I. Pendahuluan

I. PENDAHULUAN

A. Judul PraktikumHPLC (High Performance Liquid Chromatography)

B. Tujuan Praktikum1. Mempelajari prinsip kerja HPLC2. Menghitung konsentrasi suatu senyawa dalam sampel parasetamol dengan menggunakan metode regresi linear

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi merupakan metode pemisahan fisik yang komponen komponennya dipisahkan dan didistribusikan antara dua fase. Salah satu fase tersebut merupakan lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner (Day dan Underwood, 2002). High Performance Liquid Chromatography atau disingkat HPLC merupakan kromatografi cair yang dilakukan dengan menggunakan fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju yang terkendali memakai tekanan tinggi. Pemisahan yang dihasilkan dari HPLC memiliki resolusi tinggi dan waktunya singkat (Khopkar, 2003). Analisis menggunakan HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan untuk analisis kualitatif serta kuantitatif. Prinsip dasar dari HPLC yaitu pemisahan komponen berdasarkan kepolaran komponen tersebut sedangkan prinsip kerja dari alat HPLC yaitu sampel yang diuji diinjeksikan ke dalam kolom kemudian sampel akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) berdasarkan afinitasnya. Yang membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya yaitu menggunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase gerak (Mcmaster, 2007). Kelebihan dari penggunaan HPLC yaitu waktu analisisnya cepat, volume sampel yang dipelukan sedikit, memiliki sensitivitas atau kepekaan yang tinggi, kolom dapat digunakan kembali, resolusi yang dihasilkan baik dan dapat digunakan untuk analisis sampel organik ataupun anorganik (Sabrina, dkk., 2012). Kekurangan dari penggunaan HPLC yaitu harga alatnya mahal, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi, dan larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu (Meyer, 2004).Komponen-komponen utama yang terdapat dalam HPLC menurut Adnan (1997) terdiri dari :1. Reservoir pelarutMerupakan zat pelarut yang polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis.2. PompaDigunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan tinggi dan tekanan yang tetap.3. Injektor Digunakan untuk memasukkan sampel ke dalam kolom agar pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat menggunakan syringe.4. Kolom kromatografiKolom dengan panjang 10-25 cm dan diameter 4,5 5 mm yang berisi fase stasioner berukuran 5-10 mikrometer dan dapat terbuat dari logam atau stainless steel.5. DetektorDigunakan untuk mendeteksi sampel. Syarat dari detektor yaitu memiliki sensitivitas tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi. Detektor yang biasa digunakan yaitu detektor UV-vis karena sensitivitasnya yang tinggi.HPLC dapat dibedakan berdasarkan fasenya, yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal menggunakan fase diam yang lebih polar dibanding fase geraknya, sedangkan fase terbalik menggunakan fase diam yang kurang polar dibanding fase geraknya. Fase gerak yang biasa digunakan pada fase terbalik yaitu campuran larutan buffer dengan metanol dan campuran air dengan asetonitril, sedangkan pada fase normal yaitu campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorisasi atau pelarut jenis alkohol (Meyer, 2004).Fase diam yang biasa digunakan yaitu silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer stiren dan divinil benzen. Silika yang tidak dimodifikasi dapat menyebabkan waktu retensi yang bervariasi disebabkan adanya kandungan air yang digunakan. Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan oleh analit dari awal kolom sampai menuju detektor. Waktu retensi bergantung pada tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi yang tepat dari pelarut dan temperatur pada kolom (Meyer, 2004). HPLC sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa aktif obat dan memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran (Gandjar dan Rohman, 2007).Parasetamol atau asetaminofen (C8H9NO2) merupakan obat yang bersifat analgesik dan antipiretik yang digunakan untuk meredakan sakit kepala, sakit ringan, dan demam. Parasetamol merupakan derivat dari asetanilida, derivat dari fenasetin yang dahulu banyak digunakan sebagai analgetikum. Parasetamol sekarang ini dianggap sebagai zat antinyeri yang aman untuk pengobatan sendiri (Tjay dan Rahardja, 2008).

Gambar 1. Struktur Parasetamol (Moffat, dkk., 2005). Metanol atau disebut juga metil alkohol atau spiritus merupakan bentuk alkohol paling sederhana dengan rumus kimia CH3OH. Metanol dalam keadaan atmosfer berbentuk cairan yang ringan, mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar dan beracun dengan bau yang khas. Metanol dapat digunakan sebagai pendingin anti beku, bahan bakar dan bahan aditif bagi etanol industri (Vieville, dkk., 1993).

III. METODE

A. Alata. Alat yang digunakan dalam praktikum ini corong, Erlenmeyer, gelas beker, HPLC Shimadzu, labu ukur 100 ml, lumpang porselin, mortar, pipet ukur, propipet, rak tabung reaksi, sendok, suntikan, syringe, timbangan, dan vortex. b. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini aquadest, kertas saring, label, membrane Sartorius, methanol (CH3OH), parasetamol, dan tisu.

B. Cara KerjaParasetamol sebanyak 1 butir digerus sampai halus

Diambil hasil gerusan tersebut sebanyak 0,1 gram dan dimasukkan dalam labu ukur

Ditambahkan metanol (CH3OH) hingga tanda batas labu ukur

Larutan tersebut diaduk dan disaring dengan kertas saringDisaring kembali larutan tersebut dengan membran sartorius mess 0,2 mLarutan yang telah disaring diencerkan dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 ppmMasing-masing larutan tersebut diinjeksikan ke HPLC sebanyak 0,2 mlKurva hasil dari HPLC dibuat dan dicari konsentrasi sampel

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HasilTabel 1. Hasil Metode Regresi Tinggi AreaKonsentrasiy (tinggi)x2xy

10246.3111x1022.463.110

20241.9464x1024.838.920

30793.3479x10223.800.410

40639.11516x10225.564.600

50600.45225x10230.022.600

= 30504234,211x1021.7337.928

Tabel 2. Hasil Metode Regresi Luas AreaKonsentrasiy (luas)x2xy

106.305.5651x10263.055.650

206.303.0204x102126.060.400

3020.974.9929x102629.249.760

4016.669.16016x102666.766.400

5014.685.53825x102734.276.900

= 3012.987.65511x102443.881.822

Tabel 3. Hasil CuplikanSampelTinggiLuasWaktu Retensi

Kelompok 313520873456703227900

B. PembahasanHPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan kromatografi cair yang dilakukan dengan menggunakan fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju yang terkendali memakai tekanan tinggi. Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen berdasarkan kepolarannya. Prinsip kerja alat HPLC adalah sampel yang diinjeksikan ke kolom akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) berdasarkan afinitasnya. Cara kerja dari HPLC yaitu pertama memasukkan atau menginjeksikan sampel menggunakan syringe. Dengan bantuan pompa bertekanan tinggi, fase gerak cair dialirkan dari kolom ke detektor. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut terhadap fase diam. Solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sedangkan solut yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.Dalam praktikum ini digunakan pula beberapa alat seperti kertas saring dan membran sartorius. Kertas saring berfungsi untuk menyaring suspensi dalam campuran metanol dengan parasetamol. Hasil saringan tersebut disaring kembali dengan membran sartorius agar hasil saringan lebih akurat karena membran sartorius menyaring dengan ukuran mikro (mikrofilter).Bahan yang juga digunakan pada praktikum ini yaitu metanol dan parasetamol. Metanol disini berfungsi sebagai fase gerak yang bersifat polar. Parasetamol digunakan sebagai sampel yang akan diuji konsentrasi senyawanya. Parasetamol digunakan karena bersifat polar dan memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap sinar UV, dimana detektor yang biasa digunakan adalah detektor UV-vis sehingga sesuai untuk analisis dengan HPLC. Penggunaan parasetamol juga disebabkan karena telah diketahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusinya.Alat HPLC yang digunakan menggunakan fase diam berupa diatom dan fase gerak berupa metanol. Diatom bersifat non polar sedangkan metanol bersifat fase gerak. Hal ini menunjukkan fase yang digunakan pada HPLC ini yaitu fase terbalik, dimana fase diamnya kurang polar (non polar) dibanding fase geraknya (polar).Dari hasil praktikum ini pada tabel 1 didapatkan tinggi puncak pada konsentrasi standar 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm secara berturut-turut yaitu 246.311, 241.946, 793.347, 639.115, dan 600.452. Pada tabel 2 didapatkan luas area pada konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm secara berturut-turut yaitu 6.305.565, 6.303.020, 20.974.992, 16.669.160, dan 14.685.538. Dapat dilihat peningkatan konsentrasi larutan tidak sebanding dengan besarnya nilai tinggi dan luas area puncak. Dari perhitungan didapatkan konsentrasi parasetamol berdasar perhitungan regresi tinggi area yaitu 86,43 ppm, sedangkan berdasarkan perhitungan regresi luas area yaitu 86,37.

V. KESIMPULAN

Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat ditarik beberapa kesimpulan, yaitu :1. Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen berdasarkan kepolarannya. Prinsip kerja alat HPLC adalah sampel yang diinjeksikan ke kolom akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) berdasarkan afinitasnya. 2. Konsentrasi senyawa dalam parasetamol yang didapatkan berdasarkan perhitungan yaitu berdasarkan tinggi sebesar 86,43 ppm dan berdasarkan luas area sebesar 86,37

DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A., dan Underwood, A.L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi Keenam. Penerbit Erlangga, Jakarta. Gandjar, I.G., dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Meyer, F.R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography. 4th Edition. John Wiley & Sons, Inc., New York.Mcmaster, M.C. 2007. HPLC A Practical Users Guide. John Wiley & Sons, Inc., New York.Moffat, A.C., Osselton, M.D., dan Widdop, B. 2005. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons. Third Edition. Pharmaceutical Press, London.Sabrina, A., Wonorahardjo, S., dan Zakia, N. Perbandingan Metode Spektrofotometri UV-Vis dan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) pada Analisis Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Teh Kemasan. Jurnal Online Universitas Malang. 1(1) : 1-12.Tjay, T.H., dan Rahardja, K. 2002. Obat-Obat Penting : Khasiat, Penggunaan, dan Efek-Efek Sampingnya. Edisi Keempat. Penerbit PT. Elex Media Komputindo, Jakarta.Vieville, C., Moulooungui, Z., dan Gaset, A. 1993. Etherification of Oleic Acid by Methanol Catalyzed by p-Toluenesulfonic and the Cation-exchange Resin K2411 and K1481 Supercritical Carbon Dioxide. Industrial Engineering Chemical Research. Volume 32: 2065-2068.

LAMPIRAN