laporan takson acara 2

of 39 /39

Click here to load reader

Author: mii

Post on 22-Dec-2015

352 views

Category:

Documents


21 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

taksonomi

TRANSCRIPT

HASIL DAN PEMBAHASAN

IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MOLEKULER

Abstraksi

Praktikum Taksonomi Mikrobia Identifikasi Bakteri secara Molekuler dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 20 November 2014 dan hari Selasa tanggal 25 November 2014 di Laboratorium Mikrobiologi Dasar, Jurusan Mikrobiologi, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Alat dan bahan yang digunakan adalah laptop, data sekuens 16s DNA beberapa isolat bakteri, DNA baser program, BLAST online program, Bioedit program, dan MEGA5 program. Filogeni adalah kajian hubungan kekerabatan antara kelompok organisme monofiletik atau hipotesis kekerabatan organisme yang direpresentasikan sebagai dendogram atau diagram bercabang. Filogeni berperan dalam menentukan similaritas yang berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang lebih tinggi, serta memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar takson. Untuk bakteri dan fungi, prosedur identifikasi berbasis molekuler yaitu : ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, sekuensing, dan analisis hasil sekuen serta pembuatan pohon filogenetik. Program bioinformatika yang digunakan untuk identifikasi secara molekuler adalah bioEdit, Molecular Evolutionary Genetics Analysis versi 5 (MEGA5), dan analisis mengggunakan BLAST yang akan menghasilkan output berupa sekuen-sekuen yang mempunyai kemiripan dengan sekuen mikroba sampel.I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Saat ini telah menjadi jelas bahwa beberapa makromolekul sel dapat menjadi acuan hubungan kekerabatan organisme tersebut dengan organisme lain. Dari penelusuran urutan monomer pada molekul informasi tertentu, didapatkan bahwa perbedaan jarak kekerabatan antara 2 organisme dapat diukur dengan melihat perbedaan nukleotida atau urutan asam amino pada makromolekul yang homogen. Hal ini dapat dilakukan karena jumlah perbedaan sekuen pada sebuah molekul adalah proporsional terhadap jumlah perubahan mutasi pada pengkodean DNA dua organisme tersebut.

Banyak molekul yang telah diusulkan untuk dijadikan acuan dan ribosomal RNA adalah pilihan yang sesuai. Ribosomal RNA merupakan molekul yang sempurna karena fungsinya yang konstan pada tiap organisme, tersebar secara universal dan urutan sekuennya terkonservasi dengan baik diantara anggota filogenetik yang luas. Ribosom sendiri merupakan komponen sel yang utama dengan jumlah sekitar 20.000 ribosom per sel. Ribosom tersebut mengandung kira-kira 10 % dari seluruh total protein dan sekitar 80 % dari keseluruhan massa sel. Sel bakteri mempunyai ribosom 70S yang terdiri dari unit ribosomal kecil 30S mengandung 21 protein dan satu molekul 16S RNA yang panjangnya 1541 basa. Serta unit ribosomal besar 50S yang mengandung 36 protein, satu molekul 23S rRNA yang panjangnya 2904 basa, dan satu molekul 5S rRNA yang panjangnya 120 basa (Lewin, 1994).

Sekuen ribosom yang digunakan sebagai acuan adalah 16S rRNA karena panjangnya yang paling sesuai, tidak terlalu pendek seperti pada 5S dan bila dibandingkan dengan 23S, 16S tidak terlalu panjang serta lebih mudah untuk ditangani. Sekuen gen 16S rRNA dari mikroorganisme yang baru ditemukan kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka sekuen 16S rRNA dari mikroorganisme lain melalui program pelacakan datase Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) .B. Tujuan1. Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan program bioinformatika.

2. Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler berdasarkan sekuen dan dendogram.II. TINJAUAN PUSTAKA

Keanekaragaman genetika dapat terjadi karena adanya perubahan nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini mungkin dapat memperngaruhi fenotipe suatu organisme yang dapat dipantau dengan mata telanjang, atau mempengaruhi reaksi individu terhadap lingkungan tertentu. Secara umum keanekaragaman genetik dari suatu populasi dapat terjadi karena adanya mutasi, rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat ke tempat lain. Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD, RFLP, dan DGGE membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik ini berkembang setelah orang menciptakan mesin DNA sequencer. Pada prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme. Untuk melihat keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA bagi organisme prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme eukaryota. Perbandingan sekuen rRNA merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi di antara organisme bacteria, archaebacteria, dan eukaryot (Weisburg et al., 1991). Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut, yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain Reaction (PCR), dan sekuensing DNA. Sekuens-sekuens nukelotida yang diperoleh telah tersedia di database GenBank. Upload dilakukan dengan mengakses melalui situs web GenBank dan selanjutnya disubmit via bankit. Metode skrining molekuler dilakukan dengan teknik Polymerase Chain. Reaction (PCR) menggunakan primer degenerate DegFor dan DegRev (Malik, 2010).Pendekatan analisis pada tingkat molekuler (genomik) dapat diaplikasikan pada spesies yang belum dapat dikulturkan di laboratorium. Berbagai metode dapat dilakukan untuk menganalisis DNA, diantaranya AFLP, ARDRA, PFGE, dan lain-lain. Namun dari berbagai metode yang digunakan, rRNA paling banyak digunakan sebagai marka molekuler. Pada prokariot terdapat tiga macam ribosomal RNA (rRNA), yaitu 5S rRNA, 16S rRNA, dan 23S rRNA. Molekul 5S rRNA tersusun dari 120 basa. Urutan basa molekul tersebut sangat pendek, sehingga molekul 5S rRNA tidak ideal dari segi analisis statistika. Molekul 23S rRNA tersusun dari 2900 basa. Molekul ini menyulitkan analisis karena memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang. Prosedur yang telah baku yang sudah digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik dan mendefinisikan spesies adalah melalui amplifikasi gen 16S rRNA (Jusuf, 2001). Gen 16S rRNA merupakan komponen penting dalam sel dan sangat menguntungkan di dalam analisis filogenetik, karena terdiri atas daerah yang konservatif yang mutasinya terbatas (Madigan et al., 1997).

Analisis filogenetik suatu spesies dapat dilakukan pada karakter morfologi dan gengen yang berada di dalam dan di luar tubuh dengan sekuen DNA mitokondria. Penggunaan sekuen DNA mitokondria memperjelas hubungan spesies secara evolusi yang kabur akibat variasi morfologi. Sekuen DNA mitokondria memperlihatkan variasi DNA suatu populasi, perubahan breeding suatu individu dan isolasi terhadap populasi tersebut. Pohon filogenetik diproses menggunakan software MEGA 5.1. Untuk Lokus Control Region digunakan model Hasegawa KishinoYano (HKY) dan model Generalized Time-Reversible (GTR) untuk Lokus 16S. Analisa dan penyusunan pohon filogenetik dilakukan dengan metode Maximum Likelihood (Twindiko dkk., 2013).

III. METODOLOGI

A. Alat dan Bahan

1. PC/laptop dengan koneksi Internet

2. Data Sekuens 16s DNA dari beberapa isolat bakteri

3. DNA baser Program

4. BLAST online program

5. BioEdit program

6. Mega5 atau Mega6 program

B. Langkah Kerja

1. Install seluruh software yang dibutuhkan (pada alat dan bahan)

2. Buka Software DNA Baser > Klik pada Single File Assembly > Input file yang akan kita gunakan (bagian forward lalu klik add dan tambahkan bagian reverse) > Klik Start Sequence Assembly.

3. Hapus Untrusted base > Klik Edit > Select from cursor to left atau right (untuk menghapus ke kiri atau kanan) > klik edit > Delete Base > Lakukan pada masing2 ujung kanan-kiri forward.

4. Klik View Config > Save as.... > Save (Fasta file)

5. Buka web Blast (blast.ncbi.nlm.nih.gov) > Klik nucleotide blast

6. Input file Fasta dari tahap sebelumnya > Klik BLAST

7. Pilih 5 isolat untuk membandingkan dengan isolat sampel yang kita masukan > Klik kode Accession pada bakteri yang dipilih untuk memperoleh sekuens > FASTA > Copy sekuens ke dalam notepad > Lakukan pada semua bakteri yang akan dibandingkan > Save Notepad.

8. Buka Software BioEdit > Klik File > input file notepad yang dibuat dari langkah sebelumnya > Block semua title/nama bakteri > Accessory Application > ClustalW Multiple Alignment > Run ClustalW > Klik File > Graphic View.

9. Klik File > Export as Rich Text > Save (RTF file)

10. Buka Software Mega5/Mega6 > klik file > open a file/session.... > input file (sekuens yang akan dibandingkan) > klik Align > Edit/Build Alignment > OK > Klik DNA.

11. Klik Edit > Insert Sequence from file > input file notepad yang akan dibandingkan > ok

12. Panjang basa pada sekuens yang ada disamakan panjangnya dengan penghapusan basa > Save (MAS file) > Klik phylogeny > Klik Construct/Test Neighbour-Joining tree ... > pilih file yang telah disimpan > klik bootstap method pada kolom test of phyogeny > klik p-distance pada kolom Model/Method > klik Compute > Copy to Clipboard > Copy pada MS.word.

Hasil yang diperoleh

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

Gambar 1. Pohon phylogenik dari MegaGambar 2. Pohon phylogenik dari NTSYSB. PembahasanBioinformatika merupakan penerapan teknik komputasional untuk analisis dan pengelolaan informasi biologis. Bidang ini mencakup penerapan metode matematika, statistika, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan dengannya. Contoh topik utama bioinformatika meliputi basis data untuk pengelolaan informasi biologis, penyejajaran sekuens (sequence penjajaran), prediksi struktur untuk mengetahui bentuk struktur protein maupun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen.

Istilah bioinformatics mulai dikemukakan pada pertengahan era 1980-an untuk mengacu pada penerapan komputer dalam biologi. Namun, penerapan bidang-bidang dalam bioinformatika (seperti pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk analisis sekuens biologis) sudah dilakukan sejak tahun 1960-an.

Basis data sekuens biologis

Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpannya, basis data sekuens biologis dapat berupa basis data primer untuk menyimpan sekuens primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat.

Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank (Amerika Serikat), EMBL (Eropa), dan DDBJ(Inggris) (DNA Data Bank of Japan, Jepang). Ketiga basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan cakupan masing-masing basis data. Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah submisi langsung dari periset individual, proyek sekuensing genom, dan pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam nukleat, entri dalam basis data sekuens asam nukleat umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA atau RNA), nama organisme sumber asam nukleat tersebut, dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens asam nukleat tersebut.

Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang didanai terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang sekuens protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut.

Metode yang penting dalam identifikasi pada bioinformatika adalah sequence penjajaran. Penyejajaran sekuens (sequence penjajaran) adalah proses penyusunan dua atau lebih sekuens sehingga terlihat persamaan atau perbedaan sekuens pada sampel yang diuji dengan data pada server. Hasil dari proses tersebut disebut sebagai sequence penjajaran. Baris sekuens dalam suatu penjajaran diberi sisipan (umumnya dengan tanda "") sedemikian rupa sehingga kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens tersebut. Sequence penjajaran merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam penjajaran diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan (gap, tanda "") diasosiasikan dengan adanya proses insersi atau delesi. Sequence penjajaran digunakan untuk memperoleh hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens tersebut. Dalam kaitannya dengan hal ini, penjajaran juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut.

Beberapa Software atau aplikasi yang sering digunakan pada penerapan data bioinformatika adalah sebagai berikut:

BLAST

BLAST (Basic Local Penjajaran Search Tool) merupakan aplikasi yang digunakan untuk membandingkan sequense informasi biologis secara primer, seperti asam amino, protei atai basa nukleotida pada sequence DNA. Aplikasi ini dapat digunakan untuk menemukan gen yang sejenis pada beberapa organisme serta dapat digunakan untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.

Terdapat beberapa tipe dari BLAST yang dapat digunakan berdasarkan penggunaannya. Contohnya, penemuan gen dari suatu organisme yang baru saja diketahui, peneliti akan menguji keidentikan gen tersebut dengan gen dari organisme lain yang memiliki tingkat keidentikan yang tinggi. BLAST diciptakan oleh Stephen Altschul, Warren Gish, Webb Miller, Eugene Myers, and David J. Lipman dan dipublikasikan pada Journal of Molecular Biology pada tahun 1990.

Blast menggunakan metode heuristik untuk mencari tingkat keidentikan yang tinggi. Proses ini mencari kata awalan yang sering disebut dengan seeding. Setelah itu, dilanjutkan dengan pembuatan local alignment yang mencari similaritas gen sampel dengan data yang sudah ada. Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk membentuk sebuah alignment yang disusun berdasarkan tingkat keidentikan gen dan akan diketahui tingkat kekerabatan antara gen sampel dengan data pada database.

Point utama pada BLAST adalah pemasangan pasangan segmen dengan tingkat similaritas yang tinggi (high-scoring segment pairs (HSP) yang mengandung alignment signifikan secara statistik. Program ini dapat didownload dan dijalankan menggunakan blastall atau diakses melalui web. Server BLAST dikelola oleh NCBI, dan dapat digunakan oleh siapapun. BLAST didasarkan pada open-source format yang dapat digunakan untuk merubah kode pada program, sehingga muncul beberapa BLAST spin-off.

Beberapa percabangan dari progam BLAST yaitu:

Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)Program ini digunakan untuk mencari sequence DNA, mencari DNA yang teridentik. Protein-protein BLAST (blastp)Program ini digunakan untuk mencari similaritas protein sampel dengan database. Position-Specific Iterative BLAST (PSI-BLAST) (blastpgp)Program ini digunakan untuk mencari jarak kekerabatan dari proten. Pertama dengan mencari pembentukan protein yang berrelasi. Protein tersebut akan dikombinasikan menjadi general "profile" sequence, yang menggabungkan fitur yang ada pada sequence. Dengna pencarian protein yang berrelasi, PSI-BLAST lebih sensitif dalam pengambilan jarak kekerabatan apabila dibandingkan dengan protein-protein BLAST.

Nucleotide 6-frame translation-protein (blastx)Program ini membandingkan konsepsual translasi frame ke enam yang merupakan produk dari nucleotide query sequence. Nucleotide 6-frame translation-nucleotide 6-frame translation (tblastx)Program ini merupakan program yang paling lambat dari seluruh BLAST. Program ini menterjemahkan kumpulan sequece dari enam frame yang dan dibandingkan dengan six-frame translations dari database sequece nucleotide. Program ini bertujuan untuk mencari jarak kekerabatan yang sangat jauh antara nucleotide sequences.

Protein-nucleotide 6-frame translation (tblastn)Program ini membandingkan kumpulan protein dengan seluruh six reading frames dari database sequece nucleotide.

Large numbers of query sequences (megablast)Saat membandingkan input dalam jumlah yang besar, "megablast" jauh lebih crpat daripada program BLAST yang lain. Program ini mengelola multiple input untuk membentuk sequence dalam jumlah yang besar sebelum memulai pencarian pada database BLAST, lalu dianalisis ulang untuk mendapatkan hasil berupa glean individual alignments dan statistical values.

BioEdit

BioEdit merupakan software yang digunakan untuk editing sequence penjajaran dan analisis sequence. BioEdit dapatdigunakan untuk mengolah sequence dan penjajaran yang sederhana. BioEdit memiliki empat penjajaran manual (select and slide, dynamic grab and drag, gap insert and delete by mouse click, dan on-screen typing) yang fungsinya identik dengan text editor. Pada software ini, asam nukleat yang berbeda dipisahkan oleh warna yang berbeda, sehingga mempermudah dalam pembacaan sequencing, Informasi yang dinamis berdasarkan penjajaran shading, Point-and-click color table editing.

Kelebihan lain dari BioEdit adalah:

Pengelompokan sequences menjadi beberapa kelompok atau families.

Penguncian penjajaran pada sequence yang telah dikelompokan dan disinkronisasi dengan pengaturan penjajaran sequence.

Notasi sequence dengan fitur grafik yang dinamik. Penguncian sequences untuk mencegah terjadinya accidental edits. Beberapa karakter valid digunakan untuk kalkulasi pada sequence asam amino dan nukloetida. Pengolahan data yang memiliki format Genbank, Fasta, Phylip 3.2, Phylip 4, and NBRF/PIR. Analisis perbandingan RNA, termasuk kovariasi, potential pairings dan analisis kekerabatan.

Pengolahan sequence mencapai 20,000 sequences. Pencarian ORF Dan masih banyak lagi

NTSYSpc (Numerical Taxonomy System)NTSYSpc merupakan software yang dapat digunakan untuk mencari pola dan struktur dari data yang multivariate. Contohnya adalah pencarian tingkat kekerabatan sample dengan spesies lain yang disajikan dalam bentuk phylogenetic tree menggunakan metode neighbor-joining atau UPGMA pada konstruksi dendogram. Program ini telah diciptakan pada tahun 1960, namun saat ini telah didesain ulang untuk penggunaannya pada PC.Beberapa Fitur dari NTSYSpc adalah sebagai berikut:

Similarity and dissimilarity: korelasi, kekerabatan, asosiasi 34 koefisien, dan 11 koefisien jarak genetik.

Clustering: UPGMA dan SAHN methods. Neighbor-joining method. Several types of consensus trees.

Graph theoretic methods: Jarak spanning trees. Grafik (unrooted trees) dari metode neighbor-joining.

Ordination: principal components & principal coordinates analysis, correspondence analysis, metric & non-metric multidimensional scaling analysis, singular-value decompositions. Variasi analisis Canonical. Program untuk analisis multiple faktor.

Grafik yang interaktif: phenograms, pohon phylogenetic, 2D scatter plots , perbandingan matriks dis/similarity, Procrustes plots, and 3-D perspective plots.

Uji Multivariate: test homogenitas matriks kovarian, test nomor dimensi, analisis regresi multivariate generalized.MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)MEGA merupakan software yang digunakan untuk analisis statistik dari evolusi molekular dan konstruksi pohon filogenik. Projek ini dikembangkan oleh Masatoshi Nei yang berkolaborasi dengan Sudhir Kumar dan Koichiro Tamura. MEGA memiliki fitur dalam pembentukan konstruksi alignment sekuens, data handling, Genetic code table section, real-time caption expert engine, integrated text file editor, sequence data viewer, MCL-based estimation of nucleotide substitution pattern, substitution pattern homogeneity test, distance estimation methods, test selection, molecular clock test, tree-making method, tree explorer.Hasil analisis pohon filogenik dengan menggunakan data golongan dari kelompok 1 menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan Paenibacillus favisporus strain GMP01 16S dan Paenibacillus chibensis strain NBRC 15958 16S. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Velzquez et al. (2004) yang menjelaskan bahwa spesies Paenibacillus favisporus strain GMP01 16S dan Paenibacillus chibensis strain NBRC 15958 16S memiliki kekerabatan berdasarkan urutan gen 16S rRNA yang termasuk dalam genus Paenibacillus. Sehingga kemungkinan kelompok 1 termasuk kedalam genus Paenibacillus. Kemudian pada grub tersebut berkerabat dekat dengan Pseudomonas citronellolis strain EPAn8 16S dan Pseudomonas sp. a-1-6. Pada kelompok 2 menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan kelompok 3 dan kelompok 4. Berdasarkan sifat-sifat yang paling banyak berbeda dengan spesies-spesies yang lain, maka kelompok 2, 3, dan 4 menjadi outgroup dari pohon filogenetik yang dibangun. Pada kelompok 5 berkerabat dekat dengan Burkholderia vietnamiensis, Uncultured Burkholderia sp., Burkholderia sp. WN-2 16S, dan Burkholderia sp. SD001 16S. Dari 5 grub tersebut berkerabat dekat dengan Burkholderia bannensis strain E25 16S dan Burkholderia heleia strain NBRC 101817 16S. Hal ini membuktikan bahwa kelompok 5 termasuk dalam genus Burkholderia. Sedangkan hasil analisis pohon filogenik dengan menggunakan data kelompok 2 diketahui bahwa kelompok 2 berkerabat jauh dengan Pseudomonas citronellolis strain EPAn8 16S, Pseudomonas sp. a-1-6 16S, Pseudomonas azelaica partial 16S, Pseudomonas citronellolis strain ADC-25A 16S, dan Pseudomonas sp. R-24636 16S. Hal ini dibuktikan bahwa kelompok 2 menjadi outgrub dari grub pseudomonas pada pohon filogenik yang dibangun. Sehingga kelompok 2 kemungkinan bukan termasuk genus Pseudomonas. Identifikasi molekuler bertujuan untuk membedakan suatu organisme dengan organisme lainnya pada tingkat molekuler. Organisme memiliki urutan basa DNA yang berbeda. Untuk membuktikannya, dilakukan sekuensing DNA (mengurutkan basa nitrogen) setiap individu sehingga diketahui perbedaannya. Untuk identifikasi bakteri berbasis sekuen biasanya digunakan suatu marker, baik yang terdapat pada daerah gen maupun daeah DNA non-koding, dengan karakteristik antara lain: Sebagian besar merupakanhousekeeping geneyang ada pada semua bakteri Memiliki polimorfisme yang tinggi sehingga membuatnya dapat dibedakan antara bakteri yang juga berbeda. Marker molekuler tersebut harus bersifat sangat konservatif pada beberapa daerah sehingga memudahkan untuk mendesain primer yang tepat untuk proses amplifikasi dengan PCR.

Ada beberapa gen dan daerah DNA yang memiliki kesemua ciri tersebut dan telah digunakan secara luas untuk identifikasi bakteri, contohnya gen 16S rRNA. Gen 16S rRNA mengkode rRNA subunit kecil ribosom organisme prokariot. Gen tersebut banyak digunakan dalam analisis filogenetik karena terdistribusi secara universal, bersifat konservatif, memiliki peran penting pada ribosom dalam sintesis protein, tidak ditransfer secara horizontal, serta kecepatan evolusi dengan variasi tingkat yang tepat di antara organisme. Molekul 16S rRNA memiliki daerah variabel dan konservatif, dimana primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA secara lengkap biasanya dipilih dari daerah konservatif tersebut, sementara daerah variabel lebih banyak digunakan untuk taksonomi perbandingan.Dalam melakukan sekuensing gen terlebih dahulu dilakukan ekstraksi DNA kemudian dilanjutkan dengan PCR. Hasil dari amplifikasi PCR langsung digunakan untuk analisis RLFP dengan memanfaatkan kemampuan enzim pemotong ikatan fosfodiester (restriksi) sehingga dapat diketahui apakah DNA yang diuji ini urutan basanya sama atau berbeda dari beberapa sampel yang diuji.Prinsip pengujian dengan RFLP ialah dengan memanfaatkan kemampuan enzim restriksi untuk memotong DNA pada urutan tertentu. Enzim restriksi memiliki sifat memotong DNA pada bagian spesifik. Jadi, teknik ini mampu melihat variasi yang ada pada setiap sampel uji. Apabila suatu fragmen DNA yang berbeda mempunyai urutan yang berbeda, maka sisi pengenalan enzim restriksi ini juga akan berbeda. Hasil pemotongan yang berbeda inilah yang nantinya kita buktikan pada elektroforesis. Pada praktikum ini enzim restrikasi yang digunakan adalah MSPI.

Gambar 1. Hasil analisis PCR_RLFP menggunakan enzim restriksi MspIBerdasarkan hasil elektroforesis hasil PCR_RLFP yang menggunakan enzim restriksi MspI dapat dilihat bahwa produk PCR dari lima isolat hanya isolat 1, 3, dan 4 yang menunjukkan bahwa restriksi produk PCR menghasilkan fragmen DNA. Sedangkan pada isolat 2, 5, dan 6 terjadi ketidakberhasilan pada elektroforesis sehingga tidak menghasilkan fragmen DNA. filogeni adalah kajian hubungan kekerabatan antara kelompok organisme monofiletik atau hipotesis kekerabatan organisme yang direpresentasikan sebagai dendogram atau diagram bercabang. Filogeni memegang peranan tersendiri dalam kajian sistematika dan taksonomi. Filogeni berperan dalam menentukan similaritas yang berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang lebih tinggi, serta memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar takson. Kajian filogeni telah banyak berkembang dan memiliki andil besar dalam dunia sistematik dan taksonomi. Beberapa kajian telah memberikan suatu kontribusi berupa revisi atau adanya teori baru, yakni tentang hubungan kekerabatan anggota krustasea ( Wahyudi, 2007).

V. KESIMPULAN1. Identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan program BLAST, BioEdit, NTSYSpc, dan MEGA.2. Blast merupakan software yang digunakan untuk mencari tingkat keidentikan yang tinggi.3. BioEdit merupakan software yang digunakan untuk editing sequence penjajaran dan analisis sequence. BioEdit dapatdigunakan untuk mengolah sequence dan penjajaran yang sederhana.4. NTSYSpc merupakan software digunakan untuk mencari pola dan struktur dari data yang multivariate.5. MEGA merupakan software yang digunakan untuk analisis statistik dari evolusi molekular dan konstruksi pohon filogenik.6. Identifikasi berdasarkan sekuen berfungsi untuk membedakan organisme satu dengan lainnya. Sedangkan dendogram digunakan untuk dalam menentukan similaritas yang berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang lebih tinggi, serta memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar takson.DAFTAR PUSTAKALewin B, 1994. Genes V. Oxford Univ. Press. Cambridge.

Jusuf M. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi Gen. Sagung Seto. Jakarta.Madigan, M. T., Martinko, J. M. & Parker, J. 1997. Biology of Microorganisms. Prentice Hall Upper Saddle River Press. London. Malik, Amarila, A. K. Hermawati, M. Hestiningtyas, A. Soemiati, dan M. Radji. 2010. Isolasi dan skrining molekuler bakteri asam laktat pembawa gen Glucansukrase dari makanan dan minuman mengandaung gula. Makara Sains 14 : 63-68. Twindiko, A. F. S., Diah P. W. dan Ambariyanto. 2013. Studi filogenetik ikan karang genus Pseudochromis dan Pictichromis di perairan Indo-Pasifik. Buletin Oseanografi Marina 2:29 37.

Velzquez, Encarna, T. de Miguel, M. Poza, R. Rivas, R. R. -Mora and T. G. Villa. 2004. Paenibacillus favisporus sp. nov., a xylanolytic bacterium isolated from cow faeces. IJSEM 54:59-64.Wahyuni, A.J. 2007. Memperkenalkan cluster analysis of variables dalam minitab 11.12 untuk kajian filogeni suku-suku krustasea (brachyura). Jurnal Oseana 32:21-36.Weisburg, W. G., Barns S. M. , Pelletier D. A. , Lane D. J. 1991. 16S ribosomal DNA aplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173:697-703.http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html