PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.

Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan elektrokimia.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.

Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

ISI

2.1 Perkembangan Kromatografi

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).

Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).

Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah

berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid Chromatography.

2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLC

Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).

Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.

Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.

ü Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum.

ü Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.

ü Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.

ü Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.

ü Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0.

Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

2.3 Komponen-Komponen Penting Dari HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerakWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang

luas.4) Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. PompaPompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampelSampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diamAda 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

5. Detektor HPLCDetektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang

sangat kecil.3. Stabil dalam pengopersiannya.4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas

(kisaran dinamis linier).6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas (g/ml)

Kisaran linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-visFotometer filterSpektrofotometerspektrometer photo-diode array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien

ElektrokimiaKonduktimetriAmperometri

10-8

10-12104

105Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

JENIS HPLCPemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak

yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang

sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks

2.4 Pengolahan Data (Data Handling) (Analisa Kualitatif dan Kuantitatif)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

2.5 Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.

Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat;

a. Fasa Normal •Fasa gerak nonpolar •Fasa diam polar

b. Fasa Terbalik •Fasa gerak polar •Fasa diam nonpolar

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter- parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:

1. Komposisi dari fase gerak

2. Laju alir

3. Sifat kimia dari fase gerak

4. Jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif.

Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

C = Konsentrasi X = sampel

P = pembanding

Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar. HPLC yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom.

Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

2.6 Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:

ü Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

ü Mudah melaksanakannya

ü Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

ü Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik

ü Dapat digunakan bermacam- macam detektor

ü Kolom dapat digunakan kembali

ü Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.

ü Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas

ü Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

ü Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

ü Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

ü Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.

ü Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC

ü Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan

ü Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

ü Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.

ü Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

ü Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

ü Hanya bisa digunakan untuk asam organic

ü Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

ü Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan data.

b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

3.2 Saran

Penulis berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan dapat menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.