KATA PENGANTARAlhamdulillah, Segala Puji bagi ALLAH karena atas kekuasaan-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini sebagai salah satu prasyarat pemenuhan tugas dari mata kuliah Metode Pemisahan Kimia. Kami mengucapkan terimakasih kepada dosen Pembimbing yang telah memberikan kesempatan dan materi masukan selama proses perkuliahan submateri Metode Pemisahan Kimia yang sangat berarti dalam pembuatan makalah ini. Semoga ALLAH membalas kebaikannya. Serta terima kasih pula kepada rekan rekan Teknologi Laboratorium Medik yang turut mengikuti mata kuliah ini atas segala saran, kritikan dan bantuannya selama proses pembuatan makalah ini.Kami telah berusaha untuk menyempurnakan penulisan makalah ini namun sebagai manusia kami menyadari akan keterbatasan maupun kekhilafan dan kesalahan yang tanpa disadari. Oleh karena itu, saran dan kritik untuk perbaikan makalah ini akan sangat dinantikan. Akhir dari pengantar ini penulis berharap semoga dari makalah ini kita dapat memperoleh ilmu yang bermanfaat. Amiin.Bandar Lampung, 28 April 2015

BAB IPENDAHULUANKromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral.Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

1.1 Rumusan Masalah :1. Bagaimana prinsip kerja dari KCKT ?2. Bagaimana mekanisme kerja dari KCKT serta instrumen yang terdapat didalamnya ?

BAB IIPEMBAHASAN2.1 Prinsip Kerja Dari KCKTAdapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.2.2 Kegunaan KCKTKegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.2.3 Mekanisme Kerja KCKTPenggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel. Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu : a) Wadah fase gerakb) Sistem penghantaran fase gerakc) Alat untuk memasukkan sampeld) Kolome) Detektorf) Wadah penampung buangan fase gerak g) Tabung penghubungh) Suatu komputer atau integrator atau perekam

1.Wadah fase gerak pada KCKTWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).2. Fase GerakFase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam pemilihan fase gerak.Beberapa deret eluotropik KCKT :PelarutParameter kekuatan pelarut (adsorbsi)Parameter kekuatan pelarut (partisi)UV cut off (nm)

n-heksana0,010,1195

Sikloheksana0,04-0,2200

Tetraklorometan0,181,6265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm, pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.3. Pompa Syarat pompa yang digunakan adalah : harus inert terhadap fase gerak.Bahan yang umumnya dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.4. Injektor (penyuntikan sampel)Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.5. Kolom Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :ParameterKolom konvensionalKolom mikrobor

Tabung kolomStainless steelPanjang 3,10,15,20 dan 25 cmDiameter luar 0,25 inciDiameter dalam 4,6 cmStainless steelPanjang 25 dan 50 cmDiameter luar 0,25 inciDiameter dalam 1 atau 2 mm

Fase diamPorous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10m dengan kisaran sempit.Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10m dengan kisaran sempit.

Tekanan operasional500-3000 psi(35-215 bar1000-5000 psi(70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir : 1-3 ml/menit Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100 l/menit.Modifikasi instrumenSistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah 10l/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume kecil.

KinerjaEfisiensi meningkat dengan bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 m lebih pendek.Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya dari kolom konvensional.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni : Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 l/menit) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.6. Fase diamKebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam