HPLC(High Performance Liquid

Chromatography)Afdwiyarny Metta Karina (3335120245)

M. Dwi Permana R. (3335122099)

Yayan Indrayani (3335121095)

• Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan kepolaran dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

• Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

Kromatografi Kolom

Terbuka

Color

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik Injector

Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi dan kapiler pompa

Hasil pemisahan kurang baik pengemasan kolom

Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk analit tidak berwarna Detektor

Kesulitan penghitungan kadar integrator

KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebutInjector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan robotik injektor, sangat volumetrik

Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik

Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanan dapat dibuat besar Hasil pemisahan baik

Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)

Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC mudah penghitungan kadar

Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

Gambar Instrumen Alat HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas:

• wadah fase gerak,

• pompa,

• alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),

• kolom,

• detektor,

• wadah penampung buangan fase gerak, dan

• suatu komputer atau integrator atau perekam

Diagram Skematik Sistem Kromatografi Cair

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. atas

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.

Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2. Pompa

Pompa yang digunakan harus inert terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC:

• Injeksi syringe

Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.

• Injeksi ‘stop-flow’

Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

• Kran cuplikan

Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah:

• Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, cuplikan masih berada dalam loop

• Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

• Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

• Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

• Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Analisa kualitatif dan kuantitatif

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

• Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

• Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

• Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

Contoh hasil analisa HPLC

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah kompone sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori, konsep yang dipinjam dari teori distilasi. Penerapannya dalam kromatografi, jumlah teori plat N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi.

Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain :

• HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

• HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi

• Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi

• Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya

• Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)

• Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat menurunkan biaya karyawan.

• Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

keterbatasan dari teknik HPLC ini antara lain :

• Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPL dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu, keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

TERIMA KASIH