ENENTUAN METHEMOGLOBINDENGAN SPEKTROFOTOMETRI

Pengantar

Fungsi utama hemoglobin adalah untuk mengangkut oksigen dan karbon dioksida di dalam tubuh.Molekul hemoglobin normal terdiri dari empat rantai polipeptida yang disebut globin, yang secara protektif membungkus sekitar empat subunit berpigmen yang disebut heme.Setiap hemes mengandung besi dalam bentuferro (Fe2+) yang dapat mengikat secara reversibel dengan molekul oksigen tunggal.

Methemoglobin adalah bentuk hemoglobin yang abnormal yang memiliki kapasitas untuk mampu mengurangipembawaan oksigen.Methemoglobin diproduksi ketika besi ferro (Fe2+) dalam molekul heme yang teroksidasi menjadi bentuk ferri (Fe3+).Sementara dalam bentuk teroksidasi, besi ferri dalam subunit heme tidak mampu mengikat oksigen.Senyawa ini tidak dapat memberikan oksigen ke jaringan, karena itu, hal ini menguntungkan untuk mengubah 3+ hemoglobin ke bentuk ferro 2+ sehingga jaringan bisa mendapatkan oksigen yang mereka butuhkan.

Adanya substansi teroksidasi endogen dan eksogen yang konstan menghasilkan pembentukan methemoglobin secara terus-menerus.Pada individu normal, tingkat methemoglobin dipertahankan di bawah 1% melalui dua jalur metabolisme.Jalur utama melibatkan reduksi enzimatik dari produk glikolitik NAD menjadi NADH (Nikotinamida adenin dinukleotida).NADH kemudian bertindak sebagai donor elektron dalam reduksi besi ferri (Fe3+) methemoglobin menjadi bentuk ferro (Fe2+).Enzim NADH methemoglobin reduktase diperlukan untuk reduksi NAD dan methemoglobin.

Dalam eritrosit, proses reduksi enzimatik methemoglobin juga dapat dicapai melalui reduksi NADP yang dihasilkan melalui jalur heksosa monofosfat.NADPH kemudian bertindak sebagai agen pereduksi dalam konversi tergantung dari enzim methemoglobin dengan hemoglobin.Sementara jalur ini memiliki peran sangat kecil dalam reduksi harian methemoglobin, hal ini dapat menyebabkan adanya donor elektron eksogen, seperti metilen blue.Ketika diberikan metilen blue teradministrasi,hal ini kan terkonversi menjadi sebuah agen reduksi kuat yang disebut leukomethyleneblue oleh NADPD.Leukomethylene blue kemudian dapat bereaksi dengan methemoglobin yang mengakibatkan terjadinya proses reduksi pada hemoglobin dan perbaikan kapasitas pembawa oksigen normal.

Terdapat sejumlah obat-obatan dan agen toksik yang dapat mengkonversi hemoglobin menjadi methemoglobin, seperti nitrat, klorat, quinines, phenacetin, sulfonamide, pewarna anilin, dan anestesi lokal seperti prokain, benzocaines, danlidokain.Mekanisme yang tepat dari toksisitas bervariasi antara tiap agen.Beberapa agen memiliki efek mengoksidasi langsung pada hemoglobin sementara agen lainnya menyebabkan pembentukan radikal oksigen dan radikal bebas peroksida, yang mampu mengoksidasi hemoglobin.

Perkembangan methemoglobinemia diikuti oleh paparan pada substansi oksidatif yang tidak terbatas pada rute oral.Secara klinis, level methemoglobin yang signifikan telah diamati pada pasien yang telah mengalami paparan melaui kulit pada nitrit yang mudah menguap, metode umum dari penyalahgunaan substansi, juga menghasilkan methemoglobin.

Presentasi Klinis

Tanda dan gejala methemoglobinemia adalah sama terlepas dari etiologi, namun onset waktu mereka dan durasi adalah agen yang spesifik.Bagi banyak agen, awal methemoglobinemia ini dalam waktu 1-2 jam, tetapi ditunda untuk agen lain seperti dapson dan nitroethane.Ketika kadar methemoglobine di bawah 10% biasanya tidak ada gejala.Perubahan warna kulit sianotik adalah tipically diamati pada tingkat yang lebih besar dari 15% dan sering salah satu fitur yang terbukti secara klinis awal methemoglobinemia.Sebagai tingkat naikmethemoglobinemia, keparahan meningkat (Tabel 1).Toksisitas yang serius diharapkan dengan tingkat yang lebih besar dari 50%, dan tingkat di atas 70% berhubungan dengan kematian.

Tabel 1.Konsentrasi methemoglobin dan gejala

KonsentrasiGejala

15 - 20 %cyanosis, chocolate brown arterial blood

20 - 50 %kelelahan, kelemahan, pusing, gelisah, kebingungan, sakit kepala, dispnea, takikardia

50 - 70 %lesu, stupor, asidosis, koma, kejang, arrhytmias

Prinsip

Spektrum absorbansi dari methemoglobin nampak sedikit, puncak karakteristiknya pada gelombang 630-635 nm.Penambahan sianamida menghilangkan puncak ini dengan mengkonversi methemoglobin menjadi cyanmethemoglobin.Penurunan absorbansi sebanding dengan konsentrasi methemoglobin.

Spektrum absorbansi yang normal pada oksihemoglobin menunjukkan absorbansi yang sangat sedikit di atas 600 nm.Namun, jika sulfhemoglobin terdapatdi dalam hemolisat, terdapat peningkatan besar dalam kurva absorpsi pada kisaran 600-620nm.Nilai stabil Sulfhemoglobin tidak terpengaruh terhadap sianida.

Spesimen

Darah segar dari atau yang diberi antikoagulasi dengan heparin, EDTA atau larutan ACD (asam-sitrat-dekstrosa).Tidak dibutuhkan pembatasan atau tidak perlu puasa makanan dan minuman.

Reagen

1. Hemoglobin standar 13%

2. Potassium ferricyanide [K3Fe(CN)6].Pelarut 2,0 g [K3Fe(CN)6] yang disuling dan dilarutkan pada 10,0 mL H2O.Jika disimpan dalam botol coklat pada suhu 4C, larutan ini stabil setidaknya selama satu tahun

3. Larutan potassium sianida.(PERHATIAN: racun mematikan).Pelarut 500 mg KCN yang disuling dan dilarutkan pada 10,0 mL H2O. Label "RACUN"stabil pada suhu 20C selama minimal 4 bulan.

4. Buffer potassium fosfat 0,15 mol / L, pH 6,6 (200C).Pelarut 17,1 g K2HPO4 yang disuling pada air.Transfer larutan KH2P04 ke dalam gelas kimia 2L dan menambahkan volume larutan K2HPO4.Tempatkan elektroda pH dalam gelas kimia.Kemudian perlahan-lahan menambahkan lebih banyak larutan K2HPO4, dengan pengadukan yang konstan, sampai tercampur dan menunjukkan pH 6,6.Simpan pada 40C.Buang larutanketika larutan terlihat keruh.Buffer yang baru harus disiapkan setidaknya sekali setiap tiga bulan

Prosedur

1. Siapkan cuvet blanko yang berisi 1,5 ml buffer fosfat dan 1,5 mL H2O.Tandai kuvet ini dengan label C1

2. Masukkan 0,1 mL darah menggunakan pipet ke dalam tabung reaksi berisi 3,0 ml pelarut H2O, dikocok melingkar agar tercampur dengan baik

3. Tambahkan 0,4 mL buffer potassium fosfat dan aduk rata

4. Memindahkan 3 mL hemolisat ke dalam 2 cuvet.Beri label C2 dan C3

5. Pada cuvet C3, tambahkan 0,1 mL larutan [K3Fe(CN)6].Tutup dengan parafilm, campur dengan membolak-balikkan kuvet sebanyak3x, dan menghitung absorbansi pada menit ke-2

6. Menghitung absorbansi pada 630 nm untuk cuvet C2 dan C3, menggunakan C1 sebagai blanko.Catat sebagai A2A dan A3a7. Tambahkan 0,1 mL KCN pada semua cuvet.(tambahkan 2 tetes denganmenggunakan pipet transfer yang dilengkapi dengan bohlam karet).Campur dengan membolak-balikkan kuvet sebanyak3xdan diamkan selama 5 menit

8. Hitung absorbansi pada 630 nm untuk cuvet C2 dan C3 dengan C1 sebagai blanko. Catat sebagai A2b dan A3bPerhitungan

A2A - A2bMethemoglobin (persen dari pigmen total) = 100 --------------------A3a - A3b

Referensi Range: 0 - 1%

Komentar dan Kewaspadaan

Solusi hemoglobin sedikit keruh, namun, karena kekeruhan tidak berubah dengan penambahan [K3Fe(CN)6] atau KCN, absorbansi menyebabkan sama untuk kedua pembacaan dengan masing-masing cuvet dan karena itu kompensasi dalam perhitungan ini.Metode sederhana ini memuaskan untuk pengujian methemoglobin jika uji sulfhemoglobin tidak diperlukan.