paper hplc

Venitha Dwi Hertanti240210120028

IV. PEMBAHASAN

Kromatografi adalah suatu proses migrasi diferensial dalam komponen-

komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase diam. Kromatografi

dilaksanakan dalam situasi dinamik, jadi salah satu dari kesua fase di atas

merupakan fase bergerak (mobile phase) dan lainnya merupakan fase diam

(stationary phase). Fase bergerak dapat berupa cairan atau gas, sedang fase diam

dapat berupa cairan atau padatan.

Semua jenis kromatografi , zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi

sepanjang kolom dan yang menjadi dasar pemisahan terletak dalam laju

perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Laju perpindahan sebuah

zat terlatut dapat dianggap sebagai hasil dari dua faktor. Perbedaan yang kecil

antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorpsi dan dalam interaksinya dengan

pelarut yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila molekul-molekul zat terlarut

itu berulang kali menyebar di antara dua fasa itu ke seluruh kolom (R.A. Day,

et.all, 2002).

Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan

ataucairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas).

Fasegerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari

campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada

laju yang berbeda pula.

Kromatografi cair kinerja tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) adalah bentuk kromatografi kolom sering digunakan

dalam biokimia dan kimia analitik untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

menghitung senyawa berdasarkan polaritas istimewa mereka dan interaksi dengan

yang kolom fase stasioner. HPLC ini biasanya untuk bahan yang bersifat non-

volatil atau bahan organik.

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah

memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi

(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen

tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi

tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa


kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut

dalam sample. Analisis kuantitatif harus memperhatikan :

• Parameter percobaan sama antara standar dan sampel.

• Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama.

• Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis

kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area

puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan

standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat

bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan

dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.

HPLC ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan

tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung

mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. Untuk menentukan fase

geraknya yang perlu diperhatikan adalah polar atau non-polarnya larutannya.

Untuk fase gerak pada 2 eluen yang berisi aquades dan etanol. Sedangkan untuk

fase diamnya yaitu pompa. Pompa terbagi atas pompa A dan pompa B yang

berfungsi untuk memompa dan masuk kedalam kolom (C18). Fase diam ini

terdapat silika. Pemisahan pada HPLC ini berdasarkan kepolarannya.

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Gambar 5. Output HPLC


Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas

untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah

bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri-

industri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah

senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian

(impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan

molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian

senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan

senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang

banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif

(Cupritabu, 2010). Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat

dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif

pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi

dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi

senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS).

Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik

sulit diperoleh

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase

diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada

kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase

normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat

dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada

mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam

kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi

adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam

silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai

silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang


akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas

yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat

menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi Fase Terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi

secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi

silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,

oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah

oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase

terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air

atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,

peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut

akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini

menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika

solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang

mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation

atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di

pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren

resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan

media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut

campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar

ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau

kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak

menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion

sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan Ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan

sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode

penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang

berlawanan.


5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat

digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >

2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang

bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau

berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih

besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran

medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan

solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara

partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran

ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe

kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi

yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya

dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan

sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara

antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi

protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

Keunggulan Dan Kelemahan HPLC

a) Kelebihan HPLC

HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan

zat yang tidak stabiL

HPLC memiliki detektor dengan kepekaan yang tinggi

Memiliki daya memisah yang tinggi

Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya

Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya

dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat

kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)

Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC (Liquid

Chromatography) kuno, sehingga dapat menurunkan biaya karyawan

Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar


HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri

farmasi dan pestisida.

Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar

dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah

biokimia.

Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

b) Kekurangan HPLC

Preparasi sampel yang lebih rumit karena sampel yang disiapkan saat

diinjeksikan ke HPLC harus sudah cukup bersih dari impurities agar

kromatogram tidak menumpuk.

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu

kromatogram yang terdiri atas banyak peak.

Contoh penggunaan HPLC yaitu mengukur vitamin B pada sampel yang

digunakan adalah minuman berenergi yang mengandung banyak vitamin B.

Berdasarkan tujuan dari minuman tersebut maka terdapat beberapa vitamin di

dalamnya, seperti vitamin B1, B2 dan B6.

Preparasi sampel dilakukan kemudian melakukan programming alat dan

conditioning alat, hal ini bertujuan untuk menghasilkan chromatogram yang baik

ketika sampel dan standar diinjeksikan. Programing alat dilakukan dengan

mengatur detector yang digunakan, panjang gelombang dari sampel yang akan

diinjeksikan, letak tray sampel, pompa yang digunakan serta flow rate atau laju

alir dari fase gerak tersebut. Condiitoning alat bisa dilakukan dengan mengalirkan

fase gerak yang digunakan pada program yang telah diatur selama 30 menit.

Setelah semuanya siap, standar diinjeksikan sebanyak 5-6 kali lalu diikuti

dengan injeksi sampel. Hasil yang keluar berupa peak/puncak yang dapat dilihat

luas areanya serta retention time. Retention time dari sampel dibandingkan dengan

retention time standar, jika peak yang muncul diwaktu yang sama dengan peak

pada standar maka sampel tersebut positif mengandung bahan yang sama dengan


standar. Retention time juga menunjukkan kepolaran suatu sampel, jika retention

time pendek maka sampel tersebut paling polar sedangkan retention time yang

lama menandakan bahwa sampel tersebut semakin tidak polar. Sedangkan luas

area menandakan konsentrasi dari sampel yang diinjeksikan. Berikut contoh hasil

penggunaan HPLC.

Tabel 1. StandarName RT Area Height Mount Units

1 Vit B2 2.099 785823 140200 3.450 mg/ml

2 Vit B6 5.771 7112815 675582 20.080 mg/ml

3 Vit B1 15.155 3300462 113383 26.600 mg/ml

Sumber : (Data Pribadi, 2014)

Tabel 2. Hemaviton C 1000 Name RT Area Height Mount Units

1 Vit B2 2.099

2 Vit B6 5.647 1609555 159816 4.544 mg/ml

3 Vit B1 15.155

Sumber : (Data Pribadi, 2014)

Perhitungan =

=

= 4.544

Penimbangan sampel = 1.259 gram = 1259 mgram = 1259 mgram/50 ml

= 1290 × = 25.18 mgram / ml

Vit B6 = = = 18.043%


Pada industri pangan, pengaplikasiaan alat HPLC sering digunakan untuk

mengetahui kadar trigliserida minyak dan lemak. Aplikasi lain penggunaan HPLC

pada analisa pangan sangat beragam, seperti untuk karbohidrat, HPLC bisa

digunakan untuk gula dengan titik leleh rendah serta oligosakarida. Penentuan

secara kuantitatif karbohidrat dalam bahan pangan dengan HPLC juga sudah

menjadi standar baku. Untuk lipid yang kompleks, yang memiliki volatilitas

rendah serta yang struktur kimianya sensitif terhadap suhu tinggi, HPLC juga

menjadi pilihan terbaik. Kemudian, HPLC juga dapat digunakan penentuan kadar

vitamin dalam bahan pangan. Selain itu, yang juga banyak dilakukan adalah

penggunaan HPLC untuk melihat komposisi asam amino dalam protein.


DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A. dan A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Penerbit Erlangga, Jakarta.

Sudarmadji, S., B. Haryono, dan Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty, Yogyakarta.

Winarno, F.G.. 1991. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

paper hplc

Documents