Download - Laporan Takson Acara 2

IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MOLEKULER

Abstraksi

Praktikum Taksonomi Mikrobia ldquoIdentifikasi Bakteri secara Molekulerrdquo dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 20 November 2014 dan hari Selasa tanggal 25 November 2014 di Laboratorium Mikrobiologi Dasar Jurusan Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Alat dan bahan yang digunakan adalah laptop data sekuens 16s DNA beberapa isolat bakteri DNA baser program BLAST online program Bioedit program dan MEGA5 program Filogeni adalah kajian hubungan kekerabatan antara kelompok organisme monofiletik atau hipotesis kekerabatan organisme yang direpresentasikan sebagai dendogram atau diagram bercabang Filogeni berperan dalam menentukan similaritas yang berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang lebih tinggi serta memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar takson Untuk bakteri dan fungi prosedur identifikasi berbasis molekuler yaitu ekstraksi DNA amplifikasi DNA sekuensing dan analisis hasil sekuen serta pembuatan pohon filogenetik Program bioinformatika yang digunakan untuk identifikasi secara molekuler adalah bioEdit Molecular Evolutionary Genetics Analysis versi 5 (MEGA5) dan analisis mengggunakan BLAST yang akan menghasilkan output berupa sekuen-sekuen yang mempunyai kemiripan dengan sekuen mikroba sampel

I PENDAHULUAN

A Latar Belakang

Saat ini telah menjadi jelas bahwa beberapa makromolekul sel dapat menjadi

acuan hubungan kekerabatan organisme tersebut dengan organisme lain Dari

penelusuran urutan monomer pada molekul informasi tertentu didapatkan bahwa

perbedaan jarak kekerabatan antara 2 organisme dapat diukur dengan melihat perbedaan

nukleotida atau urutan asam amino pada makromolekul yang homogen Hal ini dapat

dilakukan karena jumlah perbedaan sekuen pada sebuah molekul adalah proporsional

terhadap jumlah perubahan mutasi pada pengkodean DNA dua organisme tersebut

Banyak molekul yang telah diusulkan untuk dijadikan acuan dan ribosomal RNA

adalah pilihan yang sesuai Ribosomal RNA merupakan molekul yang sempurna karena

fungsinya yang konstan pada tiap organisme tersebar secara universal dan urutan

sekuennya terkonservasi dengan baik diantara anggota filogenetik yang luas Ribosom

sendiri merupakan komponen sel yang utama dengan jumlah sekitar 20000 ribosom per

sel Ribosom tersebut mengandung kira-kira 10 dari seluruh total protein dan sekitar

80 dari keseluruhan massa sel Sel bakteri mempunyai ribosom 70S yang terdiri dari

unit ribosomal kecil 30S mengandung 21 protein dan satu molekul 16S RNA yang

panjangnya 1541 basa Serta unit ribosomal besar 50S yang mengandung 36 protein satu

molekul 23S rRNA yang panjangnya 2904 basa dan satu molekul 5S rRNA yang

panjangnya 120 basa (Lewin 1994)

Sekuen ribosom yang digunakan sebagai acuan adalah 16S rRNA karena

panjangnya yang paling sesuai tidak terlalu pendek seperti pada 5S dan bila

dibandingkan dengan 23S 16S tidak terlalu panjang serta lebih mudah untuk ditangani

Sekuen gen 16S rRNA dari mikroorganisme yang baru ditemukan kemudian dapat

dibandingkan dengan pustaka sekuen 16S rRNA dari mikroorganisme lain melalui

program pelacakan datase Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

B Tujuan

1 Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan program

bioinformatika

2 Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler berdasarkan sekuen dan

dendogram

II TINJAUAN PUSTAKA

Keanekaragaman genetika dapat terjadi karena adanya perubahan nukleotida

penyusun DNA Perubahan ini mungkin dapat memperngaruhi fenotipe suatu organisme

yang dapat dipantau dengan mata telanjang atau mempengaruhi reaksi individu terhadap

lingkungan tertentu Secara umum keanekaragaman genetik dari suatu populasi dapat

terjadi karena adanya mutasi rekombinasi atau migrasi gen dari satu tempat ke tempat

lain Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD RFLP dan DGGE

membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme Amplifikasi ini

membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut

Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah

konservatif dalam genom tersebut Makin panjang primer makin harus spesifik daerah

yang diamplifikasi Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat maka

primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom

kelompok tersebut Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik

untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme Teknik ini berkembang

setelah orang menciptakan mesin DNA sequencer Pada prinsipnya polimorfisme dilihat

dari urutan atau sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme Untuk

melihat keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA

bagi organisme prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme eukaryota Perbandingan

sekuen rRNA merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi

di antara organisme bacteria archaebacteria dan eukaryot (Weisburg et al 1991)

Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut

yaitu isolasi DNA genom bakteri elektroforesis DNA Polymerase Chain Reaction

(PCR) dan sekuensing DNA Sekuens-sekuens nukelotida yang diperoleh telah tersedia

di database GenBank Upload dilakukan dengan mengakses melalui situs web GenBank

dan selanjutnya disubmit via bankit Metode skrining molekuler dilakukan dengan teknik

Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer degenerate DegFor dan

DegRev (Malik 2010)

Pendekatan analisis pada tingkat molekuler (genomik) dapat diaplikasikan pada

spesies yang belum dapat dikulturkan di laboratorium Berbagai metode dapat dilakukan

untuk menganalisis DNA diantaranya AFLP ARDRA PFGE dan lain-lain Namun dari

berbagai metode yang digunakan rRNA paling banyak digunakan sebagai marka

molekuler Pada prokariot terdapat tiga macam ribosomal RNA (rRNA) yaitu 5S rRNA

16S rRNA dan 23S rRNA Molekul 5S rRNA tersusun dari 120 basa Urutan basa

molekul tersebut sangat pendek sehingga molekul 5S rRNA tidak ideal dari segi analisis

statistika Molekul 23S rRNA tersusun dari 2900 basa Molekul ini menyulitkan analisis

karena memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang Prosedur yang telah

baku yang sudah digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik dan mendefinisikan

spesies adalah melalui amplifikasi gen 16S rRNA (Jusuf 2001) Gen 16S rRNA

merupakan komponen penting dalam sel dan sangat menguntungkan di dalam analisis

filogenetik karena terdiri atas daerah yang konservatif yang mutasinya terbatas (Madigan

et al 1997)

Analisis filogenetik suatu spesies dapat dilakukan pada karakter morfologi dan

gengen yang berada di dalam dan di luar tubuh dengan sekuen DNA mitokondria

Penggunaan sekuen DNA mitokondria memperjelas hubungan spesies secara evolusi yang

kabur akibat variasi morfologi Sekuen DNA mitokondria memperlihatkan variasi DNA

suatu populasi perubahan breeding suatu individu dan isolasi terhadap populasi tersebut

Pohon filogenetik diproses menggunakan software MEGA 51 Untuk Lokus Control

Region digunakan model Hasegawa KishinoYano (HKY) dan model Generalized Time-

Reversible (GTR) untuk Lokus 16S Analisa dan penyusunan pohon filogenetik dilakukan

dengan metode Maximum Likelihood (Twindiko dkk 2013)

III METODOLOGIA Alat dan Bahan

1 PClaptop dengan koneksi Internet

2 Data Sekuens 16s DNA dari beberapa isolat bakteri

3 DNA baser Program

4 BLAST online program

5 BioEdit program

6 Mega5 atau Mega6 program

B Langkah Kerja

1 Install seluruh software yang dibutuhkan (pada alat dan bahan)

2 Buka Software DNA Baser gt Klik pada Single File Assembly gt Input file yang

akan kita gunakan (bagian forward lalu klik add dan tambahkan bagian reverse) gt

Klik Start Sequence Assembly

3 Hapus Untrusted base gt Klik Edit gt Select from cursor to left atau right (untuk menghapus ke kiri atau kanan) gt klik edit gt Delete Base gt Lakukan pada masing2 ujung kanan-kiri forward

4 Klik View Config gt Save as gt Save (Fasta file)

5 Buka web Blast (blastncbinlmnihgov) gt Klik ldquonucleotide blastrdquo

6 Input file Fasta dari tahap sebelumnya gt Klik BLAST

7 Pilih 5 isolat untuk membandingkan dengan isolat sampel yang kita masukan gt

Klik kode Accession pada bakteri yang dipilih untuk memperoleh sekuens gt

FASTA gt Copy sekuens ke dalam notepad gt Lakukan pada semua bakteri yang

akan dibandingkan gt Save Notepad

8 Buka Software BioEdit gt Klik File gt input file notepad yang dibuat dari langkah sebelumnya gt Block semua titlenama bakteri gt Accessory Application gt ClustalW Multiple Alignment gt Run ClustalW gt Klik File gt Graphic View

9 Klik File gt Export as Rich Text gt Save (RTF file)

10 Buka Software Mega5Mega6 gt klik file gt open a filesession gt input file (sekuens yang akan dibandingkan) gt klik Align gt EditBuild Alignment gt OK gt Klik DNA

11 Klik Edit gt Insert Sequence from file gt input file notepad yang akan dibandingkan gt ok

12 Panjang basa pada sekuens yang ada disamakan panjangnya dengan penghapusan basa gt Save (MAS file) gt Klik phylogeny gt Klik ConstructTest Neighbour-Joining tree gt pilih file yang telah disimpan gt klik bootstap method pada kolom test of phyogeny gt klik p-distance pada kolom ModelMethod gt klik Compute gt Copy to Clipboard gt Copy pada MSword

Hasil yang diperoleh

Burkholderia sp WN-2 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Burkholderia sp SD001 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Contig - Kelompok 5

Burkholderia vietnamiensis

Uncultured Burkholderia sp

Burkholderia bannensis strain E25 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Burkholderia heleia strain NBRC 101817 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Pseudomonas citronellolis strain EPAn8 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Pseudomonas sp a-1-6 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Paenibacillus chibensis strain NBRC 15958 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Contig - kelompok 1

Paenibacillus favisporus strain GMP01 16S ribosomal RNA gene complete sequence

Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02

IV HASIL DAN PEMBAHASANA HASIL

Gambar 1 Pohon phylogenik dari Mega

Gambar 2 Pohon phylogenik dari NTSYS

B Pembahasan

Bioinformatika merupakan penerapan teknik komputasional untuk analisis dan

pengelolaan informasi biologis Bidang ini mencakup penerapan metode matematika

statistika dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis terutama

dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan

dengannya Contoh topik utama bioinformatika meliputi basis data untuk pengelolaan

informasi biologis penyejajaran sekuens (sequence penjajaran) prediksi struktur untuk

mengetahui bentuk struktur protein maupun struktur sekunder RNA analisis filogenetik

dan analisis ekspresi gen

Istilah bioinformatics mulai dikemukakan pada pertengahan era 1980-an untuk

mengacu pada penerapan komputer dalam biologi Namun penerapan bidang-bidang

dalam bioinformatika (seperti pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk

analisis sekuens biologis) sudah dilakukan sejak tahun 1960-an

Basis data sekuens biologis

Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpannya basis data sekuens

biologis dapat berupa basis data primer untuk menyimpan sekuens primer asam nukleat

maupun protein basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein dan basis

data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat

Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank (Amerika

Serikat) EMBL (Eropa) dan DDBJ(Inggris) (DNA Data Bank of Japan Jepang) Ketiga

basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan

cakupan masing-masing basis data Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah

submisi langsung dari periset individual proyek sekuensing genom dan pendaftaran

paten Selain berisi sekuens asam nukleat entri dalam basis data sekuens asam nukleat

umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA atau RNA) nama

organisme sumber asam nukleat tersebut dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens

asam nukleat tersebut

Sementara itu contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens

primer protein adalah PIR (Protein Information Resource Amerika Serikat) Swiss-Prot

(Eropa) dan TrEMBL (Eropa) Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam

UniProt (yang didanai terutama oleh Amerika Serikat) Entri dalam UniProt mengandung

informasi tentang sekuens protein nama organisme sumber protein pustaka yang

berkaitan dan komentar yang umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein

tersebut

Metode yang penting dalam identifikasi pada bioinformatika adalah sequence

penjajaran Penyejajaran sekuens (sequence penjajaran) adalah proses penyusunan dua

atau lebih sekuens sehingga terlihat persamaan atau perbedaan sekuens pada sampel yang

diuji dengan data pada server Hasil dari proses tersebut disebut sebagai sequence

penjajaran Baris sekuens dalam suatu penjajaran diberi sisipan (umumnya dengan tanda

ndash) sedemikian rupa sehingga kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama

di antara sekuens-sekuens tersebut Sequence penjajaran merupakan metode dasar dalam

analisis sekuens Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari

leluhur yang sama (common ancestor) Ketidakcocokan (mismatch) dalam penjajaran

diasosiasikan dengan proses mutasi sedangkan kesenjangan (gap tanda ndash)

diasosiasikan dengan adanya proses insersi atau delesi Sequence penjajaran digunakan

untuk memperoleh hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens

tersebut Dalam kaitannya dengan hal ini penjajaran juga dapat menunjukkan posisi-

posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein

yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut penting bagi struktur atau fungsi protein

tersebut

Beberapa Software atau aplikasi yang sering digunakan pada penerapan data

bioinformatika adalah sebagai berikut

BLAST

BLAST (Basic Local Penjajaran Search Tool) merupakan aplikasi yang digunakan

untuk membandingkan sequense informasi biologis secara primer seperti asam amino

protei atai basa nukleotida pada sequence DNA Aplikasi ini dapat digunakan untuk

menemukan gen yang sejenis pada beberapa organisme serta dapat digunakan untuk

memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil

sekuensing Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens

Terdapat beberapa tipe dari BLAST yang dapat digunakan berdasarkan

penggunaannya Contohnya penemuan gen dari suatu organisme yang baru saja

diketahui peneliti akan menguji keidentikan gen tersebut dengan gen dari organisme lain

yang memiliki tingkat keidentikan yang tinggi BLAST diciptakan oleh Stephen Altschul

Warren Gish Webb Miller Eugene Myers and David J Lipman dan dipublikasikan pada

Journal of Molecular Biology pada tahun 1990

Blast menggunakan metode heuristik untuk mencari tingkat keidentikan yang

tinggi Proses ini mencari kata awalan yang sering disebut dengan seeding Setelah itu

dilanjutkan dengan pembuatan local alignment yang mencari similaritas gen sampel

dengan data yang sudah ada Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk membentuk

sebuah alignment yang disusun berdasarkan tingkat keidentikan gen dan akan diketahui

tingkat kekerabatan antara gen sampel dengan data pada database

Point utama pada BLAST adalah pemasangan pasangan segmen dengan tingkat

similaritas yang tinggi (high-scoring segment pairs (HSP) yang mengandung alignment

signifikan secara statistik Program ini dapat didownload dan dijalankan menggunakan

ldquoblastallrdquo atau diakses melalui web Server BLAST dikelola oleh NCBI dan dapat

digunakan oleh siapapun BLAST didasarkan pada open-source format yang dapat

digunakan untuk merubah kode pada program sehingga muncul beberapa BLAST ldquospin-

offrdquo

Beberapa percabangan dari progam BLAST yaitu

Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)

Program ini digunakan untuk mencari sequence DNA mencari DNA yang

teridentik

Protein-protein BLAST (blastp)

Program ini digunakan untuk mencari similaritas protein sampel dengan database

Position-Specific Iterative BLAST (PSI-BLAST) (blastpgp)

Program ini digunakan untuk mencari jarak kekerabatan dari proten Pertama

dengan mencari pembentukan protein yang berrelasi Protein tersebut akan

dikombinasikan menjadi general profile sequence yang menggabungkan fitur

yang ada pada sequence Dengna pencarian protein yang berrelasi PSI-BLAST

lebih sensitif dalam pengambilan jarak kekerabatan apabila dibandingkan dengan

protein-protein BLAST

Nucleotide 6-frame translation-protein (blastx)

Program ini membandingkan konsepsual translasi frame ke enam yang merupakan

produk dari nucleotide query sequence

Nucleotide 6-frame translation-nucleotide 6-frame translation (tblastx)

Program ini merupakan program yang paling lambat dari seluruh BLAST

Program ini menterjemahkan kumpulan sequece dari enam frame yang dan

dibandingkan dengan six-frame translations dari database sequece nucleotide

Program ini bertujuan untuk mencari jarak kekerabatan yang sangat jauh antara

nucleotide sequences

Protein-nucleotide 6-frame translation (tblastn)

Program ini membandingkan kumpulan protein dengan seluruh six reading frames

dari database sequece nucleotide

Large numbers of query sequences (megablast)

Saat membandingkan input dalam jumlah yang besar megablast jauh lebih

crpat daripada program BLAST yang lain Program ini mengelola multiple input

untuk membentuk sequence dalam jumlah yang besar sebelum memulai pencarian

pada database BLAST lalu dianalisis ulang untuk mendapatkan hasil berupa

glean individual alignments dan statistical values

BioEdit

BioEdit merupakan software yang digunakan untuk editing sequence penjajaran

dan analisis sequence BioEdit dapatdigunakan untuk mengolah sequence dan penjajaran

yang sederhana BioEdit memiliki empat penjajaran manual (select and slide dynamic

grab and drag gap insert and delete by mouse click dan on-screen typing) yang

fungsinya identik dengan text editor Pada software ini asam nukleat yang berbeda

dipisahkan oleh warna yang berbeda sehingga mempermudah dalam pembacaan

sequencing Informasi yang dinamis berdasarkan penjajaran shading Point-and-click

color table editing

Kelebihan lain dari BioEdit adalah

Pengelompokan sequences menjadi beberapa kelompok atau families

Penguncian penjajaran pada sequence yang telah dikelompokan dan disinkronisasi

dengan pengaturan penjajaran sequence

Notasi sequence dengan fitur grafik yang dinamik

Penguncian sequences untuk mencegah terjadinya accidental edits

Beberapa karakter valid digunakan untuk kalkulasi pada sequence asam amino

dan nukloetida

Pengolahan data yang memiliki format Genbank Fasta Phylip 32 Phylip 4 and

NBRFPIR

Analisis perbandingan RNA termasuk kovariasi potential pairings dan analisis

kekerabatan

Pengolahan sequence mencapai 20000 sequences

Pencarian ORF

Dan masih banyak lagi

NTSYSpc (Numerical Taxonomy System)

NTSYSpc merupakan software yang dapat digunakan untuk mencari pola dan

struktur dari data yang multivariate Contohnya adalah pencarian tingkat kekerabatan

sample dengan spesies lain yang disajikan dalam bentuk phylogenetic tree menggunakan

metode neighbor-joining atau UPGMA pada konstruksi dendogram Program ini telah

diciptakan pada tahun 1960 namun saat ini telah didesain ulang untuk penggunaannya

pada PC

Beberapa Fitur dari NTSYSpc adalah sebagai berikut

Similarity and dissimilarity korelasi kekerabatan asosiasi 34 koefisien dan 11

koefisien jarak genetik

Clustering UPGMA dan SAHN methods Neighbor-joining method Several types

of consensus trees

Graph theoretic methods Jarak spanning trees Grafik (unrooted trees) dari metode

neighbor-joining

Ordination principal components amp principal coordinates analysis correspondence

analysis metric amp non-metric multidimensional scaling analysis singular-value

decompositions Variasi analisis Canonical Program untuk analisis multiple faktor

Grafik yang interaktif phenograms pohon phylogenetic 2D scatter plots

perbandingan matriks dissimilarity Procrustes plots and 3-D perspective plots

Uji Multivariate test homogenitas matriks kovarian test nomor dimensi analisis

regresi multivariate generalized

MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)

MEGA merupakan software yang digunakan untuk analisis statistik dari evolusi

molekular dan konstruksi pohon filogenik Projek ini dikembangkan oleh Masatoshi Nei

yang berkolaborasi dengan Sudhir Kumar dan Koichiro Tamura MEGA memiliki fitur

dalam pembentukan konstruksi alignment sekuens data handling Genetic code table

section real-time caption expert engine integrated text file editor sequence data viewer

MCL-based estimation of nucleotide substitution pattern substitution pattern

homogeneity test distance estimation methods test selection molecular clock test tree-

making method tree explorer

Hasil analisis pohon filogenik dengan menggunakan data golongan dari kelompok

1 menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan Paenibacillus favisporus strain GMP01

16S dan Paenibacillus chibensis strain NBRC 15958 16S Hal tersebut sesuai dengan

pernyataan Velaacutezquez et al (2004) yang menjelaskan bahwa spesies Paenibacillus

favisporus strain GMP01 16S dan Paenibacillus chibensis strain NBRC 15958 16S

memiliki kekerabatan berdasarkan urutan gen 16S rRNA yang termasuk dalam genus

Paenibacillus Sehingga kemungkinan kelompok 1 termasuk kedalam genus

Paenibacillus Kemudian pada grub tersebut berkerabat dekat dengan Pseudomonas

citronellolis strain EPAn8 16S dan Pseudomonas sp a-1-6 Pada kelompok 2

menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan kelompok 3 dan kelompok 4 Berdasarkan

sifat-sifat yang paling banyak berbeda dengan spesies-spesies yang lain maka kelompok

2 3 dan 4 menjadi outgroup dari pohon filogenetik yang dibangun Pada kelompok 5

berkerabat dekat dengan Burkholderia vietnamiensis Uncultured Burkholderia sp

Burkholderia sp WN-2 16S dan Burkholderia sp SD001 16S Dari 5 grub tersebut

berkerabat dekat dengan Burkholderia bannensis strain E25 16S dan Burkholderia heleia

strain NBRC 101817 16S Hal ini membuktikan bahwa kelompok 5 termasuk dalam

genus Burkholderia Sedangkan hasil analisis pohon filogenik dengan menggunakan data

kelompok 2 diketahui bahwa kelompok 2 berkerabat jauh dengan Pseudomonas

citronellolis strain EPAn8 16S Pseudomonas sp a-1-6 16S Pseudomonas azelaica

partial 16S Pseudomonas citronellolis strain ADC-25A 16S dan Pseudomonas sp R-

24636 16S Hal ini dibuktikan bahwa kelompok 2 menjadi outgrub dari grub

pseudomonas pada pohon filogenik yang dibangun Sehingga kelompok 2 kemungkinan

bukan termasuk genus Pseudomonas

Identifikasi molekuler bertujuan untuk membedakan suatu organisme dengan

organisme lainnya pada tingkat molekuler Organisme memiliki urutan basa DNA yang

berbeda Untuk membuktikannya dilakukan sekuensing DNA (mengurutkan basa

nitrogen) setiap individu sehingga diketahui perbedaannya

Untuk identifikasi bakteri berbasis sekuen biasanya digunakan suatu marker baik

yang terdapat pada daerah gen maupun daeah DNA non-koding dengan karakteristik

antara lain

Sebagian besar merupakan housekeeping gene yang ada pada semua bakteri

Memiliki polimorfisme yang tinggi sehingga membuatnya dapat dibedakan antara

bakteri yang juga berbeda

Marker molekuler tersebut harus bersifat sangat konservatif pada beberapa daerah

sehingga memudahkan untuk mendesain primer yang tepat untuk proses

amplifikasi dengan PCR

Ada beberapa gen dan daerah DNA yang memiliki kesemua ciri tersebut dan telah

digunakan secara luas untuk identifikasi bakteri contohnya gen 16S rRNA Gen 16S

rRNA mengkode rRNA subunit kecil ribosom organisme prokariot Gen tersebut banyak

digunakan dalam analisis filogenetik karena terdistribusi secara universal bersifat

konservatif memiliki peran penting pada ribosom dalam sintesis protein tidak ditransfer

secara horizontal serta kecepatan evolusi dengan variasi tingkat yang tepat di antara

organisme Molekul 16S rRNA memiliki daerah variabel dan konservatif dimana primer

universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA secara lengkap biasanya dipilih dari daerah

konservatif tersebut sementara daerah variabel lebih banyak digunakan untuk taksonomi

perbandingan

Dalam melakukan sekuensing gen terlebih dahulu dilakukan ekstraksi DNA

kemudian dilanjutkan dengan PCR Hasil dari amplifikasi PCR langsung digunakan

untuk analisis RLFP dengan memanfaatkan kemampuan enzim pemotong ikatan

fosfodiester (restriksi) sehingga dapat diketahui apakah DNA yang diuji ini urutan

basanya sama atau berbeda dari beberapa sampel yang diuji

Prinsip pengujian dengan RFLP ialah dengan memanfaatkan kemampuan enzim

restriksi untuk memotong DNA pada urutan tertentu Enzim restriksi memiliki sifat

ldquomemotong DNA pada bagian spesifikrdquo Jadi teknik ini mampu melihat variasi yang ada

pada setiap sampel uji Apabila suatu fragmen DNA yang berbeda mempunyai urutan

yang berbeda maka sisi pengenalan enzim restriksi ini juga akan berbeda Hasil

pemotongan yang berbeda inilah yang nantinya kita buktikan pada elektroforesis Pada

praktikum ini enzim restrikasi yang digunakan adalah MSPI

Gambar 1 Hasil analisis PCR_RLFP menggunakan enzim restriksi MspI

Berdasarkan hasil elektroforesis hasil PCR_RLFP yang menggunakan enzim

restriksi MspI dapat dilihat bahwa produk PCR dari lima isolat hanya isolat 1 3 dan 4

yang menunjukkan bahwa restriksi produk PCR menghasilkan fragmen DNA Sedangkan

pada isolat 2 5 dan 6 terjadi ketidakberhasilan pada elektroforesis sehingga tidak

menghasilkan fragmen DNA

filogeni adalah kajian hubungan kekerabatan antara kelompok organisme

monofiletik atau hipotesis kekerabatan organisme yang direpresentasikan sebagai

dendogram atau diagram bercabang Filogeni memegang peranan tersendiri dalam kajian

sistematika dan taksonomi Filogeni berperan dalam menentukan similaritas yang

berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang lebih tinggi serta

memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar takson Kajian filogeni

telah banyak berkembang dan memiliki andil besar dalam dunia sistematik dan

taksonomi Beberapa kajian telah memberikan suatu kontribusi berupa revisi atau adanya

teori baru yakni tentang hubungan kekerabatan anggota krustasea ( Wahyudi 2007)

V KESIMPULAN

1 Identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan program BLAST BioEdit

NTSYSpc dan MEGA

2 Blast merupakan software yang digunakan untuk mencari tingkat keidentikan

yang tinggi

3 BioEdit merupakan software yang digunakan untuk editing sequence penjajaran

dan analisis sequence BioEdit dapatdigunakan untuk mengolah sequence dan

penjajaran yang sederhana

4 NTSYSpc merupakan software digunakan untuk mencari pola dan struktur dari

data yang multivariate

5 MEGA merupakan software yang digunakan untuk analisis statistik dari evolusi

molekular dan konstruksi pohon filogenik

6 Identifikasi berdasarkan sekuen berfungsi untuk membedakan organisme satu

dengan lainnya Sedangkan dendogram digunakan untuk dalam menentukan

similaritas yang berguna untuk menempatkan organisme ke dalam takson yang

lebih tinggi serta memungkinkan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar

takson

DAFTAR PUSTAKA

Lewin B 1994 Genes V Oxford Univ Press Cambridge

Jusuf M 2001 Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen Sagung Seto Jakarta

Madigan M T Martinko J M amp Parker J 1997 Biology of Microorganisms Prentice Hall Upper Saddle River Press London

Malik Amarila A K Hermawati M Hestiningtyas A Soemiati dan M Radji 2010 Isolasi dan skrining molekuler bakteri asam laktat pembawa gen Glucansukrase dari makanan dan minuman mengandaung gula Makara Sains 14 63-68

Twindiko A F S Diah P W dan Ambariyanto 2013 Studi filogenetik ikan karang

genus Pseudochromis dan Pictichromis di perairan Indo-Pasifik Buletin

Oseanografi Marina 229 ndash 37

Velaacutezquez Encarna T de Miguel M Poza R Rivas R R oacute-Mora and T G Villa 2004 Paenibacillus favisporus sp nov a xylanolytic bacterium isolated from cow faeces IJSEM 5459-64

Wahyuni AJ 2007 Memperkenalkan cluster analysis of variables dalam minitab 1112 untuk kajian filogeni suku-suku krustasea (brachyura) Jurnal Oseana 3221-36

Weisburg W G Barns S M Pelletier D A Lane D J 1991 16S ribosomal DNA aplification for phylogenetic study J Bacteriol 173697-703

httpwwwexetersoftwarecomcatntsyspcntsyspchtml

unit ribosomal kecil 30S mengandung 21 protein dan satu molekul 16S RNA yang

panjangnya 1541 basa Serta unit ribosomal besar 50S yang mengandung 36 protein satu

molekul 23S rRNA yang panjangnya 2904 basa dan satu molekul 5S rRNA yang

panjangnya 120 basa (Lewin 1994)

Sekuen ribosom yang digunakan sebagai acuan adalah 16S rRNA karena

panjangnya yang paling sesuai tidak terlalu pendek seperti pada 5S dan bila

dibandingkan dengan 23S 16S tidak terlalu panjang serta lebih mudah untuk ditangani

Sekuen gen 16S rRNA dari mikroorganisme yang baru ditemukan kemudian dapat

dibandingkan dengan pustaka sekuen 16S rRNA dari mikroorganisme lain melalui

program pelacakan datase Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

B Tujuan

1 Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan program

bioinformatika

2 Mengetahui fungsi identifikasi bakteri secara molekuler berdasarkan sekuen dan

dendogram

II TINJAUAN PUSTAKA



























DegRev (Malik 2010)














et al 1997)













3 DNA baser Program


5 BioEdit program


B Langkah Kerja





















Contig - Kelompok 5








Contig - kelompok 1


Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02




B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA












II TINJAUAN PUSTAKA



























DegRev (Malik 2010)














et al 1997)













3 DNA baser Program


5 BioEdit program


B Langkah Kerja





















Contig - Kelompok 5








Contig - kelompok 1


Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02




B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA






















et al 1997)













3 DNA baser Program


5 BioEdit program


B Langkah Kerja





















Contig - Kelompok 5








Contig - kelompok 1


Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02




B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA















3 DNA baser Program


5 BioEdit program


B Langkah Kerja





















Contig - Kelompok 5








Contig - kelompok 1


Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02




B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA




























Contig - Kelompok 5








Contig - kelompok 1


Contig - Kelompok 4

Contig - Kelompok 3

Contig - kelompok2

02




B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA












B Pembahasan

































tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA














tersebut
















tersebut



BLAST

























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA



























offrdquo




teridentik




























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA






























BioEdit








color table editing








dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA















dan nukloetida


NBRFPIR


kekerabatan


Pencarian ORF








pada PC





of consensus trees


neighbor-joining














































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA




















































antara lain
















perbandingan




























V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA


































V KESIMPULAN


NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA













NTSYSpc dan MEGA


yang tinggi












takson

DAFTAR PUSTAKA












Download - Laporan Takson Acara 2

Top Related