Risalah Semmar Ilmiah Peneli/ian don Pengembangan Aplikasi ls%p daD Radiasi, 2004

UJI PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) UNTUK DETEKSIVIRUS HEPATITIS C.

Lina, M,R,., Budiman Bela.., dan Dadang S,..Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, BATAN, Jakarta,

..Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta.

ABSTRAK

UJI PCR {POLYMERASE CHAIN REACTION} UNTUK DETEKSI VIRUS HEPATITISC. Telah dilakukan penelitian uji teknik PCR untuk mendeteksi adanya virus hepatitis C dalamserum darah. Jumlah sampel serum darah yang digunakan adalah 50 buah berasal darilaboratorium rumah sakit RSCM clan laboratorium PMI. Perlakuan awal sampel untukmengekstraksi RNA virus dilaksanakan dengan metoda BOOM yaitu menggunakan guanidintiosianat untuk lisis sel virus clan diatom untuk mengikat RNA virus. Proses reverse transcriptionuntuk mensintesis cDNA yang berasal dari RNA virus basil ekstraksi serum darah, dilakukandengan menggunakan enzim reverse transcriptase clan RNA-se inhibitor. Amplifikasi cDNAdilaksanakan dengan teknik PCR (nested PCR) yaitu dilakukan 2 kali proses PCR untuk tiapsampel dengan menggunakan 2 pasang primer oligonukleotida. Hasil amplifikasi dari proses PCRdideteksi dengan teknik elektroforesis gel agarosa clan pewarnaan etidium bromida, selanjutnyadivisualisasi menggunakan UV transilluminator. Dari 50 buah sampel serum darah yang diteliti,menunjukkan adanya virus hepatitis C dalam 13 sampel serum yang dinyatakan dengan adanyapita DNA spesifik pada gel agarosa.

ABSTRACT

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ASSAY TO DETECT HEPATITIS CVIRUS. Research on the detection of hepatitis C virus in blood serum using PCR technique hasbeen carried out. Amount of 50 blood serum from laboratory of Indonesia Red Cross (PalangMerah Indonesia -PMI! and RSCM hospital as samples, were used in this research. Lysis ofvirus cell and extraction of RNA virus as a preliminary treatment of the sample, was done withBOOM method using guanidine thiocyanate and diatomaceous earth, respectively. Syntesis ofcDNA from RNA as an extraction product mentioned above, was carried out by means ofreverse-transciptase and RNA-se inhibitor. Amplication of cDNA was done with nested PCRtechnique that was performed with two times PCR processes using two pairs of oligonucleotideprimers for each process. The amplified DNA was detected by agarose gel electhrophoresis andethidium bromide staining. Subsequently, the DNA was visualized with UV transilluminator.Result shows that of 50 blood serum samples, 13 serum were positive for RNA HCV that wereperformed with the present of spesific DNA band on agarose gel.

keterkaitan infeksi HCV dengan kanker hati.Daya penularan penyakit ini sangat tinggiterutama di negara berkembang clan padatpenduduknya termasuk Indonesia. Saat iniprevalensi hepatitis C diantara donor darahbervariasi antara 0,1 -0,3% di Eropa Barat clanAmerika Utara sedangkan di Jepang sampai1,2%. Hal ini dikemukakan oleh ALTER dalamWIDJAJA (7), sedangkan menurutBUDIHUSODO dkk. (9), prevalensi di Indonesia0,5 -3,4% (9). Salah satu faktor penularan HCVantara lain adalah daTi organ maupun jaringanyang terinfeksi HCV yang ditransplantasikan(10, 11,12) Hasil penelitian PEREIRA dkk (10)menyatakan prevalensi anti HCV dalam donordarahjenazah adalah 1,8% (13 daTi 716 donor).

PENDAHULUAN

Virus hepatitis C (HCV) ditemukan padatahun 1989 dan merupakan penyebab utamahepatitis non A non B pasca transfusi (1, 2).Virus ini dapat menyebabkan penyakit liver akut,kronik, sirosis hati yang berpotensi menjadikanker hati I(hepatocellular carcinoma /HCC) (3, 4,51. Pada umumnya infeksi HCV menunjukkangejala ringan bahkan ada pengidap yang tidakmenunjukkan gejala, meskipun demikian 50%daTi individu yang terinfeksi terlihat berkembangmenjadi hepatitis kronik, dan 20% menjadisirosis 16). Menurut COLOMBO dkk, NISHIOKAdkk, dan KHAN dkk yang dikutip oleh WIDJAJA(7) dan BRUIX 18), mengemukakan adanya

Risalah Seminar I/miah Peoelitian daD Pengembangan Aplikasi [salop daD Radilsi 2004

Pada transplantasi jaringan biologi, faktor-faktor penyebab penyakit setelah transplantasiantara lain karena infeksi kuman clan virus.Oleh karenanya, jaringan biologi tersebut yangberasal daTi donor hidup maupun jenazah, harusbebas daTi kuman penyakit clan virus sepertiHBV, HCV, clan HIV.

Oalam perkembangan Bank ]aringan diIndonesia khususnya Bank ]aringan Riset Batan,sangat diperlukan penelitian sehubungan denganpenyediaan jaringan biologi berkualitas tinggi(13) Penelitian yang sangat perlu dilaksanakanadalah deteksi ageD penyebab penyakitkhususnya virus (HBV, HCV, HIVI daTi donororgan maupun jaringan melalui pemeriksaandarahnya. Oeteksi yang biasa dilakukan untukmengetahui adanya infeksi virus adalah denganpenanda serologi. Pada infeksi HCV, diagnosisdidasarkan pada adanya anti HCV dalam serumdarah, menggunakan teknik ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) yang dapatdilanjutkan dengan teknik RIBA (RecombinantImmunoblot Assay) untuk meningkatkanspesifikasi (3, 14) Cara deteksi yang lebih sensitifclan spesifik adalah dengan mendeteksi RN AHCV dengan teknik RT -PCR (ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction) (6, 10,14, 15, 16). Metode ini sangat penting terutamapada window period, peri ode dimana telah terjadiinfeksi HCV tetapi antibodi belumterbentuk/terdeteksi. Oleh karenanya PCRmerupakan metode diagnostik standar untukinfeksi HCV kronik maupun akut misalnya padapasien yang immunosupressed seperti resipientransplantasi ginjal.

BAHAN DAN METODE

Ekstraksi RNA HCV daTi Serum Darah.Serum darah yang digunakan berjumlah 50terdiri daTi 25 serum darah daTi laboratoriumrumah sakit Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo(RSCMj yang telah dideteksi dengan basil RNApositif secara kuantitatif. Dua puluh lima serumdarah yang lain berasal daTi laboratorium PalangMerah Indonesia terdiri daTi 20 serum positif clan5 serum negatif HCV berdasarkan basil deteksisecara serologi menggunakan teknik ELISA.Metode yang digunakan untuk ekstraksi RNAserum tersebut di at as adalah metode BOOMmenggunakan bUreT lisis yang terdiri daTi larutanguanidin tiosianat, Tris -HCI, EDTA clan tritonX 100 (bufer lisis L6 clan bUreT pencuci L2j.Sampel darah ditambah dengan bUreT lisis L6 clanlarutan diatom kemudian divorteks, digoyangclan diinkubasi kemudian disentrifugasi 12.000rpm. Selanjutnya dicuci dengan bUreT pencuciL2 clan diendapkan dengan etanol 70% clan

aseton. Pelet dikeringkan dalam waterbath padasuhu 56°C 10 menit, kemudian ditambah larutanTE, divortex clan diinkubasi pada suhu clanwaktu yang sarna, kemudian disentrifugasi pada12.000 rpm. Supernatan yang mengandung RNAHCV dipisahkan yang selanjutnya akandigunakan pada proses reverse transkripsi untukpembuatan cDNA.

Proses Reverse Transkripsi. RNA yangdiperoleh diinkubasi pada 56°C selama 10 menitlalu secepatnya dimasukkan ke dalam es. Darilarutan tersebut diatas diambil 5~1 dimasukkanke dalam 20 ~l campuran pereaksi untuk prosesreverse transkripsi yang terdiri daTi Ix larutanbufer, 200 unit Moloney Murine Leukemia VirusReverse Transcriptase (MMLV-R7'), 30 unit RNA -se inhibitor, 80 pmol random primer, 0.5 mMmasing-masing dNTP, 10 mM larutanditiothreitol clan air DEPC. Sintesis cDNAdilakukan dengan menginkubasi campurantersebut di atas pada suhu 3~C selama satu jamclan kemudian dipanaskan pada air mendidihselama satu menit.

Proses Amplifikasi DNA. Proses Amplifikasidilakukan dengan metode nested PCRmenggunakan 2 pasang primer yang didesain daTi5' Non Coding Region (NCR). Campuran pereaksiPCR pertama terdiri daTi 5 ~l larutan cDNA, 50pmol masing-msing primer dengan sekwens yangtelah dipublikasi oleh HOUGHTON yang dikutipoleh WIDJAJA (7) (5'CCACCATAGATCTCTCCCCTGT) clan (5'ATACTCGAGGT GCACGGTCTACGA), 0.2 mMmasing-masing dNTP, 3 unit Taq polymerase, Ixbufer PCR , 2,5 mM MgClz clan 0,01 % gelatin.Jumlah siklus yang dipakai adalah 35 siklusdengan tahap denaturasi 96°C 30 detik, annealing48°C 45 detik, extension noc 60 detik clanextended extension noc 6 menit. Proses PCRyang kedua dilakukan dengan mencampur 2 ~lbasil PCR yang pertama dengan campuranpereaksi seperti pada proses PCR pertama. Primer

oligonukleotida yang digunakan(5'AGATCTrCACGAAGAAAAGCGT) clan(5'CACTCTCGAGCACCCT A TCAGGCAGT).Jumlah siklus yang dipakai 30 siklus dengankondisi PCR sarna dengan proses PCR pertama.

Deteksi DNA Hasil Amplifikasi. FragmenDNA basil proses PCR setelah ditambah denganloading bufer dianalisis dengan teknikelektroforesis gel agarosa dengan konsentrasiagarosa sebesar 1,5% (b/v). Proses elektroforesisdilakukan dalam bufer TBE (Tris-Borat-EDTAjdengan voltase konstan (100 V). Visualisasi DNAyang telah dielektroforesis, dilakukan denganmewarnai gel dengan larutan etidium bromidaclan memaparkan gel di bawah UVtransilluminator. Penentuan ukuran berat

Risalah Seminar Ilmiah Penelitian don Pengembangan Aplikasi lsotop don Radiasi 2{XJ4

molekul fragmen DNA basil amplifikasidilakukan dengan menggunakan penanda be ratmolekul (marker! Hae III 0X174.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil proses PCR clan deteksinyamenggunakan elektroforesis gel agarosa (PCRkualitatif), menunjukkan hanya 5 sampel yangpositif HCV daTi 25 serum darah yang diperolehdaTi laboratorium RSCM (Tabel 1). Sampelterse but telah dideteksi sebelumnya dengan basilRNA HCV positif secara kuantitatif menggunakankit komersial. Hal ini mungkin disebabkanproses ekstraksi RNA, primer oligonukleotida clancara deteksi produk PCR yang digunakanlaboratorium terse but sensitivitasnya lebih tinggidaripada yang digunakan dalam penelitian ini.CHA e.t aI. (17), menyatakan banyak faktorberperan dalam proses RT-PCR, seperti misalnyaintegritas RNA selama proses isolasi/ekstraksitergantung pada efisiensi inhibitor RNAse dalam

Tabell. Hasil deteksi HCV dari sampel darahberasal dari Rumah Sakit CiptoMangunkusumo

Kade

Sampel

Deteksidengan PCRKuantitatif

Deteksidengan PCR

Kualitatif

PositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositifPositif

Positif

NegatifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifPositifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifPositifPositifPositifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatifNegatif

2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.

sampel serum. Faktor lain yang lebih pentingadalah desain primer sangat mempengaruhiefisiensi proses amplifikasi PCR. Dalampenelitiannya dinyatakan beberapa sampel serumyang positif HCV dengan menggunakan primeryang dirancang daTi daerah 5-UT hasilnya negatifdengan pasangan primer lain. Menurut HOSODA(15), yang mengemukakan juga bahwa seleksilokasi primer sangat penting untuk deteksi HCVdengan PCR Berdasarkan basil penelitiannyamenggunakan primer daTi nonstructural regiongenom HCV untuk proses PCR, RNA HCV yangterdeteksi pacta pasien dengan DonA nonBhepatitis kronik hanya 60%, sedangkan denganmenggunakan primer daTi noncoding region, RNAHCV yang terdeteksi -95%. Kemungkinan laindaTi basil terse but di atas, sampel serum tersebuttelah lama disimpan dalam suhu atau temp atyang tidak sesuai sehingga mempengaruhi virusdi dalamnya terutama RNA virus. Dalam uji RT-PCR secara kualitatif seperti yang digunakandalam penelitian ini, hal penting yang perludiperhatikan adalah penyimpanan spesimen ,penanganan spesimen, daD inhibitor dalam prosesPCR (18).

Dari 20 sampel serum yang diperoleh daTilaboratorium PMI dengan anti HCV positif secaraserologi menggunakan teknik ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) menunjukkanhanya 7 sampel yang positif HCV dengan teknikyang digunakan dalam penelitian ini (Tabel 2).Untuk kasus seperti ini dapat berarti adanyasuatu infeksi di masa lamp au ataukemungkinan adanya intermitten virenia daD jugakarena adanya pola awal viremia yang terlambat(14, 19). Tabel 2 juga menunjukkan basil positifHCV untuk 1 sampel dengan metode PCRkualitatif yang dilakukan dalam penelitian ini.Sampel tersebut adalah salah satu sampeldiantara 5 buah sampel serum yang negatif HCVsecara serologi digunakan sebagai pembandingyang berasal daTi laboratorium PMI.

Kasus seperti ini telah ditemukan pactapenderita-penderita dengan hepatitis menahundaD donor darah (post transfusional hepatitis) (14).Viremia dapat terdeteksi dengan adanya antiHCVI antibodi spesifik dengan met ode serologi.Namun, antibodi tersebut terbentuk dalamperiode waktu tertentu setelah terjadi infeksi.,tergantung daTi respon immune daTi pasien (7).Menurut CHIEN .e.t al yang dikutip olehHOUGHTON (4!, serokonversi anti HCV setelahinfeksi adalah 7 sampai 31 minggu. .Periodewaktu antara terdeteksinya antibodi denganinfeksi HCV adalah 12 minggu (3), daD 15minggu (201. Hasil penelitian GARSON -e.1 al(19}, menunjukkan antibodi HCV tidak terdeteksisampai 18 minggu dengan protein C100 HCV,tetapi RNA HCV dengan teknik PCR dapat

Risa/ah Seminar I/miah Penelilian dan Pengembangan Aplikasi lsalop dan Radia~ 2tXJ4

dideteksi dalam 4 minggu. Peri ode dimanaantibodi belum terbentuk atau belum cukupuntuk dideteksi dengan teknik yang tersedia,akan tetapi sudah terjadi infeksi virus dikenaldengan window phase/period .Kasus semacam inijuga dapat terjadi pada pengidap karier HCVyang tidak mempunyai gejala (211. Dari datatersebut dapat dijelaskan hepatitis C dapatditransmisi dari donor dengan anti HCV negatif.

sella penggunaan pelacak DNA berlabelradioaktif.untuk proses hibridisasi basil PCR.

KESIMPULAN

Tabel 2. Hasil deteksi HCV dari sampel darahberasal dari laboratorium PalangMerah Indonesia

Nested RT-PCR kualitatif RNA HCV denganmenggunakan primer yang dirancang dariNCR region yang digunakan dalam penelitianini, dapat mendeteksi RNA HCV dalam 5sampel serum darah dari 25 sampel positifRNA HCV kuantitatif .Teknik ini dapat jugamendeteksi RNA HCV dalam 7 sampel serumdari 20 sampel positif anti HCV clan dalam 1sampel dari 5 sampel negatif anti HCVsecara serologi yang diperoleh darilaboratorium PMIPeningkatan sensitivitas deteksi HCVberdasarkan basil penelitian ini, dapatdilaksanakan antara lain denganmenggunakan primer yang didisain daridaerah genom HCV yang lebih conserved,cara deteksi yang lebih sensitif misalnyadengan menggunakan primer berlabelradioaktif , clan penggunaan pelacak DNAberlabel radioaktif untuk proses hibridisasiproduk RT-PCR

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepadaSdr. Almaida clan Sdr. Rika Heryani at as bantuanyan!~ diberikan sehingga penelitian ini dapatberjialan dengan baik clan lancar.

DAFTAR PUSTAKA

1. CHOO, Q.L., KUO, G., WEINER, A.J.,OVERBY, L.R., BRADLEY, D.W., andHOUGHTON, M. Isolation of cDNAclone derived from a blood borne non A,non B viral hepatitis genome. Science 2.4.4359 -362 (19891.

2. KUO, G., CHOO, Q.L., ALTER, H.J., GITNICK,G.L., REDEKER, A.G. PURCELL, R.H.,MIY AMURA, T., DIENSTAG, J.L.,ALTER, M.J., STEVEN, C.E., TEGTMEIER,G.E., BONINO, F., COLOMBO, M., LEE,W.S., KUO, C., BERGER, K., SHUSTER,J.R., OVERBY, L.R., BRADLEY, D.W., andHOUGHTON, M. An assay for circulatingantibodies to a major etiologic virus of humannon A, non B hepatitis. Science M.4. 362-364 (1989).

Hasil RT-PCR dari sample serum darahclan deteksinya dengan teknik elektroforesisgel agarosa, dapat dilihat pada Gambar 1, Hasilpositif HCV diperlihatkan dengan adanya pitaDNA spesifik dengan ukuran berkisar 255 bp"terlihat pada lajur 2 yang merupakan sampelpositif HCV dari RSCM , clan lajur 10, 11, 12merupakan sampel positif HCV yang berasal darilaboratorium PMI, Ukuran pita DNA ditentukandengan marker 0X174 Hae III (Lajur 1),

Berdasarkan basil penelitian yangdiperoleh, sensitivitas uji PCR perIn ditingkatkanyaitu dengan menggunakan primer yang lebihsensitif, cara deteksi basil PCR secara radioaktif,

Risalah Seminar llmiah Penelitian dan Pengembangan Aplikasi lsotop dIn Radias£ 2004

3. Van der POEL, C.I., CUYPERS, H.T., andREESINK, H. W. Hepatitis C six years on.The Lancet ~ 1475 -1479 (19941.

4. HOUGHTON, M. Hepatitis C virus. InFields Virologi vol. 1. Fields, B.N.,Knipe, D.M., Howley, P.M., Chanock,R.M., Melnick, J.L., and Straus, S.E./eds.I, 3 rd edition, Lippincott-Raven

Publisher, Philadelphia -New York/19961.

5. DALIMARTHA, S. Ramuan tradisional untukpengobatan hepatitis. Penerbit P. T.Penebar Swadaya, edisi ke dua, Jakarta(19981

6. WILBER, J.C., JOHNSON, P.J., and URDEA,M.S. Reverse Transcriptase- PCR forhepatitis C virus RNA. In DiagnosticMolecular Microbiology. Principles andApplications. Persing, D.H., Smith, T.F.,Tenover, F.C., and White, T.J. (eds.I,American Society for Microbiology,Washington D.C. (19931.

7. WIDJAJA, S. Epidemiology of hepatitis Band hepatitis C virus infection in anurban area in Jakarta, Indonesia: Ahospital and population based study.Thesis for the degree of Doctor in deMedische Wetenschappen, Leuven/19961.

8. BRUIX, J., BARRERA, J.M., CALVET, X.,COSTA, J., VENTURA, M., BRUGUERA,M., CASTILLO, R., ERCILLA, G.,SANCHEZ-TAPIAS, J., VALL, M., BRU,C., and RODES, J. Prevalence ofantibodies to hepatitis C virus in Spanishpatients with hepatocellular carcinomaand hepatic cirrhosis. Lancet ii 1004-1006 (19891.

9. BUDIHUSODO, U., SULAIMAN, H.A.,AKBAR, H.N.-.eLal Seroepidemiology ofHBVand HCV infection in Jakarta,Indonesia. Gastroenterology 26 196-201 (19911.

10. PEREIRA, B.J.G., MILFORD, E.L.,KIRKMAN, R.L., and LEVEY, A.S.Transmission of hepatitis C virus byorgan transplantation. The New EnglandJournal of Medicine 325 7 454 -460/19911.

11. POTERUCHA, J.J., RAKE LA , J., LUM,ENG,L., LEE, C.H., TASWELL, H.F., andWIESNER, R.H. Diagnosis of chronichepatitis C after liver transplantation bythe detection of viral sequences withpolymerase chain reaction. Hepatology15 142 -45 /19921.

12. CONRAD, E.U., GRETCH, D.R.,

OBERMEYER, K.R., MOOGK,M.S.,SAYERS, M., WILSON, J.J., andSTRONG, D.M. Transmission ofhepatitis C virus by tissuetransplantation. The Journal of Boneand Joint Surgery. ZZ:A 2 214 -224(1995).

13. NAZLY HILMY. Perkembangan bankjaringan di Indonesia. Bulletin Batan(1999).

14. LUSIDA, I., SOEMARTO, dan SOETJIPTO.Reaksi rantai polimerase untuk diagnosisvirus hepatitis C.. Medika 2 127 -129(1997).

15. HOSODA, K., OMATA, M., YOKOSUKA,0., KATO, N., and OHTO, M. Non A,Non B chronic hepatitis is chronichepatitis C: A sensitive assay fordetection of hepatitis C virus RNA inliver. Hepatologi. 15 5 777 -781(1992).

16. HU, K.Q., YU, C.H., and VIERLING, J.M. Onestep RNA polymerase chain reaction fordetection of hepatitis C virus RNA.Hepatology.~ 270-274 (1993)

17. CHA, T.A., BEALL, E., IRVINE, B., KOLBERG,J., CHIEN, D., KUO, G., and URDEA, M.S.At least five related, but distinct, hepatitis Cviral genotypes Exist.Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 89 7144 -7148 (1992).

17. SIMON, S. Diagnostic tests for hepatitis C.Seminar Nasional : Quality AssuranceProgramme for Molecular-BasedDiagnostis of Hepatitis C andTuberculosis. Catholic University ofAtma Jaya, 19 Juni 2003, di Jakarta.

18. GARSON, J.A., TUKE, P.W., MAKRIS, M.,BRIGGS, M., MACHIN, S.J., PRESTON,F.E., and TEDDER, R.S. Demonstrationof viraemia patterns in haemophiliacstreated with hepatitis C virus-contaminated factor VIII concentrates.The Lancet 21. 1022 -1025 (1990).

19. BHANDARI, B.N., and WRIGHT, T.L.Hepatitis C : An overview. Annu. Rev.Med. .46-309 -317 (1995).

20. ZANETTI, A.R., TANZI, E., ZEHENDER, G.,MAGNI, E., INCARBONE, C., ZONARO,A., PRIMI, A., CARIANI, E. Hepatitis Cvirus RNA in Symptomless donorsimplicated in post-transfusion non A, nonB hepatitis. The Lancet. 448 -449August 18 (1990).

RisaJah Seminar Ilmiah Peoeli/ian daD Peogembaogan Aplikasi Is%p daD Radiasi, 2004

12345678910 112 13

255 bp

Gambar 1. Fragmen DNA basil elektro£oresis RT-PCR-HCY dari sample serum darah

Lajur 1

Lajur 2,3,4,5,6,7Lajur 8,9,10,11,12Lajur 13

Marker0X17 HaeIIISampel serum darah daTi RSCMSampel darah daTi PMIKontrol negatif

Risalah Seminar Ilmiah Peneli/ian dan Pengembangan Aplikasi ls%p dan Radiasi, 2004

DISKUSI :

NELLY IIPBI SOBRIZAL

Bagaimana Ibu mendapatkan 2 pasangprimer yang digunakan daD berapa besarproduknya.

Secara umum metode skrining yangdigunakan saat ini dibanding PCR, mana yanglebih spesifik, murah daD mudah ?

MARIA LINA R MARIA LINA R

Metode yang umum digunakan adalahsecara serologi dengan metode Elisa. Metode PCRlebih sensitif clan spesifik terutama jikamenggunakan primer yang di desain daTi genomHCV yang lebih conserved atau dengan primeryang dilabel dengan radioaktif ataupun denganpelacak DNA berlabel radioaktif. Saat ini teknikPCR lebih mahal dibanding dengan teknik Elisa.

Primer yang dipakai dalam penelitian inisesuai dengan primer yang digunakan penelititerdahulu. Namun, dapat dirancang sendirimenggunakan program at au software khusussehingga dapat ditentukan daerah yang lebihconserved dari genom HCV. Besar prod uk PCR :255 bp (dengan inner primer! 322 bp (denganouter primer!

NAZLY HILMY DARMAWAN DARWIS

Apakah sampel darah yang digunakan,telah diuji dengan teknik Elisa dengan basilnegatif. Mengingat tujuan pemakaian untukmengatasi masalah window period? Kalau benarsudah diuji berapa persen yang positif PCR,negatif dengan Elisa? Hepatitis C dapat menjadipenyebab kanker hati.

Mohon dijelaskan mekanisme reaksi PCRdalam menentukan virus pada darah.

MARIA UNA R,

MARIA UNA R

Mekanismenya :.Lisis sel virus dalam darah..Ekstraksi RNA virus..Proses reverse -transkripsi dari RNA menjadi

cDNA..Proses amplifikasi c DNA hasil proses reverse

-transkripsi dengan teknik PCR..Deteksi hasil PCR dengan teknik

elektroforesis gel agarosa.

Sampel darah yang digunakan yangdiambil dari laboratorium PMI semuanya sudahdiuji secara serologi dengan teknik Elisa. Dari 25sampel yang diambil, 5 sampel negatif HCV.Dengan teknik PCR (nested PCRI yang digunakandalam penelitian ternyata dari 5 sampel negatifHCV tersebut, 1 sampel positif (20 %1. Namunangka tersebut perlu dievaluasi lagimenggunakan jumlah sampel negatif HCV yanglebih besar. Hepatitis C kronik akanberkelanjutan menjadi sirosis clan kanker hatiapabila virus sudah terintegrasi ke dalam set hati.