Nama : Hifdzur Rashif Rija’iNPM : 10060308052

Tugas resume dari Jurnal :“VALIDASI METODE ANALISIS SENYAWA CEFOTAXIME DENGAN STANDAR INTERNAL CEFADROXIL SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI”

PENDAHULUAN

Cefotaxime adalah antibiotik golongan sefalosporin generasi ketiga yang mempunyai khasiat bakterisidal dan bekerja dengan menghambat sintesis mukopeptida pada dinding sel bakteri. Masa paruh eliminasi pendek sekitar 1 jam, maka diberikan tiap 12 jam MIC dapat dicapai dalam waktu 10 jam (Prabaningrum dan Septiana, 2008). Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan yang dilakukan sebagai pembuktian terhadap parameter-parameter tertentu yang dipersyaratkan dan ditetapkan sehingga analisis yang dilakukan mendapatkan hasil yang diinginkan. Apabila metode ini dapat dipertanggungjawabkan secara keseluruhan (presisi, akurasi, selektivitas, batas deteksi, batas kuantitasi, stabilitas dan lain-lain), tidak menyimpang, dan diakui oleh pihak yang berkompeten, maka metode yang dimodifikasi ini dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin (Hidayat, 1999).

Pengembangan penetapan kadar cefotaxime dalam sediaan farmasi telah dilakukan dengan menggunakan metode KCKT dengan detector UV dalam cairan cerebrospinal. Namun demikian, selama ini belum pernah dilaporkan penelitian mengenai velidasi metode penetapan cefotaxime dalam pelarut menggunakan KCKT dengan detektor UV

METODE PENELITIAN

Alat Penelitian

Seperangkat alat kromatografi cair kinerja tinggi (Shimadzu LC-10 ATVP) yang dilengkapi dengan detektor UV-VIS SPD, auto injector Shimadzu System Controler SCL-A, kolom KCKT (Phenomenex); panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm, ukuran partikel 10 μm, seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis (analytical Jena, specord 200), pH meter (Ohmeter), ultrasonic bath (NEY 1510), timbangan analitik (Sartorius) kepekaan 0,1 mg, penyaring vakum beserta saringan berpori 0,2-0,45 μm, dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di Laboratorium Penelitian.

Bahan Penelitian

Cefotaxime, cefadroxil. Semua reagen kimia berderajat p.a : natrium dihidrogen fosfat monohidrat (Merck), asam fosfat (Merck), metanol p.a (Merck), akuabides (IKA), dan natrium hidroksida.

Metode Penelitian Pembuatan Fase Gerak dan Larutan Baku Pembuatan bufer fosfat (NaH2PO4.H2O) 0.01 M, pH 4,6

Ditimbang seksama 0,69 gram natrium dihidrogen fosfat monohidrat, dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml, diencerkan dengan akuabides sampai tanda batas, ditambahkan asam fosfat untuk mengatur pH sampai 4,6 menggunakan pH meter (Snyder et al., 1997). Disaring menggunakan

milipore dengan pori 0,2 μm, dengan bantuan vakum. Selanjutnya larutan diawaudarakan dengan ultrasonic bath selama 15-20 menit.

Pembuatan Fase Gerak

Ke dalam gelas ukur 100 ml, dicampurkan 80 bagian dapar fosfat pH 4,6 dan 20 bagian metanol. Campuran tersebut disaring menggunakan milipore dengan pori 0,2 μm, dengan bantuan vakum. Selanjutnya larutan diawaudarakan dengan ultrasonic bath selama 15-20 menit.

Penentuan Panjang Gelombang Pengukuran Baku Cefotaxime

Ditimbang seksama 100 mg Cefotaxime, dilarutkan ke dalam labu ukur 200 ml dengan fase gerak hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi akhir 500 μg/ml. Dipipet 100 μl ke dalam labu ukur 10 ml, diencerkan dengan fase gerak sehingga diperoleh konsentrasi 5 μg/ml. Kemudian larutan di-scanning dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 220-320 nm.

Baku Cefadroxil

Ditimbang seksama 100 mg cefadroxil, dilarutkan ke dalam labu ukur 200 ml dengan fase gerak sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 500 μg/ml. Dipipet 100 μl ke dalam labu ukur 10 ml, diencerkan dengan fase gerak sehingga diperoleh konsentrasi 5 μg/ml. Kemudian larutan discanning dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 220-320 nm, sehingga diperoleh spektrum serapan dan panjang gelombang maksimum Cefotaxime.

Penentuan Ekstingsi Molar (ε)

Cefotaxime Dipipet sejumlah tertentu larutan Cefotaxime dari larutan baku Cefotaxime dengan konsentrasi 500 μg/ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, diencerkan dengan fase gerak sampai tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi akhir. Ketiga larutan tersebut kemudian dianalisis dengan spektrofotometer dan dibaca serapannya pada panjang gelombang maksimum Cefotaxime, dan ditentukan nilai ekstingsi molarnya dengan menggunakan

Persamaan : A/b.C=ε

Keterangan : A = absortivitas molar (A) b = tebal kuvet (cm) C = konsentrasi Cefotaxime (Molar)

Optimasi Kondisi KCKT

Sistem KCKT yang akan digunakan adalah sebagai berikut :

1. Kolom : ODS/C18 (octadecyl silane), panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm, dan ukuran partikel 10 μm

2. Fase gerak : Metanol : NaH2PO4 (pH 2,2) (75 : 25, 78 : 22, 80 : 20 ) (akan dioptimasi) Laju alir : 0,8 ml/menit

3. Standar internal : Cefadroxil Detektor : UV 235 nm 4. Attenuation : 3 5. Minimum Area Detection : 5000

Penentuan Komposisi dari Fase Gerak Larutan baku Cefotaxime dengan konsentrasi 10 μg/ml yang mengandung standar internal

cefadroxil dengan konsentrasi akhir 5 μg/ml disuntikkan sebanyak 20 μl (auto injector) ke dalam alat

KCKT dengan komposisi fase gerak yang berbeda-beda pada kecepatan alir 0.8 ml/menit, kemudian dilihat waktu retensi dan pemisahan kedua puncak (Cefotaxime dan cefadroxil) yang dihasilkan untuk kemudian digunakan pada tahap analisis berikutnya.

Pretreatment Sampel Baku Cefotaxime dan Baku Cefadroxil

Ditimbang seksama 100 mg Cefotaxime, dilarutkan ke dalam labu ukur 10 ml dengan fase gerak hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi akhir 1000 μg/ml. Ditimbang seksama 100 mg Cefadroxil, dilarutkan ke dalam labu ukur 10 ml dengan fase gerak hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi akhir 1000 μg/ml.

Validasi Metode Analisis Cefotaxime secara KCKT Selektivitas

Dengan melihat kromatogram cefotaxime dan cefadroxil hasil pemisahan secara KCKT, tidak adanya puncak yang saling tumpang tindih, walaupun kedua zat dalam satu turunan. Selektivitas dinyatakan dengan nilai resolusi atau daya pisah (Rs) dan nilainya > 1,5 (Snyder et al., 1997).

Keterulangan (Repeatability)

Dibuat konsentrasi larutan Cefotaxime 10 μg/ml dalam fasa gerak, kemudian disuntikkan sebanyak 20 μl ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum. Percobaan diulang sebanyak enam kali, kemudian dihitung koefisien variasinya (%KV).

Pembuatan Kurva Baku

Lima seri konsentrasi Cefotaxime 5, 10, 15, 20 dan 25 μg/ml dengan standar internal Cefadroxil konsentrasi 5 μg/ml dalam fasa gerak (pada setiap konsentrasi Cefotaxime) disiapkan dengan membuat pengenceran secara seri dari stok larutan baku Cefotaxime dengan fasa gerak. Selanjutnya sejumlah 10 μl disuntikkan ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum. Penentuan linieritas dilakukan tiga kali pengulangan. Kurva kalibrasi yang diperoleh digunakan untuk menetapkan kadar sampel. Persamaan garis regresi linier digambarkan sebagai hubungan antara konsentrasi Cefotaxime dari rasio luas area kromatogram atau tinggi puncak kromatogram Cefotaxime terhadap standar internal Cefadroxil, kemudian dihitung koefisien korelasinya.

Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Nilai batas deteksi dan batas kuantitasi analisis Cefotaxime dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi, nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = bx + a (Harmita, 2004).

Akurasi dan Presisi

Akurasi dan presisi diperoleh dengan cara menetapkan kadar tiga sampel masing-masing tiga kali pengulangan (n = 3). Konsentrasi sampel dibuat sekitar kurva baku meliputi 3 10 μg/ml, 20 μg/ml dan 25 μg/ml. Kurva kalibrasi dengan koefisien korelasi terbaik digunakan untuk menetapkan Cefotaxime dalam sampel. Persen akurasi diperoleh dengan cara melihat kedekatan hasil dari sampel terhadap nilai nominal dan presisi dilihat dari nilai KV (%).

Uji Kesesuaian Sistem (System Suitability)

Uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap sampel Cefotaxime konsentrasi 10 μg/ml dengan standar internal Cefadroxil 5 μg/ml dalam fasa gerak, kemudian disuntikkan sebanyak 20 μl ke dalam alat

KCKT pada kondisi optimum. Percobaan diulang sebanyak enam kali (n = 6). Dari kromatogram yang diperoleh ditentukan keterulangan penyuntikan larutan baku yang dinyatakan dengan KV dari waktu retensi, rasio luas area dan rasio tinggi puncak, tailing faktor, dan asimetri puncak kromatogram.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengukuran Spektrofotometer Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang dimana zat tersebut memiliki nilai absorbansi paling besar. Panjang gelombang maksimum dipilih karena pada panjang gelombang tersebut zat akan memberikan respon yang maksimum, terutama apabila konsentrasi analit yang akan dianalisis kecil konsentrasinya. Pada British Pharmacopoeia 2008 identifikasi cefotaxime dilakukan pada panjang gelombang maksimum 235 nm seperti halnya pada penelitian ini yang juga mengunakan panjang gelombang maksimum cefotaxime pada 235 nm.

Hasil Penentuan Nilai Ekstingsi Molar (ε) cefotaxime

Penetapan nilai ekstingsi molar (ε) cefotaxime dilakukan dari tiga variasi konsentrasi, yaitu 14,66, 20,95, dan 27,23 μM dalam fase gerak pada panjang gelombang maksimum cefotaxime, yakni 235 nm. Nilai ekstingsi molar cefotaxime dihitung dengan membandingkan nilai serapan atau absortivitas molar cefotaxime terhadap tebal kuvet (umumnya 1 cm) dan konsentrasi cefotaxime yang diukur. Hasilnya menunjukkan nilai ekstingsi molar cefotaxime rata-rata 79.991, 86 M-1cm-1.. Nilai ini menunjukkan bahwa cefotaxime sangat memungkinkan untuk dideteksi dengan jdetektor ultraviolet pada sistem KCKT. Hal ini disebabkan karena adanya gugus kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi) pada struktur cefotaxime.

Hasil Optimasi Kondisi KCKT

Sistem KCKT yang akan digunakan untuk optimasi kondisi adalah sebagai berikut:

Kolom : ODS/C18 (octadecyl silane), panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm, dan ukuran partikel 10 μm

Fase gerak : Natrium dihidrogen fosfat (0,01 M, pH 4,6 diatur dengan penambahan NaOH) : metanol (75 : 25, 78 : 22, 79 :81 dan 80 : 20 v/v)

Kecepatan alir : 0.8 ml/menit Standar internal : Cefadroxil Detektor : UV 235 nm Attenuation : 3 Area Detection Minimum : 5000

Optimasi kondisi KCKT dilakukan terhadap parameter kromatografi meliputi waktu retensi, resolusi atau keterpisahan (Rs), jumlah keping teoritis (N), dan efisiensi kolom (HETP) dari berbagai variasi komposisi, Prioritas kedua adalah waktu retensi, dibutuhkan waktu retensi yang cocok untuk keperluan metode analisis dalam matriks cairan hayati dimana zat pengotor menghasilkan puncak serapan pada waktu retensi 0-3 menit.

Hasil Validasi Metode Analisis

Sistem KCKT yang akan digunakan adalah sebagai berikut :

1. Kolom : C18 (octadecyl silane), panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm, dan ukuran partikel 10 μm

2. Fase gerak : Dapar fosfat 0,01 M pH 4,6 dan metanol dengan perbandingan 80 : 20 v/v 3. Kecepatan alir : 0,8 ml/menit 4. Standar internal : Cefadroxil Detektor : UV 235 nm 5. Attenuation : 3 6. Minimum Area Detection : 5000

Hasil Uji Selektivitas Untuk mengetahui selektivitas suatu metode yang digunakan, dapat dilihat dari daya keterpisahan (resolusi) kedua puncak. dari puncak cefotaxime dengan waktu retensi 10,933 menit dengan nilai resolusi Rs = 2,72, sesuai persyaratan untuk nilai resolusi yaitu > 1,5 (L.R. Snyder et al., 1997). Dapat disimpulkan bahwa metode KCKT ini dapat digunakan untuk menganalisis cefotaxime dengan menggunakan standar internal cefadroxil.

Hasil Uji Keterulangan (Repeatability)

Uji keterulangan dilakukan terhadap cefotaxime dengan konsentrasi 10 μg/ml menggunakan standar internal cefadroxil 5 μg/ml. Dilakukan replikasi sebanyak enam kali, cefotaxime menunjukkan nilai 9,443 ± 0,08 menit dan KV = 0,85%. Pada beberapa literatur, kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Koefisien variasi akan meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis (Harmita, 2004).

Hasil Uji Linieritas

Uji linieritas dilakukan untuk melihat kemampuan metode analisis yang baik pada berbagai macam konsentrasi analit pada suatu kurva kalibrasi untuk menghasilkan garis lurus. Untuk menetapkan kadar sampel, digunakan persamaan kurva kalibrasi yang mempunyai koefisien korelasi > 0,999, dimana nilai ini merupakan kriteria suatu metode analisis yang valid (L.R. Snyder et al., 1997). Persamaan garis regresi linier berdasarkan rasio luas area (perhitungan dapat dilihat pada Lampiran) yang digunakan untuk menetapkan kadar cefotaxime adalah y = 0,1779 x +0,1783 dengan r = 0,999550. hal ini membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan sudah memenuhi kriteria linieritas pada rentang 5-25 μg/ml.

Hasil Uji Limit of Detection (LOD)

Limit of detection (LOD) mutlak ditentukan jika analit yang dianalisis konsentrasinya relatif kecil seperti dalam matrik biologis (G. Indrayanto, 1994). Nilai LOD dari rasio luas area kromatogram adalah 0,05082 μg/ml dan berdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram adalah 0,05896 μg/ml.

Hasil Uji Limit of Quantitation (LOQ)

Limit of quantitation (LOQ) mutlak ditentukan jika analit yang dianalisis konsentrasinya relatif kecil seperti dalam matrik biologis (G. Indrayanto, 1994). Nilai LOQ dari rasio luas area kromatogram adalah 0,1694 μg/ml dan berdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram adalah 0,1965 μg/ml. Nilai LOQ sangat tergantung pada galat sistemik yang dapat dilihat sebagai intercept atau titik potong pada sumbu y dari persamaan garis kurva kalibrasi.

Hasil Penentuan Ketelitian (Precision) dan Ketepatan (Accuracy)

Untuk mengetahuipresisi dan akurasi, dibuat 3 macam konsentrasi sampel cefotaxime yang kadarnya ditetapkan berdasarkan kurva kalibrasi cefotaxime. berdasarkan rasio luas area kromatogram

memberikan nilai presisi yang dinyatakan sebagai KV (%) dari konsentrasi 10, 20, dan 25 μg/ml berturut-turut adalah 1,28%, 1,03%, dan 0,33%.. Nilai tersebut sesuai dengan persyaratan, yaitu dengan nilai KV < 2%.

Hasil Uji Kesesuaian Sistem (System Suitability Test)

Untuk memastikan bahwa sistem yang digunakan berjalan secara efektif maka perlu dilakukan uji kesesuaian sistem. diketahui KV dari waktu retensi, rasio luas area kromatogram, dan rasio tinggi puncak kromatogram < 4%, nilai ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan telah memenuhi kriteria kesesuaian sistem yaitu KV < 10%.

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian dapat disimpulkan hal-hal sebagai berikut :

Optimasi kondisi KCKT dapat dilakukan dengan baik karena telah memenuhi kriteria dari waktu retensi, resolusi, jumlah keeping teoritis dan HETP, sehingga analisis lanjut dapat dilakukan secara KCKT dengan detektor UV.

Dari hasil validasi metode yang meliputi parameter : selektivitas, keterulangan, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketelitian, ketepatan, dan kesesuaian sistem, maka metode yang digunakan memiliki validitas sesuai dengan yang dipersyaratkan sehingga dapat digunakan untuk menganalisis Cefotaxime dalam pelarutnya.

DAFTAR PUSTAKA

American Society of Health-System Pharmacists, 2007.Cefotaxime.http://id.search.yahoo.c m/ [Diakses tanggal 20 Desember 2008].

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. hal. 1009-1012.

Gritter, R.J., J.M. Bobbit, dan A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi II. Bandung: ITB. hal.180-230.

Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(3):117-135.

Hidayat, A. 1999. Validasi Metode Analisis Kimia. Bul. Agro Bio. 2(2):22-28.

Indrayanto, G. 1994. Metoda validasi pada analisis dengan kromatografi. Medika-Jurnal Kedokteran & Farmasi. 20(2): 49-51.

Miller, J.C. and J.N. Miller. 1988. Statistic for Analytical Chemistry. 2nd Edition. New York: John Wiley & Son. p.109-120.

Prabaningrum, N. dan Septiana V. 2008. Cefotaxime.http://yosefw.wordpress.com/ 2008/03/. [16 Oktober 2008)

Snyder, L.R., J.J. Kirkland, and J.L. Glajch. 1997. Practical HPLC Method Development. 2nd Edition. New York: John Willey & Sons, Inc. p. 119-144, 643-728, 736.