dlm jumlah

kecil

Tahapan Reaksi yg terjadi dalam PCR

1. Denaturasi, pemisahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal, suhu 94-96 C, selama 1-2 menit

2. Penempelan (annealing), antara primer dgn oligonukleotida pada ujung 3’, suhu 45-60 C, selama 1-2 menit.

3. Perpanjangan (elongasi), sintesis untai DNA baru yg komplementer dgn @DNA cetakan oleh enzim DNA polimerase, suhu 72 C

Komponen2 penting dlm proses PCR

1. DNA cetakan2. Primers3. DNA polimerase4. Larutan buffer5. dNTPs6. Mesin PCR

1.DNA cetakan

• Fragmen DNA yg akan dilipatgandakan• Ukuran DNA cetakan < 1 kb• Hasil amplifikasi efisien 100-400 pb• Stabilitas genetik, jika tidak stabil harus

dilakukan segera setelah selesai isolasi DNA

2.Primers

• Oligonukleotida rantai pendek yg mengawali sintetis rantai DNA

• Umumnya 15-32 pb• Mampu mengenali urutan DNA cetakan yg

akan diamplifikasi• Terdiri dari primer forward (up stream) &

primer reverse (down stream)

Syarat2 primer:

• kandungan GC primer 45-60% ujung 3’ terdiri dari basa G atau C, misalnya:

CCG,CCC,GCG,GGG, atau GCCTIDAK membentuk dimer yg berasal dari

pasangan primer yg komplementerPemilihan suhu annealing yg tepat, rumus :

Tm={(jumlah A+T) x 2 C} + {(jumlah C+G)x 4 C)

Penggunaan primer degenerate

• Merupakan campuran oligonukleotida yg bervariasi dlm hal urutan basa nukleotidanya, tetapi mempunyai panjang atau jumlah nukleotida yg sama

• Utk mengetahui fragmen DNA yg belum banyak diketahui urutan nukelotidanya shgga primer spesifik blm dapat dibuat

• Digunakan utk amplifikasi gen yg blm diketahui urutan nukleotidanya tetapi gen tsb termasuk dlm kelompok famili gen tertentu.

4.DNA polimerase

• Awalnya digunakan fragmen Klenow DNA polimerase I yg telah dihilangkan aktivitas eksonuklease berasal dari E coli

• Kelemahan: tdk tahan panas, laju polimerisasi sedang, kemampuan prosesivitasnya rendah.

• Disimpan suhu -20 C• Aktif mengkatalisis polimerisasi dari ujung 5’

ke 3’

Jenis2 Enzim DNA polimerase

1. Taq DNA polimerase Enzim Termostabil yg diisolasi dari bakteri

termofilik yaitu Thermus aquaticus sumber air panas (TaqDNA polymerase), laju polimerisasi tinggi, tahan panas.

konsentrasi penggunaan 1-2 unit per 50-100μl reaksi

2. Vent DNA polimerase berasal dari bakteri yg hidup pada turbin kapal

selam

3. Tth DNA polimerasediisolasi dari Thermus thermophillus HB8

4. Pwo DNA polimerasediisolasi dari archaebakteri hiperthermofilik Pyrococcus woesei.

5. Pfu DNA polimerasediisolasi dari Pyrococcus furiosis

6.Tli DNA polimerasediisolasi dari Thermococcus litoralis

4.Larutan buffer

• Menentukan proses denaturasi, penempelan primer, aktivitas enzim, ketelitian reaksi, & spesifitas produk PCR

• Konsentrasi 10-50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 suhu 200C

• Perlu penambahan 1,5 mM MgCl25. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTPs)

Terdiri dari dATP, dTTP, dCTP, & dGTP dgn pH 7,0 dan konsentrasi 20-200μM

Jenis2 PCR

1. Nested PCR2. Multiplex PCR, 3. Quantitative PCR (Q-PCR)4. Reverse transcription PCR5. Real Time PCR

Nested PCR

• mengurangi amplifikasi fragmen DNA NONSPESIFIK

• Menggunakan 2 set primer pada 2 siklus PCR secara berturut-turut

• Sensitifitas dan spesifitas tinggi• Resiko kontaminasi besar

Multiplex PCR,

• Menggunakan beberapa pasangan primer yg spesifik dlm 1 reaksi PCR

• Memungkinkan beberapa penentuan gen dlm 1 kali proses, sehingga efektifitas dan efisiensinya tinggi

• Resiko kesalahan penempelan primer sangat tinggi, sehingga terbentuk amplikon non spesifik

• Memerlukan pengaturan suhu yg tepat karena tiap primer memiliki suhu annealing yg berbeda

Reverse transcription PCR (RT-PCR)

• Dilakukan trhdp molekul RNA hasil transkripsi dlm jumlah yg sangat sedikit dlm sel

• Oleh karena PCR tdk dapat digunakan utk molekul RNA maka digunakan bantuan enzim reverse transkriptase utk mengubah mRNA menjd cDNA sebagai cetakan (template)

Quantitative PCR (Q-PCR)/Real Time PCR

• is a form of (PCR) in which data are collected in real-time as the reaction proceeds. Continuous data collection enables one of the principal applications of real-time PCR, target quantitation.

• Real-time PCR is a PCR reaction set in a way that the amount of amplified product is measured after every cycle.

B.Teknik pelacakan molekular

• Teknik utk identifikasi senyawa makromolekul meliputi DNA, RNA, & protein

• Terdiri dari : -pelacakan molekul DNA dg DNA (Southern blotting)-pelacakan molekul RNA dan DNA (Northen blot)-pelacakan protein dg protein spesifik atau antibodi monoklonal (western blotting)

Southern blotting

Northen blot

western blotting

C. Teknik Sekuensing DNA (DNA Sequencing)

• Utk menentukan urutan basa-basa nukelotida suatu fragmen DNA.

• Jenis-jenis teknik sekuensing DNA,– Teknik Maxam-Gilbert; metode pertama yg

digunakan– Teknik Sanger –Coulson; metode modern

sekuensing dg menggunakan DNA polimerase, dNTP,ddNTP,

Teknik Maxam-Gilbert

• Dikembangkan A.M Maxam & W.Gilbert thn 1977• Fragmen DNA yg akan diurutkan dilabel dg radioaktif (32P)

pada salah satu ujung 5’• Dapat diterapkan pada DNA untai ganda maupun DNA untai

tunggal• Molekul DNA dipotong dg piperidin, selanjutnya basa DNA

dimodifikasi sedemikian rupa dg senyawa kimia tertentu, Asam format utk menghidrolisis basa A & G; Dimetil sulfat utk metilasi basa G; Hidrazin utk menghidrolisis basa C & T sehingga akan dihasilkan 4 jenis fragmen DNA DG UKURAN BERBEDA dgn masing2 ujung G, ujung T, ujung A, & ujung C

• Fragmen DNA yg dihasilkan dielektroforesis dg gel poliakrilamid

Teknik Maxam-Gilbert

Asam FormatDimetil sulfat Hidrazin Hidrazin+garam

Teknik Sanger -Coulson

• Tehnik utk menentukan urutan basa DNA• Memanfaatkan sifat enzim DNA polimerase

yaitu fragmen klenow, yg memiliki kemampuan mensintesis DNA dg dNTP, sehingga dapat dihentikan reaksinya dgn penambahan ddNTP

• Setiap reaksi akan dihasilkan fragmen DNA dgn ukuran bervariasi dimana setiap fragmen DNA akan memiliki gugus ddNTP yg telah dilabel dg radioaktif pada ujung 3’

• Utk mengetahui ukuran fragmen DNA dilakukan elektroforesis dgn gel poliakrilamid kemudian didetekdi dg autoradiografi

Sejarah AM

• Seabad lalu, Paul Ehrlich menyatakan magic bullet dapat dikembangkan sebagai target selektif pada suatu penyakit.

• Ditemukan pengembangan teknik pembuatan antibodi monoklonal oleh Kőhler dan Milstein tahun 1975.

• Antibodi monoklonal secara potensial merusak atau menghancurkan aktiviti sel kanker atau dengan cara lain yaitu meningkatkan respons imun jaringan tubuh melawan kanker.

• Jenis terapi target antibodi monoklonal yang mulai digunakan pada KPKBSK adalah obat yang bekerja sebagai inhibitor epidermal growth factor receptor (EGFR) dan inhibitor vascular endothelial growth factor (VEGF)

Definisi• Antibodi merupakan campuran protein di dalam

darah dan disekresi mukosa menghasilkan sistem imun bertujuan untuk melawan antigen asing yang masuk ke dalam sirkulasi darah

• Antibodi dibentuk oleh sel darah putih yang disebut limfosit B

• Antigen merupakan suatu protein yang terdapat pada permukaan bakteri, virus dan sel kanker

• Antibodi tersebut mempunyai 2 fragmen, fragmen antigen binding Fab dan fragmen cristallizable Fc

• AM mempunyai sifat khusus yang unik yaitu dapat mengenal suatu molekul, memberikan informasi tentang molekul spesifik dan sebagai terapi target tanpa merusak sel sehat sekitarnya.

• AMdiperoleh dari sel yang dikembangkan di laboratorium yangberguna untuk penelitian terapi dan diagnostik laboratorium.

• Manusia dan tikus mempunyai kemampuan untuk membentuk antibodi yang dapat mengenali antigen.

• Spesifisiti antibodi yang luar biasa menjadikan zat ini dapat digunakan sebagai terapi.

• Antibodi mengikat sel kanker dan berpasangan dengan zat sitotoksik sehingga membentuk suatu kompleks yang dapat mencari dan menghancurkan sel kanker.

Jenis AM• 4 Jenis AM :1. Murine, murni didapat dari tikus dapat menyebabkan human

anti mouse antibodies (HAMA) nama akhirannya ″momab″ (ibritumomab).

2. Chimeric, gabungan Fc antibodi human dan Fab antibodi monoklonal tikus nama akhirannya ″ximab″ (rituximab).

3. Humanized, hanya sebagian kecil Fab antibodi tikus yang digabungkan dengan antibodi human (95-98%) nama akhirannya ″zumab″ (trastuzumab).

4. Fully human, keseluruhan antibodi human nama akhirannya ″mumab″ (adalimumab).

Pembuatan AM

• Tikus yang telah diimunisasi dengan antigen khusus ke dalam sumsum tulang akan menghasilkan sel limfosit B yang memiliki masa waktu hidup terbatas dalam kultur

• Hasil campuran heterogen sel hybridomas dipilih hybridoma yang memiliki 2 kemampuan yaitu dapat menghasilkan antibodi khusus dan dapat tumbuh di dalam kultur.

• Hybridoma yang berasal dari satu limfosit akan menghasilkan antibodi yang akan mengenali satu jenis antigen.

• Antibodi inilah yang dikenal sebagai antibodi monoklonal

• Proses pembuatan antibodi monoklonal melalui 5 tahapan :

1.Imunisasi tikus dan seleksi tikus donor untuk pengembangan sel hybridoma

2.Penyaringan produksi antibodi tikus S3.Persiapan sel myeloma Sel myeloma yang didapat

dari tumor limfosit abadi tidak dapat tumbuh jika kekurangan hypoxantine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) dan sel limpa normal masa hidupnya terbatas.

4.Fusi sel myeloma dengan sel imun limpa5.Pengembangan lebih lanjut kloning sel hybridoma

Aplikasi terapi dari Antibodi monoklonal

• Induksi imunisasi pasif• Diagnostik imaging. • Diagnostik molekular. • Monitoring terapi obat (untuk live-saving drug)• Sistem penghantaran obat (Drug delivery

system/DDS)• Isolasi dan atau purifikasi obat baru• Terapi kanker.

MEKANISME KERJA AM• Antibodi monoklonal menggunakan mekanisme

kombinasi untuk meningkatkan efek sitotoksik sel tumor• Mekanisme komponen sistem imun adalah antibody

dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity (CDC), mengubah signal transduksi sel tumor atau menghilangkan sel permukaan antigen.

• Antibodi dapat digunakan sebagai target muatan (radioisotop, obat atau toksin) untuk membunuh sel tumor atau mengaktivasi prodrug di tumor, antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT).

• Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC)

Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) terjadi jika antibodi mengikat antigen sel tumor dan Fc antibodi melekat dengan reseptor Fc pada permukaan sel imun efektor.

• Complement dependent cytotoxicity (CDC)Pengikatan antibodi monoklonal dengan antigen

permukaan sel akan mengawali kaskade komplement.

• Antibodi directed enzyme prodrug therapy (ADEPT)

AM sebagai penghantar untuk sampai ke sel tumor kemudian enzim mengaktifkan prodrug pada tumor, hal ini dapat meningkatkan dosis active drug di dalam tumor

• Imunomodulasi Beberapa percobaan menunjukkan antibodi yang

langsung melawan cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA 4) terbukti dapat menginduksi regresi imun.

Kegunaan AM

• untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin ( HCG ) dalam urin wanita hamil.

• untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan kelebihan obat digoxin dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini.

• mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.

Terapi Target (Targeted Therapy)

• Terapi target didefinisikan sebagai obat atau molekul untuk membunuh sel tumor melalui interaksi target yang terdapat pada sel ganas.

• Terapi target ditujukan bagaimana secara selektif melawan molekul pada permukaan sel dan jalur signal metabolik sel ganas.

• dapat memisahkan sel normal selanjutnya mengurangi toksisiti dan memperbaiki kualiti hidup.

• Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) dan Tyrosine Kinase (TK)

Berikatan dengan ligand menyebabkan homodimerisasi atau heterodimerisasi reseptor HER famili yang lain dan mengaktifkan tyrosine kinase (TK).

Berinteraksi dengan jalur komponen yang mempengaruhi sel - sel adhesi, hal ini penting untuk invasi tumor sel ke jaringan yang berdekatan.

Mengaktivasi matrix metalloproteinase dan stimulasi motiliti sel tumor yang akhirnya menambah metastasis.

• TRASTUZUMAB (Herceptin) Suatu AM humanized yang menghambat sel

pertumbuhan dengan mengikat bagian ekstraseluler reseptor HER2 protein tyrosine kinase.

Menginduksi ADCC melalui sel NK dan monosit untuk melawan sel ganas.

Efek samping disfungsi jantung (27% pada terapi kombinasi dan 8% terapi tunggal), mielosupresi dan diare.

• CETUXIMAB (Erbitux) AM chimeric yang bekerja mengikat EGFR pada

bagian ekstraseluler. Memberikan efek samping ruam acneiform,

folikulitis pada wajah dan dada serta dilaporkan juga reaksi hipersensitif.

Gene Therapy

Pendahuluan

GEN apa itu gen?Gen adalah bagian dari DNA yang mengkode suatu protein

atau molekul yang diperlukan dalam aktivitas sel.

Masalahnya Genetic disorder / kelainan geneticAdalah penyakit atau kondisi yang disebabkan ketiadaan atau

rusaknya gen.

Solusinya Gene therapy / terapi genTerapi Gen ranking 11 yang paling banyak dibicarakan

mengenai terapi medis di dunia

Definisi Terapi Gen

• Terapi gen adalah suatu proses memperbaiki gen rusak yang dapat menimbulkan kelainan genetic.

• Daerah yang rusak digantikan oleh DNA yang sudah dikodekan.

• Clinical trial terapi gen sudah dimulai sejak tahun 1990, yaitu pada dua pasien yang mengidap Severe Combined Immune Disorder (SCID).

Prinsip Kerja Terapi Gen

1. Penelitian awal : menyisipkan gen normal ke dalam genom utk menggantikan gen yg rusak/abnormal

2. Molekul pembawa (vektor) membawa gen terapetik ke dalam sel target pasien.

3. Vektor yg paling umum adalah VIRUS, yg dapat memasukkan DNA/RNA ke dalam sel manusia

Pendekatan

• Gen normal disisipkan ke lokasi nonspesifik dalam genome untuk menggantikan gen yang sudah tidak berfungsi Rekombinan DNA dan Insersi DNA

• Gen abnormal digantikan gen normal melalui homologous recombination.

• Gen abnormal dapat diperbaiki melalui selective reverse mutation, yang mana mengembalikan fungsi normal gen

1

2

3

Keuntungan

1. Memampukan manusia mempunyai anak tanpa ‘konsepsi’2. Menyembuhkan penyakit berbahaya tanpa menimbulkan

rasa sakit. 3. Mencegah penyakit genetik berdasarkan sex/gender4. Meningkatkan ‘penerimaan’ organ hasil transplantasi

Kelemahan

• Keamanan- resiko efek genetik detrimental• Berbahaya karena menimbulkan 'genetic

reductionism'

Tipe Terapi Gen

1. Germ Line– Material yang sudah diubah secara genetis diwariskan oleh

keturunan pasien– Gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal

diperbaiki dengan cara menginsersikan dan mengintegrasikan gen yang normal atau gen yang telah dimodifikasi kedalam genom sel-sel germinal

– Sangat bermanfaat untuk mengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang bersifat herediter

2. Somatic– Gene therapy non hereditable– Gen yang normal atau telah dimodifikasi

ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien– Mengobati/mengatasi gejala penyakit

pasien – Tidak dapat diturunkan kepada generasi

selanjutnya gen yang telah diperbaiki ini hanya ada pada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-sel germinal.

– Mirip dengan transplantasi sel, jaringan atau organ lebih rumit dan lebih berbahaya

Sistem Penghantaran

Ada dua metode untuk insersi materi genetic ke dalam kromosom manusia:1. Ex Vivo

Teknik ex vivo memerlukan penghapusan gene rusak dan injeksi DNA baru ke dalam sel

Materi genetic diubah di luar tubuh (di dalam laboratorium)2. In Vivo

Vektor viral yang mengandung gen normal langsung disuntikan ke dalam tubuh penderita agar dibawa oleh vektor untuk masuk ke dalam sel yang ingin diterapi.

Metode

• Imunoterapi• Viro onkolitik • Transfer gen

1. IMUNOTERAPIMenggunakan sel yang telah dimodifikasi secara genetik dari partikel virus untuk menstimulir sistem imun tubuh sehingga mampu mengalahkan keganasan sel kanker2. VIRO ONKOLITIKMenggunakan partikel sel virus yang bereplikasi didalam sel kanker dan menyebabkan sel kanker menjadi mati.3. TRANSFER GENTehnik ini relatif baru, dengan cara memperkenalkan gen 2 baru yang dimasukan kedalam sel kanker atau mengelilingi jaringan kanker sehingga dapat menghentikan pertumbuhan dan menghancurkan sel kanker

Vektor

1. Vektor Viral– Metode paling baik karena tingkat

keefisiensi virus yang sangat tinggi untuk melakukan transduksi pada manusia

– Contoh : Retrovirus, Adenovirus, Adeno-associated virus, dan Herpes simplex virus

2. Vektor non viral– Terbatas, hanya bekerja pada jaringan

tertentu, misalnya jaringan otot.– Contoh : Liposom, suntikan langsung dan

dendrimer.

Pro dan Kontra

PRO: Memiliki potensi untuk menyembuhkan penyakit genetis,

tidak hanya mengurangi gejala Dapat dilakukan pada sel reproduksi, dapat menjauhkan

penyakit genetis untuk generasi mendatang Dapat memperpanjang jangka hidup manusia, sehingga

mengurangi efek dari penyakit Dapat mencegah transmisi dari gen yang dapat

menyebabkan penyakit, yang mana dapat mengurangi resiko dan biaya di masa datang

Potensial pada kelainan seperti Parkinson, Huntington dan Alzheimer.

Kontra Kesalahan dalam penggantian atau

penambahan materi genetic dapat menyebabkan kelainan yang serius

Sistem imun dapat menghancurkan vector Dapat disalahgunakan, bukan hanya untuk

menyembuhkan penyakit, namun digunakan untuk memperoleh sifat-sifat genetis yang diinginkan

Lama terapi dan efek jangka panjang masih belum diketahui

Ethical Issue

• MAHAL hanya bagi orang elit yang mampu• EUGENIC penciptaan ras superior / “designer babies”• RELIGION memanipulasi DNA adalah tidak wajar

Apa itu Hormon???

• Hormon adalah zat aktif yang dihasilkan oleh kelenjar endokrin, yang masuk kedalam peredaran darah untuk mempengaruhi jaringan secara spesifik.

GH???

• Hormon pertumbuhan (GH) adalah hormon berbasis protein peptida yang merupakan jenis hormon adenohipofisis yang merangsang pertumbuhan, reproduksi sel dan regenerasi pada manusia, tumbuhan dan hewan lainnya.

Somatotropin VS Somatropin

• Somatotropin merujuk pada hormon pertumbuhan yang diproduksi secara alami dalam hewan, sedangkan istilah somatropin merujuk pada hormon pertumbuhan yang diproduksi oleh DNA rekombinan teknologi, dan adalah disingkat "HGH" pada manusia.

Peran utama hormon pertumbuhan

• umerangsang hati dan jaringan lain untuk mengeluarkan IGF-I merangsang proliferasi kondrosit (sel tulang rawan), mengakibatkan pertumbuhan tulang.

• Hormon pertumbuhan memiliki efek langsung pada pertumbuhan tulang dalam merangsang diferensiasi kondrosit.

• Hormon pertumbuhan memiliki efek penting pada protein, lemak dan metabolisme karbohidrat.

• Metabolisme protein merangsang anabolisme protein dalam banyak jaringan

• Metabolisme lemak meningkatkan pemanfaatan lemak dengan merangsang pemecahan trigliserida dan oksidasi di adipocytes.

• Metabolisme karbohidrat menjaga glukosa darah dalam kisaran normal.

Kendali Hormon Pertumbuhan

• Pengendali utama adalah dua hormon hipotalamus dan satu hormon dari perut yaitu:

Faktor penglepas hormon pertumbuhan (GHRH)

Somatostatin (SS/GH-RIH = growth hormone releasing inhibitory hormone)

Ghrelin

Penyebab defisiensi :

mutasi gen spesifik, kelainan bawaan, kerusakan akibat dari cedera, pembedahan

atau penyakit

Efek defisiensi hormon pertumbuhan

• Pada anak : kegagalan pertumbuhan/kekerdilan dan perawakan dan dapat menyebabkan kematangan seksual tertunda.

• Pada dewasa : meningkatkan risiko kardiovaskular, lemak bertambah, densitas tulang menurun, fungsi ginjal menurun, radang sendi, diabetes, rambut rontok dan mudah lelah.

Solusi defisiensi???

• Kekurangan GH dapat diatasi dengan melakukan terapi, yaitu mengganti GH dengan suntikan setiap hari di bawah kulit atau ke otot atau dengan pengembangan rekombinan GH (rhGH).

CONTOH SEDIAAN

1. SOMATREM# Diindikasikan untuk defisiensi hormon

pertumbuhan pada anak# Dosis maksimum 0,1 mg/kg tiga kali seminggu # Efek samping : Hiperglikemia dan ketosis

(diabetogenik) bisa terjadi pada pasien dengan riwayat diabetes melitus

2. SOMATROPIN# Indikasi : defisiensi hormon pertumbuhan

pada anak.# Cara pemberian: IM dan SC # Dosis maksimum 0,06 mg/kg dibagi tiga kali

pemberian dalam seminggu, atau 6-7 kali pemberian dalam seminggu

Sejarah Insulin• Banting dan Best menemukan hormon insulin pada tahun 1921.• Pasien Diabetes mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula

darah disebabkan gangguan produksi insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas hewan.

• Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun komposisinya sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon inflamasi pada tempat injeksi.

• Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mem-pertimbangkan untuk membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli yang telah dilemahkan dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Pengertian Insulin• Insulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-

sel β kelenjar Langerhaens pankreas dan digunakan untuk mengontrol kadar glukosa dalam darah.

• Insulin berperan penting dalam regulasikadar gula darah (kadar gula darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Hormoninsulin yang diproduksi oleh tubuh kita dikenal juga sebagai sebutan insulin endogen.

• Ketika kalenjar pankreas mengalami gangguan memproduksi hormon insulin, tubuh membutuhkan hormon insulin dari luar tubuh, dapat berupa obat buatan manusia yang dikenal dengan sebutan insulin eksogen.

• Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus tergantung insulin (diabetes tipe 1).

Pengertian Insulin

• Sekresi insulin terdiri dari 2 komponen. • Komponen pertama yaitu: sekresi insulin basal kira-kira

1 unit/jam dan terjadi diantara waktu makan, waktu malam hari dan keadaan puasa.

• Komponen kedua yaitu: sekresi insulin prandial yang menghasilkan kadar insulin 5-10 kali lebih besar dari kadar insulin basal dan diproduksi secara pulsatif dalam waktu 0,5-1 jam sesudah makan dan mencapai puncak dalam 30-45 menit, kemudian menurun dengan cepat mengikuti penurunan kadar glukosa basal.

Peran Insulin

• Insulin berperan dalam penggunaan glukosa oleh sel tubuh untuk pembentukan energi, apabila tidak ada insulin maka sel tidak dapat menggunakan glukosa sehingga proses metabolisme menjadi terganggu.

• Insulin akan meningkatkan pengikatan glukosa oleh jaringan, meningkatkan level glikogen dalam hati, mengurangi pemecahan glikogen (glikogenolisis) di hati, meningkatkan sintesis asam lemak, menurunkan pemecahan asam lemak menjadi badan keton, dan membantu penggabungan asam amino menjadi protein.

Jenis Insulin• Insulin sampai saat ini dikelompokkan menjadi beberapa jenis antara lain:

1. Kerja cepat (rapid acting)• Contoh: Actrapid, Humulin R,Reguler Insulin (Crystal Zinc Insulin)

Bentuknya larutan jernih, efek puncak 2-4 jam setelah penyuntikan, durasi kerja sampai 6 jam. Merupakan satu-satunya insulin yang dapat dipergunakan secara intra vena. Bisa dicampur dengan insulin kerja menengah atau insulin kerja panjang.

2. Kerja menengah (intermediate acting)• Contoh: Insulatard, Monotard, Humulin N, NPH, Insulin Lente

Dengan menambah protamin (NPH / Neutral Protamin Hagedom) atau zinc (pada insulin lente), maka bentuknya menjadi suspensi yang akan memperlambat absorpsi sehingga efek menjadi lebih panjang.

3. Kerja panjang ( long acting)• Contoh: Insulin Glargine, Insulin Ultralente, PZI Insulin bentuk ini diperlukan untuk

tujuan mempertahankan insulin basal yang konstan.

Struktur Insulin

• Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua.

• Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida. Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lenganpendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai B).

• DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin.

Biosintesis Insulin

• Insulin dibentuk dari prekursor yang disebut proinsulin (berat molekul 9 kDa).

• Proinsulin berasal dari prekursor yang lebih besar, preproinsulin, yang disintesis di retikulum endoplasma kasar.

• Proinsulin merupakan rantai kontinyu yang berawal dari N-terminal end dari rantai B dan berakhir di C-terminal dari rantai A.

• Di aparatus golgi dan granula penyimpanan, suatu enzim pengubah memotong proinsulin untuk menghasilkan insulin.

• Pankreas manusia dewasa mengandung sekitar 5 mg insulin cadangan. Pada manusia, gen yang mengkode insulin terletak di lengan pendek kromosom 11.

Biosintesis Insulin

Metabolisme Insulin• Insulin bersirkulasi sebagai monomer, tidak terikat protein plasma. • Difilter oleh glomerolus namun hampir seluruhnya direabsorbsi

kembali di tubulus proksimal, dan didegradasi oleh ginjal. • Hepar membuang sekitar setengah insulin portal hepatik yang

melewatinya. Waktu paruh insulin dalam plasma sekitar 5 menit. • Proinsulin, yang juga dilepas bersama insulin, memiliki waktu paruh

yang lebih lama (sekitar 20 menit). • Proinsulin tidak dipecah menjadi insulin di dalam plasma. Meskipun

hepar dan ginjal merupakan tempat mayor degradasi insulin, sebenarnya semua jaringan tubuh dapat memecah hormon tersebut.

• Insulin dapat didegradasi ekstraseluler dan juga intraseluler, setelah terikat ke reseptornya dan diinternalisasi ke dalam sel.

Mekanisme Aksi Insulin• Aksi insulin dimediasi oleh reseptor spesifik yang terletak di membran

plasma sel. • Reseptor insulin terdiri dari 2 subunit alfa dan 2 subunit beta yang

saling berhubungan kovalen melalui jembatan disulfida. • Subunit alfa berada di ekstraseluler, dan memiliki insulin-binding sites. • Subunit beta merentangkan membran dan mentranduksikan sinyal

intraseluler untuk pengikatan insulin ke subunit alfa. • Ketika insulin terikat pada reseptornya, interaksi ini ditransmisikan ke

domain intraseluler ke subunit beta. • Subunit ini menjadi ter-autofosforilasi, mengaktifkan protein

fosfokinasenya sendiri, sehingga menghasilkan cascade reaksi fosforilasi dan defosforilasi intraseluler melalui aksi yangmana insulin diekspresikan.

Gambar Struktur Reseptor Insulin

Mekanisme Aksi Insulin• Setelah reseptor mengikat insulin, kompleks reseptor-hormon

meninggalkan membran melalui endositosis dan memasuki sel. • Setelah mengikat reseptor, kompleks tersebut membentuk kapsul

dalam lubang terselubung, yang dibentuk melalui invaginasi dan fusi permukaan sel.

• Suatu saat lubang tersebut escara progresif terbuka dan membentuk endosom di dalam sel. Endosom melepaskan reseptor dan insulin, reseptor kemudian dikembalikan ulang ke membran sel sedangkan insulin didegradasi.

• Proses internalisasi reseptor dapat memberikan sarana meregulasi efek insulin dengan membatasi jumlah reseptor yang tersedia untuk mengikat hormon. Ini secara efektif men-downregulasi reseptor insulin.

Efek Insulin• Saat glukosa memasuki sirkulasi, Insulin menyingkirkan glukosa

dari sirkulasi dan mempromosikan konversinya menjadi glikogen dan lipid. Insulin mendukung konversinya menjadi glikogen dan lipid, serta uptake asam amino ke hepar dan otot lurik, dimana mereka akan diubah menjadi protein. Dengan demikian insulin merupakan hormon anabolik.

• Hepar. Ketika insulin terikat oleh reseptor insulin hepar, sejumlah enzim yang terlibat dalam pembentukan glikogen akan terstimulasi, meliputi enzim glikogen sintetase yang mengkatalisis pembentukan glikogen. Hal ini menimbulkan gradien konsentrasi dan lebih banyak glukosa yang masuk ke dalam sel.

Efek Insulin• Jaringan Lemak. Insulin dibutuhkan dalam aktivasi enzim lipoprotein

lipase. Jika tidak ada insulin, lipoprotein terakumulasi dalam sirkulasi. Insulin juga berlawanan dengan aksi glukasgon yang mendukung produksi badan keton. Badan keton, aseton, asam asetoasetik dan asam beta-hidroksibutirik adalah sumber energi untuk otot dan otak, khususnya selama puasa. Mereka berasal dari lipid, dan diproduksi dalam keadaan kekurangan insulin.

• Otot. Insulin merangsang uptake asam amino ke otot lurik , dan meningkatkan inkorporasi asam amino menjadi protein. Kedua aksi ini tidak berhubungan aksi insulin dalam proses transport glukosa ke dalam sel.

• Aksi insulin lainnya meliputi peranannya terhadap faktor pertumbuhan dalam kelejar mammae, yang menjadi sangat sensitif terhadap insulin saat hamil dan menyusui.

Efek Kekurangan Insulin• Keadaan yang sangat katabolik, kadang disebut sindrom insulopenik.

Tanpa insulin, glukosa tidak di-uptake oleh jaringan dan berakibat pada keadaan hiperglikemia.

• Penurunan berat badan (wasting).• Asidosis mengakibatkan vasodilatasi dan hipotermia. • Hiperventilasi untuk menurunkan asidosis melalui pembentukan

karbon dioksida. • Keadaan anabolik yang menurun dan hiperglikemia kelelahan

(fatigue).• Dehidrasi.• Koma kombinasi dari hiperketonemia, meliputi dehidrasi,

hiperosmolaritas karena hiperglikemia dan permasalhan mikrosirkulasi serebral.

Efek Insulin

Proses Pembuatan Insulin• 1. Mengidentifikasi dan mengisolasi gen penghasil insulin dari sel

pankreas manusia.– mRNA disalin dari gen penghasil insulindiekstrak dari sel pancreas.

Kemudian enzim transcriptase ditambahkan pada mRNA bersamaan dengan nukleotidapenyusun DNA.

– Enzim ini menggunakan mRNA sebagai cetakan untukmembentuk DNA berantai tunggal.

– DNA ini kemudian dilepaskan dari mRNA.– Enzim DNA polymerase digunakan untuk melengkapi DNA rantaitunggal

menjadi rantai ganda, disebut DNA komplementer (c-DNA), yang merupakan gen penghasil insulin.

• 2. Melepaskan salinan gen penghasil insulin tersebut dengan cara memotong kromosom secara khusus menggunakan enzim restriksi.

Proses Pembuatan Insulin• 3. Mengekstrak plasmid dari sel bakteri dan membuka plasmid dari

sel bakteri dengan enzim restriksi yang lain. Di dalam serangkaian tabung reaksi atau cawan petri, gen penghasil insulin manusia (dalam bentuk c-DNA) disiapkan untuk dipasangkan pada plasmid yang terbuka tersebut.

• 4. Memasang gen penghasil insulin ke dalam cincin plasmid. Akan dihasilkan molekul DNA rekombinan /plasmid rekombinan yang bagus.

• 5. Memasukkan plasmid rekombinan kedalam bakteri E. coli. Di dalam sel bakteri ini plasmid mengadakan replikasi.

• 6. Mengultur bakteri E. Coli yang akan berkembang biak dengan cepat menghasilkan klon-klon bakteri yang mengandung plasmidrekombinan penghasil insulin.

Manfaat Insulin Bagi Penderita Diabetes

• Terapi insulin dapat mencegah kerusakan endotel, menekan proses inflamasi, mengurangi kejadian apoptosis, dan memperbaiki profil lipid.

• Insulin, terutama insulin analog, merupakan jenis yang baik karena memiliki profil sekresi yang sangat mendekati pola sekresi insulin normal atau fisiologis.

• Pemberian insulin basal, selain insulin prandial, merupakan salah satu strategi pengobatan untuk memperbaiki kadar glukosa darah puasa atau sebelum makan. Oleh karena glukosa darah setelah makan merupakan keadaan yang dipengaruhi oleh kadar glukosa darah puasa, maka diharapkan dengan menurunkan kadar glukosa darah basal, kadar glukosa darah setelah makan juga ikut turun.

Manfaat Insulin Bagi Penderita Diabetes

• Terapi insulin yang diberikan dapat bervariasi sesuai dengan kenyamanan penderita selama terapi insulin mendekati kebutuhan fisiologis.

• Walaupun banyak cara yang dapat dianjurkan, namun prinsip dasarnya adalah sama ; yaitu insulin prandial dikombinasikan dengan insulin basal dalam

Pemilihan Tipe Insulin

• Tergantung pada beberapa factor, yaitu : – Respon tubuh individu terhadap – Pilihan gaya hidup seperti : jenis makanan, berapa banyak

konsumsi alcohol, berapa sering berolah raga– Berapa banyak suntikan per hari yang ingin dilakukan. – Berapa sering melakukan pengecekan kadar gula darah. – Usia – Target pengaturan gula darah.

Tipe-tipe Insulin

• Insulin dapat dibedakan atas dasar:

• 1. Waktu kerja insulin (onset), yaitu waktu mulai timbulnya efek insulin sejak disuntikan.

• 2. Puncak kerja insulin, yaitu waktu tercapainya puncak kerja insulin.

• 3. Lama kerja insulin (durasi), yaitu waktu dari timbulnya efek insulin sampai hilangnya efek insulin.

Tipe-tipe Insulin

• Terdapat 4 buah insulin eksogen yang diproduksi dan dikategorikan berdasarkan puncak dan jangka waktu efeknya. Berikut keterangan jenis insulin eksogen :

• 1. Insulin Eksogen kerja cepat.Diberikan 30 menit sebelum makan, mencapai

puncak setelah 1– 3 macam dan efeknya dapat bertahan samapai 8 jam. Preparat: Actrapid, Velosulin, Semilente.

Tipe-tipe Insulin• 2. Insulin Eksogen kerja sedang.

Jenis ini awal kerjanya adalah 1.5 – 2.5 jam. Puncaknya tercapai dalam 4 – 15 jam dan efeknya dapat bertahan sampai dengan 24 jam. Preparat: Netral Protamine Hegedorn ( NPH ),MonotardÒ, InsulatardÒ

• 3. Insulin Eksogen campur antara kerja cepat & kerja sedang (Insulin premix)

Insulin ini mempunyai onset cepat dan durasi sedang (24 jam). Preparatnya: Mixtard 30 / 40

• 4. Insulin Eksogen kerja panjang (lebih dari 24 jam). Efek yang dirasakan cukup lama, yaitu sekitar 24 – 36 jam. Preparat:

Protamine Zinc Insulin (PZI ), Ultratard.

Cara Pemberian Insulin• Insulin kerja singkat :

– IV, IM, SC– Infus ( AA / Glukosa / elektrolit )– Jangan bersama darah ( mengandung enzim merusak insulin )

• Insulin kerja menengah / panjang : – Jangan IV karena bahaya emboli.

• Dosis pemberian insulin tergantung pada kadar gula darah, yaitu :

< 60 mg % = 0 unit< 200 mg % = 5 – 8 unit200 – 250 mg% = 10 – 12 unit250 - 300 mg% = 15 – 16 unit300 – 350 mg% = 20 unit> 350 mg% = 20 – 24 unit

Teknik Penyuntikan Insulin

• Kedua tangan dan daerah yang akan disuntik harus dibersihkan dengan alkohol 70% dengan kapas steril.

• Tutup vial insulin harus diusap dengan alkohol 70%.• Insulin digulung-gulung secara perlahan agar suspensi

terlarut (Jangan dikocok).• Ambil udara sejumlah insulin yang akan diberikan. Lalu

suntik ke dalam vial untuk mencegah terjadi ruang vakum dalam vial. Terutama untuk campuran insulin.

• Periksa jarum suntik, mengandung gelembung atau tidak. Satu atau dua ketukan pada alat suntik dalam posisi tegak untuk mengurangi gelembung tersebut.

Teknik Penyuntikan Insulin

• Penyuntikan dilakukan pada jaringan bawah kulit (subkutan). Suntik dengan sudut 90 derajat. Pada pasien kurus dan anak-anak, kulit dijepit dan insulin disuntikkan dengan sudut 45 derajat agar tidak terjadi penyuntikkan otot.

• Kadar glukosa tinggi disuntikkan di daerah perut dimana penyerapan akan lebih cepat.

• Kadar glukosa rendah hindarilah penyuntikkan pada daerah perut.

• Daerah berjarak 1inchi (2,54 cm) dari daerah sebelumnya. • Rotasi di dalam satu daerah selama satu minggu, selanjutnya

pindah ke daerah yang lain.

Tips• Bila penyuntikkan terasa sakit/ perdarahan setelah proses

penyuntikkan, maka daerah tersebut sebaiknya ditekan selama 5-8 detik. Untuk mengurangi rasa sakit pada waktu penyuntikkan dapat ditempuh usaha-usaha sebagai berikut:– Menyuntik dengan suhu kamar.– Pastikan bahwa dalam alat suntik tidak terdapat

gelembung udara.– Tunggulah sampai alkohol kering sebelum menyuntik.– Usahakanlah agar otot daerah yang akan disuntik tidak

tegang.– Tusuklah kulit dengan cepat.– Jangan merubah arah suntikkan selama penyuntikkan atau

mencabut suntikan.– Jangan menggunakan jarum yang sudah tampak tumpul.

Jenis Alat Suntik Insulin

• 1. Siring (syringe) dan jarum Siring dari bahan kaca. Sulit dibersihkan, mudah pecah dan sering menjadi kurang akurat. Siring yang terbaik adalah siring yang terbuat dari plastik sekali pakai.

• 2. Pena insulin (Insulin Pen ). Praktis, mudah dan menyenangkan karena nyaris tidak menimbulkan nyeri. Alat ini menggabungkan semua fungsi didalam satu alat tunggal.

• 3. Pompa insulin (Insulin Pump).Pompa insulin (insulin pump) diciptakan untuk mneyediakan insulin secara berkesinambungan.

Penyimpanan Insulin Eksogen• Bila belum dipakai :• Sebaiknya disimpan 2-8 derajat celcius (jangan sampai beku), di

dalam gelap (seperti di lemari pendingin, namun hindari freezer.• Bila sedang dipakai :• Suhu ruang 25-30 derajat celcius cukup untuk menyimpan selama

beberapa minggu, tetapi janganlah terkena sinar matahari.• Sinar matahari secara langsung dapat mempengaruhi percepatan

kehilangan aktifitas biologik sampai 100 kai dari biasanya.• Suntikkan dalam bentuk pena dan insulin dalam suntikkan tidak

perlu disimpan di lemari pendingin diantara 2 waktu pemberian suntikkan.

• Bila tidak tersedia lemari pendingin, simpanlah insulin eksogen di tempat yang teduh dan gelap.

Efek Samping Penggunaan Insulin

– Hipoglikemia– Lipoatrofi– Lipohipertrofi– Alergi sistemik atau lokal– Resistensi insulin– Edema Insulin– Sepsis– Reaksi Lokal– Inflamasi lokal atau infeksi

Pengertian

Interferon adalah hormon berbentuk sitokina berupa protein berjenis glikoprotein yang disekresi oleh sel vertebrata akibat rangsangan biologis, seperti virus, bakteri, protozoa, mycoplasma, mitogen, dan senyawa lainnya. Berat molekul interferon relatif besar, berkisar 20-30 kDa.

Jenis InterferonSifat IFN Alfa (α) IFN Beta (β) IFN Gamma (γ)

Nama lain Leukosit IFN atau Tipe I

Fibroblas IFN atau Tipe I

Imun IFN atau tipe II

Gen >20 1 1

Stabilitas pH Stabil Stabil Labil

Induser (pengimbas)

Viruses (RNA>DNA),

dsRNA

Viruses (RNA>DNA),

dsRNAAntigen, Mitogen

Sumber utama Leukosit, Epitelium Fibroblas Limfosit

Fungsi

Interferon memiliki peranan penting dalam :• pertahanan terhadap infeksi virus. • digunakan untuk terapi berbagai penyakit,

termasuk hepatitis B dan hepatitis C.• mampu meredam perkembangbiakan virus

corona-SARS secara in vitro• melawan virus dengue

Efek Samping

• Penggunaan interferon akan menimbulkan efek samping berupa gejala demam, termasuk panas dan sakit kepala.

• Penggunaan interferon dalam waktu yang lama akan menyebabkan turunnya daya lihat dan bahkan rontoknya rambut.

• Penggunaan interferon dengan dosis tinggi akan menyebabkan kelelahan, nyeri persendian dan tulang belakang, diare, mual, muntah

• Masa terapi yang lama bahkan sampai lebih dari satu tahun.

Interaksi Obat

• Interferon alfa-2a, interferon alfa-2b dan interferon beta-1b dapat meningkatkan konsentrasi dari zidovudine (AZT, Retrovir) dalam darah. Meskipun reaksi ini mungkin memperbaiki keefektifan dari zidovudine, tetapi juga mungkin akan meningkatkan resiko keracunan darah dan hati. Sehingga, dosis dari zidovudine perlu dikurangi sebanyak 75%.

• Interferon alfa-2a dan interferon alfa-2b dapat meningkatkan waktu eksresi dan eliminasi yang diperlukan oleh theophylline dari tubuh, sehingga dosis theophylline perlu dikurangi.

Interferon-interferon yang tersedia

• Roferon-A (interferon alfa-2a)• Intron-A (interferon alfa-2b)• Alferon-N (interferon alfa-n3)• PegIntron (peginterferon alfa-2b)• Avonex (interferon beta-1a)• Rebif (interferon beta-1a)• Betaseron (interferon beta-1b)

Pendahuluan

Proses terjadinya penyakit dan berbagai reaksi inflamasi tubuh tergantung dari interaksi yang terdapat diantara virus atau bakteri dan sel yang terdapat pada sistem immune. Interaksi ini diperantarai oleh sitokin dan kemokin yang diproduksi oleh sel asal atau juga sel pendatang yang terdapat pada daerah keradangan. Sel yang menghasilkan sitokin adalah macrophage/monocyt, dendritic sel, limposit,neutropil, sel endothelial dan fibroblast

INTERLEUKIN

• Interleukin merupakan kelompok sitokin (disekresi protein ) yang pertama kali terlihat untuk diekspresikan oleh sel darah putih ( leukosit ).

INTERLEUKIN

• Interleukin diproduksi oleh berbagai sel tubuh.

• Mayoritas interleukin disintesis oleh helper CD4+ T lymphocytes, serta melalui monosit, makrofag, dan sel endotel.

Jenis Interleukin

• Interleukin-1• Interleukin-2, IL-2• Interleukin-3, IL-3• Interleukin-4, IL-4• Interleukin-5, IL-5• Interleukin-6• Interleukin-8, IL 8• Interleukin-10 • Interleukin 12, IL-12 • Interleukin-13, IL-13

Peranan Interleukin

Interleukin mempromosikan pengembangan dan diferensiasi T, B, ( sel sel limfosit ) dan sel-sel hematopoietik.

Pengertian Sitokin

Sitokin merupakan :• suatu sentral patogenesa yang akan meningkat

jumlahnya bila terdapat suatu penyakit.• mediator yang dihasilkan oleh sel dalam suatu reaksi

radang atau imunologik yang berfungsi sebagai isyarat antara sel sel untuk mengatur respon setempat dan terkadang juga secara sistemik.

• Sitokin mempengaruhi peradangan dan imunitas melalui pengaturan pertumbuhan,mobilitas dan diferensiasi lekosit dan sel sel lainnya.

Jenis Sitokin

• Limfokin : Sitokin yang dihasilkan oleh limfosit• Monokin : Sitokin yang diproduksi oleh

macrophage atau monosit

PENGERTIAN Sel punca

• sel yang tidak/belum terspesialisasi yang mempunyai kemampuan/potensi untuk berkembang menjadi berbagai jenis sel-sel yang spesifik yang membentuk berbagai jaringan tubuh.

KARAKTERISTIK DAN JENIS SEL PUNCA

• Sel punca mempunyai 2 sifat yang khas yaituA. Differensiasi : kemampuan untuk berkembang

menjadi sel lain. Sel punca mampu berkembang menjadi berbagai jenis sel yang khas (spesifik) misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel pankreas dan lain-lain

B. Regenerasi : yaitu kemampuan untuk memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri. Sel punca mampu membuat salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel.

Berdasarkan kemampuannya untuk berdifferensiasi

• Totipotent yaitu sel punca yang dapat berdifferensiasi menjadi semua jenis sel.

• Pluripotent yaitu stem cells yang dapat berdifferensiasi menjadi 3 lapisan germinal (ectoderm, mesoderm, dan endoderm) tetapi tidak dapat menjadi jaringan ekstraembrionik seperti plasenta dan tali pusat.

• Multipotent yaitu stem cell yang dapat berdifferensiasi menjadi banyak jenis sel misalnya hemopoetic stem cells yang terdapat pada sumsum tulang yang mempunyai kemampuan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai jenis sel yang terdapat dalam darah seperti eritrosit, lekosit dan trombosit

• Unipotent yaitu stem cells yang hanya dapat menghasilkan 1 jenis sel. Berbeda dengan non stem cells, stem cells mempunyai sifat masih dapat mempebaharui atau meregenerasi diri (self-regenerate/self renew)

Berdasarkan sumbernya

• Zigot• Embryonic stem cells • Fetus• Stem cell darah tali pusat • Adult stem cells

APPLIKASI / PENGGUNAAN KULTUR STEM CELLS

• Terapi gen• Penelitian untuk mempelajari proses-proses

biologis yang terjadi pada organisma termasuk perkembangan organisma dan perkembangan kanker

• Penelitian untuk menemukan dan mengembangkan obat-obat baru terutama untuk mengetahui efek obat terhadap berbagai jaringan

• Terapi sel (cell based therapy)

Penggunaan Stem Cell untuk Pengobatan Penyakit

• Penggunaan stem cells untuk mengobati penyakit dikenal sebagai Cell Based Therapy. Prinsip terapi adalah dengan melakukan transplantasi stem cells pada organ yang rusak. Tujuan dari transplantasi stem cells ini adalah

a. Mendapatkan pertumbuhan dan perkembangan sel-sel baru yang sehat pada jaringan atau organ tubuh pasien

b. Menggantikan sel-sel spesifik yang rusak akibat penyakit atau cidera tertentu dengan sel-sel baru yang ditranspalantasikan.

Alasan penggunaan stem cell dalam cell based therapy

1. stem cell dapat diperoleh dari pasien sendiri, artinya transplantasi dapat bersifat autolog sehingga menghindari potensi rejeksi. Berbeda dengan transplantasi organ yang membutuhkan organ donor yang harus match, transplantasi stem cells dapat dilakukan tanpa organ donor yang sesuai.

2. mempunyai kemampuan untuk berproliferasi yang besar sehingga dapat diperoleh sel dalam jumlah besar dari sumber yang terbatas. Pada luka baker yang luas jaringan kulit yang tersisa tidak cukup untuk menutupi lesi luka baker tersebut. Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan terapi stem cell.

3. mudah dimanipulasi untuk mengganti gen yang sudah tidak berfungsi lagi melalui metoda transfer gen.

Continue…

4. mempunyai kemampuan untuk bermigrasi kejaringan target misalnya ke otak

5. mempunyai kemampuan untuk berintegrasi dengan jaringan host dan berinteraksi dengan jaringan sekitarnya

Keuntungan penggunaan transplantasi stem cells untuk mengobati penyakit

1. tidak perlu adanya kecocokan donor2. transplantasi autologous lebih baik untuk

digunakan3. untuk mencegah terjadinya reaksi penolakan

jaringan dapat digunakan metoda somatic cell nuclear transfer) atau terapi kloning

Therapeutic cloning atau disebut Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)

• teknik yang bertujuan untuk menghindari resiko penolakan atau rejeksi

• Pada teknik ini inti sel telur donor dikeluarkan dan diganti dengan inti sel resipien.

• Sel yang telah dimanipulasi ini kemudian akan membelah diri dan setelah menjadi blastokista maka inner cell massnya akan diambil sebagai embryonic stem cells. Stem cells ini kemudian akan dimasukkan kembali kedalam tubuh resipien dan stem cells ini kemudian akan berdifferensiasi menjadi sel organ (sel beta pankreas, sel otot jantung dan lain-lain). Tanpa reaksi penolakan karena sel tersebut mengandung materi genetik resipien.

Jenis-jenis Stem Cell

• Embryonic stem cells • Adult stem cells • umbilical cord blood

Embryonic stem cells

• Embryonic stem cells dulu dipikirkan dapat memperbanyak diri sendiri secara tak terbatas, tetapi kini diketahui bahwa usia dan perbanyakan diri sendiri sel-sel stem juga ada batasnya. Hal ini disebabkan karena terjadinya mutasi pada gen-gen pada sel stem yang diakibatkan karena pengaruh nutrisi dalam medium kultur.

Embryonic stem cells

• Keuntungan1. mudah didapatkan, biasanya diperoleh dari

klinik fertilita2. bersifat pluripotent3. immortal artinya dapat berumur panjang

sehingga dapat memperbanyak diri ratusan kali pada media kultur.

4. reaksi penolakan rendah

Embryonic stem cells

• Kekurangan 1. dapat bersifat tumorigenik artinya setiap

kontaminasi dengan sel yang tak berdifferensiasi dapat menimbulkan kanker.

2. selalu bersifat allogenik sehingga berpotensi menimbulkan terjadinya rejeksi imunitas

3. secara etik masih kontroversial.

Adult stem cells

• Adult stem cells lebih sulit untuk diidentifikasi dan diisolasi diantara sel-sel yang bukan stem cells

• Keuntungan 1. dapat diperoleh dari sel pasien sendiri sehingga

menghindari terjadinya penolakan imun.2. sudah terspesialisasi sehingga induksi menjadi

lebih sederhana3. kurang atau tidak menimbulkan problem etika.

Adult stem cells

• Kelemahan 1. jumlahnya sedikit dan sangat jarang ditemukan

pada jaringan matur sehingga sulit mendapatkan adult stem cells dalam jumlah banyak.

2. masa hidupnya tidak selama embryonic stem cells

3. bersifat multipotent sehingga differensiasi tidak seluas embryonic stem cells yang bersifat pluripotent

umbilical cord blood • Stem cells yang diambil dari umbilical cord blood akhir-akhir ini

menjadi harapan untuk cell based therapy.• Kelebihan 1. mudah didapatkan, bisa diperoleh dari bank darah tali pusat2. siap dipakai, karena telah melalui proses prescreening, testing

dan pembekuan3. kontaminasi virus sangat minimal dibandingakn dengan stem

cells yang berasal dari sumsum tulang4. cara pengambilan mudah, tidak beresiko atau menyakiti donor. 5. Resiko Graft Versus Host Disease (GVHD) lebih rendah

dibandingkan dengan menggunakan stem cells yang berasal dari sumsum tulang.

umbilical cord blood

• Kekurangan1. kemungkinan terkena penyakit genetik. Ada

beberapa penyakit genetik yang tidak terdeteksi saat lahir sehingga diperlukan pengamatan setelah donor meningkat menjadi dewasa.

2. jumlah stem cells relatif terbatas sehingga ada ketidak sesuaian antara jumlah stem cells yang diperlukan resipien dengan jumlah yang tersedia dari donor

Aplikasi

• Penggunaan Stem Cells Pada Penyakit Stroke • Penggunaan Stem Cells Pada Infark Miokard• Penggunaan Stem Cells Pada Skin

Replacement• Penggunaan Stem Cells Pada diabetes tipe I

BIOETIKA PADA PENELITIAN STEM CELLS

• Hal utama terkait dengan masalah etik adalah sumber stem cell tersebut. Berbagai masalah etika yang perlu dipikirkan adalah

1. Apakah penelitian embrio manusia secara moral dapat dipertanggung jawabkan?

2. Apakah penelitian embrio yang menyebabkan kematian embrio merupakan pelanggaran terhadap hak azasi manusia (HAM) dan berkurangnya penghormatan terhadap mahluk hidup?

3. Apakah penyalah gunaan dapat diketahui dan dikendalikan?4. Apakah penggunaan embrio sisa proses bayi tabung pada

penelitian diperbolehkan?5. Apakah penelitian khusus membuat embrio untuk digunakan

diperbolehkan?

CONTINUE…

• Isu bioetika utama dalam penelitian dan penggunaan stem cell adalah penggunaan stem cell embrio terutama tentang sumber sel tersebut yaitu embrio. Sumber embrio adalah hasil abortus, zigot sisa IVF dan hasil pengklonan.

• Pengklonan embrio manusia untuk memperoleh stem cell merupakan isu yang sangat menimbulkan kontroversi. Hal ini terkait dengan isu ”awal kehidupan” dan penghormatan terhadap kehidupan itu sendiri. Pengklonan embrio manusia untuk memperoleh stem cell menimbulkan kontroversi karena berhubungan dengan pengklonan manusia yang ditentang oleh semua agama.

CONTINUE…• Dalam proses pemanenan stem cell embrio terjadi kerusakan

pada embrio dan menyebabkan embrio tersebut mati. Adanya anggapan bahwa embrio berstatus sama dengan manusia menyebabkan hal tersebut tidak dapat diterima

• Perdebatan yang cukup ramai adalah mengenai status moral embrio, apakah embrio harus diperlakukan sebagai manusia atau sebagai sesuatu yang berpotensi untuk menjadi manusia atau sebagai jaringan hidup tubuh lainnya. Lebih jauh lagi apakah embrio yang berkembang dianggap sebagai mahluk hidup.

• Penggunaan stem cell yang berasal dari surplus zigot pembuatan bayi tabung sendiri. juga menimbulkan kontroversi. Pendapat yang moderat mengatakan ketimbang surplus zigot itu dibuang, sebaiknya dipakai saja untuk penelitian. Sebaliknya ada juga yang berpendapat bahwa sisa itu harus dipelihara hingga zigot itu mati.

PENDAHULUAN

• Vaksin adalah suatu persiapan biologis yang meningkatkan kekebalan terhadap penyakit tertentu.

• Vaksin berisi agen yang menyerupai mikroorganisme penyebab penyakit, dan sering di buat dari bentuk-bentuk lemah atau membunuh mikroba tersebut.

• Agen perangsang sistem kekebalan tubuh untuk mengenali agen sebagai benda asing, menghancurkannya dan mengingatnya, sehingga sistem kekebalan tubuh dapat mengenali dan menghancurkan penyakit tersebut

Sejarah Penemuan Vaksin

• Ditemukan oleh seorang dokter Inggris Edward Jenner

• Adanya kepercayaan yang dianut petani dan wanita pemerah susu sapi, bahwa orang yang terhinggap penyakit “cacar sapi” tak akan tertimpa cacar lagi

• Mei 1796, Jenner menyuntik James Phipps, anak laki laki 8 tahun dengan cairan yang diambil dari bintik penyakit “cacar sapi” seorang pemerah susu

• Dan Hasilnya adalah, anak tersebut tertular dengan “cacar sapi” namun segera sembuh

• Beberapa minggu kemudian, Jenner menyuntikkan Phipps dengan serum cacar dan Phipps tidak menunjukkan tanda tanda penyakit cacar

• Jenner mempublikasikan usahanya melalui buku “An Inquiry Into the Causes and Effect of the Variolae Vaccinae” pada tahun 1798

KRITERIA VAKSIN IDEAL

• 100% efisien pada semua individu dengan beberapa usia

• Menyediakan proteksi berkepanjangan setelah pemberian pertama

• Tidak menimbulkan reaksi yang merugikan• Stabil dengan segala kondisi (suhu,

cahaya,transportasi)• Mudah digunakan• Tersedia dalam jumlah tidak terbatas• Harganya murah

Cara Kerja Vaksin•Kekebalan tubuh akibat vaksin dihasilkan setelah tubuh anda menerima suatu vaksin. Vaksin memicu kemampuan sistem kekebalan tubuh untuk menyerang suatu infeksi tanpa menghadapi penyakit yang disebabkan oleh kuman terlebih dahulu. •Vaksin terdiri dari kuman yang telah dibunuh ataupun kuman yang telah dilemahkan ataupun derivative of the infectious germ. Ketika diberikan kepada seseorang yang sehat, vaksin memicu reaksi dari sistem kekebalan tubuh. Vaksin membuat tubuh berfikir bahwa pada saat ini dirinya tengah diserang oleh organisme tertentu, dan sistem kekebalan tubuh segera bekerja untuk menghancurkan si ‘penyerang’ dan mencegah agar tidak terserang infeksi tersebut di kemudian hari •Jika tubuh terpapar oleh suatu jenis penyakit dimana tubuh telah divaksinasi sebelumnya, kuman penyebab penyakit akan dihadang dan dihancurkan oleh antibodi. Kekebalan yang terbentuk melalui vaksinasi serupa dengan kekebalan yang diperoleh akibat dari infeksi alami

•Ketika vaksinasi berlangsung, vaksin yang berasal dari virus, bakteri atau organisme yang telah mati maupun yang sudah dalam bentuk ‘aman’, disuntikkan ke dalam sistem (kiri).• Vaksin merangsang sistem kekebalan tubuh untuk memproduksi antibodi terhadap suatu organisme (tengah). •Kapanpun tubuh terserang oleh kuman ini setelah vaksinasi, antibodi pada sistem kekebalan tubuh menyerang dan menghentikan infeksi (kanan). •Beberapa dosis vaksin mungkin dibutuhkan untuk mencapai suatu reaksi kekebalan sepenuhnya. Sebagian orang gagal mencapai kekebalan penuh pada dosis yang pertama namun bereaksi pada dosis berikutnya. •Sebagai tambahan, kekebalan dari beberapa vaksin seperti tetanus dan pertusis, tidaklah berlangsung seumur hidup. Hal ini disebabkan karena reaksi kekebalan dapat berkurang sejalan dengan waktu, dan anda perlu memperoleh vaksin booster untuk mengembalikan ataupun meningkatkan kekebalan.

Namun seringkali vaksin juga menyebabkan berbagai efek samping yang merugikan, misalnya berikut ini:

a. Mikroorganisme yang digunakan untuk membuat vaksin mungkin masih melanjutkan proses produksi.

b. Mikroorganisme yang digunakan untuk membuat vaksin mungkin masih memiliki kemampuan menyebabkan penyakit.

c. ada sebagian orang yang memiliki reaksi terhadap sisa -sisa sel yang ditinggalkan dari produksi vaksin meskipun sudah dilakukan proses pemurnian.

d. Orang-orang yang bekerja dalam pembuatan vaksin mungkin bersentuhan dengan organisme berbahaya yang digunakan sebagai bahan pembuat vaksin meskipun sudah dicegah dengan pengaman (masker,sarung tangan).

Dengan adanya masalah-masalah di atas, maka pembuatan vaksin secara konvensional diubah menggunakanrekayasa genetika untuk membantu mengurangi resiko-resiko yang merugikan. Prinsip-prinsip rekayaasa genetika dalam pembuatan vaksin adalah sebagai berikut:

1. Mengisolasi (memisahkan) gen-gen dari organisme penyebab sakit yang berperan dalam menghasilkan antigen yang merangsang limfosit untuk menghasilkan antibodi.

2. Menyisipkan gen-gen diatas, ke tubuh organisme yang kurang patogen.

3. Mengkulturkan organisme hasil rekayasa, sehingga menghasilkan antigen dalam jumlah banyak.

4. Mengekstraksi antigen, lalu digunakan sebagai sebagai vaksin

Jenis Vaksin

1. Live Attenuated Vaccine

Vaksin hidup yang dibuat dari bakteri atau virus yang sudah dilemahkan daya virulensinya dengan cara kultur dan perlakuan yang berulang-ulang, namun masih mampu menimbulkan reaksi imunologi yang mirip dengan infeksi alamiah.

Contoh : vaksin polio (Sabin), vaksin MMR, vaksin TBC, vaksin demam tifoid, vaksin campak, gondongan, dan cacar air (varisela).

Sifat Vaksin Live Attenuated Vaccine• Vaksin dapat tumbuh dan berkembang biak sampai menimbulkan respon imun

sehingga diberikan dalam bentuk dosis kecil antigen

• Respon imun yang diberikan mirip dengan infeksi alamiah, tidak perlu dosis berganda

• Dipengaruhi oleh circulating antibody sehingga ada efek netralisasi jika waktu pemberiannya tidak tepat.

• Vaksin virus hidup dapat bermutasi menjadi bentuk patogenik

• Dapat menimbulkan penyakit yang serupa dengan infeksi alamiah

• Mempunyai kemampuan proteksi jangka panjang dengan keefektifan mencapai 95%

• Virus yang telah dilemahkan dapat bereplikasi di dalam tubuh, meningkatkan dosisi asli dan berperan sebagai imunisasi ulangan

2. Inactivated Vaccine (Killed Vaccine)

Vaksin dibuat dari bakteri atau virus yang dimatikan dengan zat kimia (formaldehid) atau dengan pemanasan, dapat berupa seluruh bagian dari bakteri atau virus, atau bagian dari bakteri atau virus atau toksoidnya saja.

Contoh : vaksin rabies, vaksin influenza, vaksin polio (Salk), vaksin pneumonia pneumokokal, vaksin kolera, vaksin pertusis, dan vaksin demam tifoid.

Sifat Killed Vaccine• Vaksin tidak dapat hidup sehingga seluruh dosis antigen dapat

dimasukkan dalam bentuk antigen• Respon imun yang timbul sebagian besar adalah humoral dan hanya

sedikit atau tidak menimbulkan imunitas seluler• Titer antibodi dapat menurun setelah beberapa waktu sehingga

diperlukan dosis ulangan, dosis pertama tidak menghasilkan imunitas protektif tetapi hanya memacu dan menyiapkan system imun, respon imunprotektif baru barumuncul setelah dosis kedua dan ketiga

• Tidak dipengaruhi oleh circulating antibody• Vaksin tidak dapat bermutasi menjadi bentuk patogenik• Tidak dapat menimbulkan penyakit yang serupa dengan infeksi

alamiah

3. Vaksin Toksoid

• Vaksin yang dibuat dari beberapa jenis bakteri yang menimbulkan penyakit dengan memasukkan racun dilemahkan ke dalam aliran darah. Bahan bersifat imunogenik yang dibuat dari toksin kuman.

• Hasil pembuatan bahan toksoid yang jadi disebut sebagai natural fluid plain toxoid yang mampu merangsang terbentuknya antibodi antitoksin. Imunisasi bakteri toksoid efektif selama satu tahun. Bahan ajuvan digunakan untuk memperlama rangsangan antigenik dan meningkatkan imunogenesitasnya.

• Contoh : Vaksin Difteri dan Tetanus

4. Vaksin Acellular dan Subunit

• Vaksin yang dibuat dari bagian tertentu dalam virus atau bakteri dengan melakukan kloning dari gen virus atau bakteri melalui rekombinasi DNA, vaksin vektor virus dan vaksin antiidiotipe.

• Contoh vaksin hepatitis B, Vaksin hemofilus influenza tipe b (Hib) dan vaksin Influenza.

5. Vaksin Idiotipe

• Vaksin yang dibuat berdasarkan sifat bahwa Fab (fragment antigen binding) dari antibodi yang dihasilkan oleh tiap klon sel B mengandung asam amino yang disebut sebagai idiotipe atau determinan idiotipe yang dapat bertindak sebagai antigen. Vaksin ini dapat menghambat pertumbuhan virus melalui netralisasai dan pemblokiran terhadap reseptor pre sel B.

6. Vaksin Rekombinan• Vaksin rekombinan memungkinkan produksi protein virus dalam

jumlah besar. Gen virus yang diinginkan diekspresikan dalam sel prokariot atau eukariot. Sistem ekspresi eukariot meliputi sel bakteri E.coli, yeast, dan baculovirus.

• Dengan teknologi DNA rekombinan selain dihasilkan vaksin protein juga dihasilkan vaksin DNA. Penggunaan virus sebagai vektor untuk membawa gen sebagai antigen pelindung dari virus lainnya, misalnya gen untuk antigen dari berbagai virus disatukan ke dalam genom dari virus vaksinia dan imunisasi hewan dengan vaksin bervektor ini menghasilkan respon antibodi yang baik.

• Susunan vaksin ini (misal hepatitis B) memerlukan epitop organisme yang patogen. Sintesis dari antigen vaksin tersebut melalui isolasi dan penentuan kode gen epitop bagi sel penerima vaksin.

7. Vaksin DNA (Plasmid DNA Vaccines)

• Vaksin dengan pendekatan baru dalam teknologi vaksin yang memiliki potensi dalam menginduksi imunitas seluler. Dalam vaksin DNA gen tertentu dari mikroba diklon ke dalam suatu plasmid bakteri yang direkayasa untuk meningkatkan ekspresi gen yang diinsersikan ke dalam sel mamalia. Setelah disuntikkan DNA plasmid akan menetap dalam nukleus sebagai episom, tidak berintegrasi kedalam DNA sel (kromosom), selanjutnya mensintesis antigen yang dikodenya.

• Selain itu vektor plasmid mengandung sekuens nukleotida yang bersifat imunostimulan yang akan menginduksi imunitas seluler. Vaksin ini berdasarkan isolasi DNA mikroba yang mengandung kode antigenyang patogen dan saat ini sedang dalam perkembangan penelitian. Hasil akhir penelitian pada binatang percobaan menunjukkan bahwa vaksin DNA (virus dan bakteri) merangsang respon humoral dan selular yang cukup kuat,sedangkan penelitian klinis pada manusia saat ini sedang dilakukan

Penyimpanan

Tergantung karakteristik spesifiknya, vaksin disimpan dalam solutio atau pada formulasi beku- dikeringkan, biasanya pada 2- 8° C. kestabilannya tergantung pada karakteristik fisika- kimia dari formulasi vaksin dan kondisi penyimpanan, biasanya dalam jangka waktu beberapa tahun.

REVIEW MATERI PRESENTASI

1. Insulin Rekombinan2. Antibodi Monoklonal

3. Terapi Gen4. Hormon pertumbuhan

5. Interleukin & Interferon6. Vaksin Rekombinan

1. Insulin Rekombinan

• Ekstraksi dan purifikasi insulin yg berasal dari babi dan sapi (thn 1921)

• Keterbatasan jumlah insulin yg diproduksi pankreas hewan, mendapatkan insulin yg murni, memperpanjang waktu kerja insulin, efek samping dari insulin hewan

• 1921-1980 usaha pengembangan proses produksi• Produksi insulin rekombinan dari Escherichia coli, gen

insulin manusia diklon kdlm sel Escherichia coli• Pertama kali digunakan insulin rekombinan manusia

(Humulin) sbg antidiabetes mellitus thn 1982

Perbedaan Gen insulin sapi, babi & manusia

• Perbedaan gen insulin babi dgn insulin manusia terletak pada Posisi rantai B30, dimana treonin B30 menjadi alanin B30

• Perbedaan gen Insulin sapi dgn insulin manusia; Berbeda 3 rantai yaitu treonin A8 menjadi alanin A8; isoleusin A10 menjadi valin A10; treonin B30 menjadi alanin B30

Struktur Insulin

Produksi Insulin Rekombinan

Yg harus diperhatikan :• 1. struktur gen penyandi insulin• 2.karakteristik insulin yg akan diproduksicontoh insulin rekombinan yaitu pada insulin lispro pada posisi rantai B28 & B29, dimana urutan prolin-lisin dibalik menjadi lisin prolin sehingga dpt meningkatkan kerja insulin lispro

Produksi Insulin Rekombinan

• Sintesis oligonukleotida yg sesuai dgn dgn sekuen nukelotida gen A & gen B, masing2 untai DNA gen A & gen B difusikan dgn operon laktosa yaitu promotor, operator & gen Lac Z yg menyandi β-galaktosidase pada plasmid pBR322 secara terpisah kemudian ditransfer dlm E coli

• Ekspresi operon laktosa akan menghasilakn protein β-galaktosidase & protein insulin A & insulin B yg saling terikat

• Protein gabungan dihidrolisa dn sianogen bromida utk memecah ikatan indulin dgn protein β-galaktosidase , akan diperoleh polipetida insulin A & B yg apabila difusikan akan mebentuk protein insulin

Skema produksi insulin rekombinan manusia secara rekayasa genetika

2.Antibodi monoklonal• Pertama kali dikembangkan Kohler dan

Milstein (1975), kemudian meraih nobel tahun 1985

• Hasil penggabungan 2 jenis sel yaitu sel limfosit B tunggal (monoklon) yg memproduksi antibodi dg sel kanker (mieloma) yaitu sel yg dpt hidup terus menerus

• Dapat diproduksi dlm jumlah besar sbg alat diagnostik, sistem penghantaran obat tepat sasaran (homing device), & terapi (imunoterapi)

Pembuatan antibodi monoklonal

Pembuatan antibodi monoklonal1. Imunisasi mencitAntigen brp protein/plisakaroda yg berasal dari bakteri/virus

disuntikan scr subkutan pada beberp tempat/ secara intra peritoneal

AtauDgn imunisasi langsung pada limpa utk mencegah eliminasi antigen

secara alami oleh tubuh 2. Fusi sel limpa kebal & sel mielomaUtk menciptakan sel hibrid yg terdiri dari gabungan sel limpa g dpt

membuat antibodi & sel mieloma yg dpt dibiakan scr terus menerus

3.Eliminasi sel induk yg tdk berfusiDg membiakan sel hibrid pada media SELEKTIF yg mengandung

Hypoxantin, Aminophterin, & Thymidin (HAT)4.Seleksi klon hibridomaHibridoma yg tumbuh diharapkan dpt dpt mensekresi antibodi kedlm

medium shg antibodi dapat diisolasi

Jenis-jenis antibodi monoklonal Generasi terbaru :

1. Antibodi monoklonal kimera,bagian variabel; molekul antibodi termasuk antigen binding site berasal dari mencit, sedangkan bagian lainnya berasal dari manusia (66%), ex: Rituximab

2.Antibodi monoklonal manusiawi (humanized), struktur molekul terdiri dari 90% protein manusia, ex: Alemtuzumab

3. Antibodi rekombinan manusiaantibodi paling ideal untuk menghindari terjadinya respon imun krn protein antibodi yg disuntikan kedlm tubuh seluruhnya (100%) berasal dari protein manusia, ex: Panitumumab

Struktur monoklonal antibodi rekombinan

Penggunaan antibodi monoklonal sbg antikanker

Terapi Gen

• Tujuan :1. Penggantian gen abnormal yg menyebabkan

kelainan genetik dgn gen normal2. Menghilangkan gen abnormal dgn

rekombinan homolog 3. Mengendalikan regulasi ekspresi gen

abnormal shg dpt dikendalikan dgn baik

Metode Terapi Gen

• 1. vektor viral– Digunakan adenovirus & retrovirus yg telah

dimanipulasi dgn menghilangkan gen virulensinya, utk mencegah timbulnya infeksi pada penerima terapi

2.Vektor non viral-liposom, plasmid DNA, & nanopartikel

Vektor Keuntungan Kekurangan

A.Non viral

Naked DNA Ease of production Low efficiency

No DNA size limitation Transient expression < 1 month

Liposome-DNA Ease of production Low efficienscy

No DNA size limitation Transient expression

Low immune reaction

b.Viral

Retrovirus Ease of production Transfer to dividing cells only

Efficient DNA transfer Random DNA integration

Stable expression DNA transfer size limited

Low immune reaction

Adenovirus Ease of production Host immune reaction

Efficient DNA transfer Transient expression

Transfer to non dividing cells

Adeno-associated Prolonged expression Difficult production

Transfer to non dividing cells Limited insert size <4,5 kb

Sistem penghantaran terapi

• 1. ex vivo, sel organ yg akan diterapi diisolasi terlebih dahulu & dibiakkan dlm lab. Setelah sel tumbuh secara invitro kemudian ditransfeksi dgn vektor viral yg mengandung gen normal

• 2.in vivo, vektor viral yg mengandung gen normal lgs disuntikan kedlm tubuh penderita agar dibawa oleh vektor utk masuk kedlm sel yg ingin diterapi

Contoh terapi Gen

• Penyakit defisiensi enzim ADA pada balita utk pematangan sel T yg berperan dlm imunitas

• Gen penyandi enzim ADA diklon dlm retrovirus kemudian ditransfeksikan pada sel T yg telah diisolas dari sel darah penderita.

• Setelah diseleksi, sel sel rekombinan disuntikan dlm tubuh penderita, diketahui populasi sel T meningkat sehingga menunjukkan enzim ADA telah dapat diproduksi

Metode Terapi Gen

Hormon pertumbuhan

• Berperan dalam lipolisis, stimulasi sintesis protein, & penghambatan metabolisme glukosa

• Pertama kali diisolasi & diidentifikasi akhit thn 1950-andai kelenjar pituitari org yg mengalami hipofisektomi

• Rekayasa hormon pertumbuhan berasal dari cDNA yg dibuat dari mRNA dgn bantuan enzim reverse transkriptase

Proses rekayasaHormon Pertumbuhan

cDNA + plasmid vektor bakteri

Transformasi sel E coli

Purifikasi hormon

pertumbuhan

Lisis lapisan membran luar

sel bakteri

Produk2 hormon pertumbuhan

1. Humatrope2. Nutropin3. Somatonorm4. Protropin5. Genotropin6. Norditropin7. Biotropin

Interferon & Interleukin

Interferon= glikoprotein yg termasuk dalam gol. Sitokin

Terdapat 3 kelas interferon berdasarkan sumbernya :

1. Interferon α ; sumber utama leukosit2. Interferon β ; sumber utama sel fibroblas3. Interferon γ ; sumber utama sel limfosit T

Aktivitas interferon

• Pelepasan interferon oleh sel yg terinfeksi virus dpt mencegah infeksi virus pada sel-sel lain disekitarnya.

Aplikasi :• Hepatitis B, & C, leukimia, dan melanoma

ganas, imunomodulator

Produk2 Interferon α rekombinan

1. Interferon α-2a rekombinan manusia (Roferon-A)merupakan protein non-glikosilasi, yg terdiri dari 165 AA, dimana rantai ke-23 mengandung lisin, menggunakan E coli

2. Interferon α-2a rekombinan manusia (Intron) merupakan protein non-glikosilasi terdiri dari 165 AA, dimana rantai ke-23 mengandung arginin

Interferon β rekombinan

• Bersifat spesifik, aktivitas akan muncul setelah berikatan dgn suatu reseptor sel yg spesifik

• Thn 1996, FDA telah menyetujui penggunaan Avonex utk pengobatan sklerosis multipel

Interferon γ rekombinan

• Aktivitasnya lebih lemah dari interferon α tetapi daya fagositosisnya lebih baik dari interferon-α & interferon-β

• Actimune merupakan salah satu yg produk secara rekayasa genetika menggunakan E coli, mengandung 140 AA, bekerja melalui peningkatan fungsi fagositosis sel granulosit utk mengeliminasi sel patogen tg telah difagositosis

Interleukin Rekombinan

• Termasuk gol sitokin, yaitu glikoprotein yg terlarut yg diproduksi oleh berbagai jenis sel, dan berfungsi sbg mediator antar sel pada sistem imun , sistem darah & sistem saraf

• Interleukin-2 (IL2) pertama kali dibuat secara rekayasa genetika

• IL2 berfungsi sebagai faktor pertumbuhan sel T, serta memiliki efek langsung terhadap kekebalan sekaligus mengaktivasi sitokin lain, seperti faktor nekrosis tumor, IL-1, interferon dan granulosit makrofag

Pembuatan Interleukin Rekombinan

Isolasi & identifikasi IL-2 endogen

Sekuensing DNA

Sisipkan kedlm vektor plasmid

Transformasi dl sistem ekspresi

Vaksin

• Vaksin Konvensional = vaksin generasi I & II• Vaksin Rekombinan = vaksin generasi III• Sel-sel tubuh yg berperan----------sel leukosit• Sel limfosit• 1. Sel B ; memproduksi antibodi yg dpt

mengenali & mencegah terjadinya infeksi• 2. Sel T-sitotoksik ; memusnahkan sel yg

terinfeksi /sel2 abnormal dg cara melepaskan zat yg brsifat toksik atau memicu apoptosis

Vaksin rekombinan

• Dikenal sebagai vaksin sub unit/vaksin generasi III, mengandung fragmen antigenik mikroorganisme yg dpt merangsang respon imun

• Ex: vaksin hepatitis B mengandung bagian protein selubung virus yg diproduksi secara rekaysa genetika oleh sel ragi

• Vaksin ini aman digunakan karena fragmen antigenik yg terdapat dlm vaksin rekombinan tdk dapat bereproduksi dlm tubuh penerima, serta tdk menimbulkan efek samping

Beberapa vaksin rekombinan yg telah diproduksi secara komersial dlm mikroorganisme

Nama Produk Nama Dagang Jamur Rekombinan

Vaksin Hepatitis B AgB H.Polymorpha

Biovac-B H.Polymorpha

Butan NG H.Polymorpha

Engeric B S.Cerevisiae

Gene Vac-B H.Polymorpha

Enivac-HB P.Pastoris

Vaksin multivalen Infanrixhexa (HB+HIB+Polio+DPT)

S.Cerevisiae

Vaksin HPV Gardasil S.Cerevisiae

Cara memproduksi vaksin rekombinan1. Kloning gen yg mengkode protein antigenik tertentu

kdlm suatu vektor ekspresi, kemudian ditransfer kedlm sistem ekspresi dan dikultivasi. Protein yg disekresi pada kultur sel diekstraksi & dimurnikan kemudian diformulasi

2. Menggunakan virus vaccinia sbg vektor hidupvirus tsb amna & tdk berbahaya bagi manusia. Jika gen yg menyandi protein imunogenik pada selubung virus tertentu misalnya selubung virus hepatitis B disambung dgn genom virus vaccinia dibawah kendali promotor , maka gen asing dpt mengekspreskan protein yg bersifat antigenik

3.Pembuatan peptida rekombinan.

komponen antigenik partikel virus/bakteri dpt dikurangi /dipotong sedemikian rupa menjadi segmen protein pendek/peptida yg masih memiliki kemampuan tuk merangsang sistem imunitas tubuh. Segmen DNA yg menjadi rantai peptida diklon kdlm suatu vektor plasmid kemudian ditransfer kdlm sistem ekspresi & dikultivasi utk mendapatkan peptida rekombinan

Konstruksi virus vaccinia rekombinan sbg vektor pembawa antigen

Sel hospes yg digunakan

1. Sel jamur ;- Hansenula polymorpha,- Pichia pastoris, -Saccharomyces cerevisiae

2.Sel mamalia ; -Chinese Hamster Ovary

Vaksin DNA

• Mengandung 1 gen/lebih yg diisolasi dari virus yg mengkode ekspresi dari protein inti virus/protein selubung virus

• Struktur & elemen genetik terdiri dari 2 unit utama, yaitu :1. Unit propagasi plasmid; pengendali replikasi &

perbanyakan plasmid secara invitro sesuai volume & jumlah yg diinginkan

2. Fragmen DNA yg mengandung gen plasmid yg telah dikloning kedlm plasmid DNA, diharapkan dpt mengekspresikan protein asing dl sel hospes

Mekanisme kerja Vaksin DNA

• melalui jalur Kompleks Histokompatibilitas Utama (MHC-I) atau MHC-II, selain itu protein asing juga dapat masuk langsung kedalam sel dendritik sehingga dapat merangsang sistem imun selular dan untuk merangsang sistem imun humoral.

Keuntungan Vaksin DNA

1. Merangsang sistem imunitas selular & humoral2. Plasmid DNA dpt diproduksi dlm jumlah besar dlm

waktu singkat3. DNA sangat stabil tahan terhadap perubahan suhu

shg lebih mudah disimpan & didistribusikan4. Sekuen DNA dpt dimodifikasi sehingga dpt

disesuaikan dgn mikroorganisme patogen5. Dapat direkayasa dgn gabungan beberapa plasmid

shg mempunyai spekerum luas terhadap epitop antigen

6. Aman digunakan oleh manusia

Vaksin Kanker

• Mengaktivasi sel B & sel T-sitotoksik utk mengenali & bekerja terhdap sel kanker tertentu

• SISTEM IMUN tdk dapat mengenali sel kanker sbg suatu substansi asing sehingga sistem imun tdk melakukan serangan terhadap sel kanker.Hal tsb diakibatkan :

• 1.sel kanker terdiri dari senyawa self antigens & nonself antigens yg sering mengalami mutasi genetik

• 2.memproduksi senyawa kimia yg dpt mneghambat respon imun sel T-sitotoksik

,

Vaksin kanker propilaktik

• mencegah terjadinya penyakit kanker yg disebabkan oleh mikroorganisme

• Tujuan : merangsang produksi antibodi netralisasi yg dpt menghambat infeksi virus yg menyebabkan timblnya sel kanker atau utk mengeliminasi sel sel yg abnormal dg cara meningkatkan respon imun seluler

Contoh Vaksin kanker propilaktik

1.Gardasil-Thn 2008, Gardasil yg diproduksi dari rekayasa

protein telah disetujui penggunaan dlm pencegahan kanker vulva & kanker vagina

-merangsang antibodi thp HPV tipe 6,11,16,18 -disuntikan i.m pada wanita 9-26 tahun, lama

proteksi vaksin diperkirakn sampai 5 tahun

• 2.Cervarix-merangsang HPV tipe 16 7 18-mengurangi resiko kanker serviks, kanker

vagina. Kanker vulva, kanker anus, kanker penis & orofaring

3.Vaksin HBV-merupakan virus hepatitis B yg telah digunakan

diseluruh dunia-Diberikan setelah bayi dilahirkan utk

mengurangi insidensi kanker hati

Vaksin kanker terapetik

• mengobati penyakit kanker & meningkatkan daya tahan tubuh

• menggunakan antigen yg berasal dari sel kanker atau dpt berasal dari sel2 kanker yg telah dilemahkan atau dimatikan yg mengandung Cancer-associated antigens , berupa senyawa karbohidrat, glikoprotein, & gangliosida.

Contoh Vaksin kanker terapetik

• Vaksin HPV, ditujukan menghambat onkoprotein E6 & E7, sehingga mampu menghntikan pertumbuhan kembali sel kanker yg disebabkan oleh HPV