7/22/2019 HPLC KAI

1/54

Adi Yugatama, S.Farm., Apt.

Jurusan Farmasi FKIK UNSOED

2013

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI (KCKT)

7/22/2019 HPLC KAI

2/54

Kromatografi

Suatu teknik pemisahan campuran menjadi komponennyaberdasarkan perbedaan migrasi masing-masing komponennyadalam fase diam akibat pengaruh dari fase gerak

Separate

Analyze

Identify

Purify

QuantifyComponentsMixture

7/22/2019 HPLC KAI

3/54

Kromatografi KolomTerbuka

ColorSistem pemasukan sampel: manual, tidak

volumetrik Injector

Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi

dan kapiler

pompaHasil pemisahan kurang baik pengemasankolom

Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk

analit tidak berwarna Detektor

Kesulitan penghitungan kadar integrator

7/22/2019 HPLC KAI

4/54

KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka

untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut

Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan robotikinjektor, sangat volumetrik

Pompa:Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik

Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanandapat dibuat besar Hasil pemisahan baik

Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)

Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuCmudah penghitungan kadar

Sehingga disebut: KinerjaTinggi

7/22/2019 HPLC KAI

5/54

KCKT (HPLC)

7/22/2019 HPLC KAI

6/54

Keuntungan KCKT

Waktu analisis cukup singkat, umunya 5-30 menit.

Resolusi R = 11,5

Fase gerak, kolom (fase diam), dan detektor banyakpilihannya.

Dapat digunakan untuk penentuan beraneka macam senyawa(mikro sampai makro-molekul) termasuk senyawa khiral.

Dapat dipadukan dengan instrumen fisiko kimia lainnya,

contohnya: LC/MS.

7/22/2019 HPLC KAI

7/54

Kelemahan KCKT

Tidak dapat digunakan untuk identifikasi struktur suatusenyawa (kecuali jika dihubungkan dengan spektrofotometermassa (MS)).

Jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang sangatbaik sukar diperoleh.

Biaya pelaksanaan analisis cukup mahal.

7/22/2019 HPLC KAI

8/54

7/22/2019 HPLC KAI

9/54

BAGAN SISTEM KCKT

pompa

injektor

kolom

oven

detektor

Wadah

solvenintegrator

7/22/2019 HPLC KAI

10/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

11/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

12/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

13/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

14/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

15/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

16/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

17/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

18/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

19/54

Priming HPLC System

7/22/2019 HPLC KAI

20/54

Priming the HPLC

Flow

Purge Valve

Waste Capillary

7/22/2019 HPLC KAI

21/54

WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak

Mempunyai sistem penyaring

7/22/2019 HPLC KAI

22/54

POMPAMerupakan sistem agar fase gerak mengalir.Kinerja pompa yang diinginkan : Tekanan yang dihasilkan tinggi

Fluktuasi tekanan rendah

Kecepatan aliran fase gerak tepat

7/22/2019 HPLC KAI

23/54

Column

Column

Pump

[LOAD][INJECT]

Pump

INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem KCKT

7/22/2019 HPLC KAI

24/54

kolom

posisi loadPosisi inject

pompa pompa kolom

sample loop

Sistem sample loop injektor

7/22/2019 HPLC KAI

25/54

OVEN KOLOMinstrumen pemanas

Syarat :1. Keseragaman temperatur yang baik

2. Kestabilan temperatur yang baik

3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik

7/22/2019 HPLC KAI

26/54

Kolom pada KCKT

Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih kompak, hasil

pemisahan lebih baik

Dapat dipakai berulang

7/22/2019 HPLC KAI

27/54

Yang umum dipakai

Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)

Detektor Photodiode Array (PDA)

Detektor Fluorescence (RF)

Detektor Konduktivitas (CDD) Detektor Refraktive Indeks (RID)

Detektor Elektrokimia (ECD)

Detektor Spektrometer Massa

DETEKTOR HPLC

7/22/2019 HPLC KAI

28/54

7/22/2019 HPLC KAI

29/54

7/22/2019 HPLC KAI

30/54

7/22/2019 HPLC KAI

31/54

7/22/2019 HPLC KAI

32/54

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam

KCKT

Sifat dan parameter kimia-fisika fase gerak Pemilihan pompa KCKT

Pemilihan kolom KCKT

Pemilihan detektor KCKT Pengenalan perangkat lunak, evaluasi data, dan penyuguhan

data analisis

7/22/2019 HPLC KAI

33/54

Fase Gerak KCKT

Fase gerak harus dari derajat pro HPLC Fase gerak air dari aqua pro injection

Fase gerak bebas dari N2 dan O2 terlarut

Perhatikan immiscible solvent pada elusi isokratik dan elusigradient

Kecepatan alir fase gerak dengan perubahan kecepatanbertahap 0,5 mL/menit pada rentang kecepatan alir 0,1 mL

10 mL/menit

7/22/2019 HPLC KAI

34/54

Macam fase gerak pada KCKT

7/22/2019 HPLC KAI

35/54

Solvent MiscibilityName

Acetic Acid

Acetone

AcetonitrileBenzeneButyl Alcohol

Carbon Tetrachloride

ChloroformCyclohexane

Cyclopentane

Dichloroethane

Dichloromethane

DimethylformamideDimethyl Sulfoxide

DioxanEthylacetate

Ethyl Alcohol

Di-EthyletherHeptane

HexaneMethyl Alcohol

Methylethyl Ketone

I-Octane

PentaneI-Propyl Alcohol

Tetrachloroethane

Tetrahydrofuran

Toluene

TrichloroethaneWater

Xylene

Di-Propylether

Immiscible

Miscible

2-Propanol is an excellentintermediate solvent

7/22/2019 HPLC KAI

36/54

Solven digessing

Tujuan:Mengeluarkan oksigen dan nitrogen terlarut dalam fase gerakuntuk menghindari gangguan pada garis dasar kromatogram(based line drift).

Caranya:

1. Pengaliran He

2. Refluks

3. Vakum4. Ultrasonik

7/22/2019 HPLC KAI

37/54

Pompa KCKT

Syaratnya adalah inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat,

teflon, dan batu nilam.

Pompa sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir3 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa adalah menjamin prosespenghantaran fase gerak berlangsung tepat, reprodusibel,konstan, dan bebas dari gangguan.

7/22/2019 HPLC KAI

38/54

7/22/2019 HPLC KAI

39/54

Preparasi Sampel

Larutkan sampel dengan fase gerak. Saring larutan sampel dengan microphore atau syringe filter

7/22/2019 HPLC KAI

40/54

Kolom KCKT

Terdapat 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolomkonvensional dan kolom mikrobor.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan dibanding kolomkonvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak hanya 80% atau lebih sedikit, karena

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 L/menit)

Lebih ideal jika digabung dengan spektro massa

Sensitivitas lebih bagus Kolom mikrobor tidak setahan kolom konvensional dan

kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

7/22/2019 HPLC KAI

41/54

Pemilihan Kolom KCKT

Coba-coba Menyamakan dengan analit lain yang struktur molekulnya

mirip

Informasi dari kolega para kromatografiwan

7/22/2019 HPLC KAI

42/54

Pemeliharaan Kolom KCKT

Fase gerak harus derajat Pro HPLC. Saring sampel dengan microphore

pH fase gerak = 3,07,0

Temperatur kolom tidak lebih dari 60C Cuci kolom sesudah dan sebelum analisis

Kolom yang tidak dipakai disimpan dengan ujung tertutupaluminium foil/direndam dengan pelarut organik yang sesuai

Hindarkan kolom dari benturan fisik

7/22/2019 HPLC KAI

43/54

Fase Diam pada KCKT

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yangdimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi,atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.

Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya

residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi menggunakan reagen

seperti klorosilanberinteraksi dgn gugus silanol danmenggantinya dgn gugus fungsional yg lain.

Hasil diperoleh silika fase terikat yang stabil terhadaphidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan.

7/22/2019 HPLC KAI

44/54

7/22/2019 HPLC KAI

45/54

Fase Diam pada KCKT

Oktadesil silika (ODS atau C18) fase diam yang palingbanyak digunakan karena mampu memisahkan senyawadengan kepolaran yang rendah, sedang, atau tinggi.

Solut yang polar terutama bersifat basa akan memberikan

puncak yang mengekor (tailing peak) pada penggunaan fasediam silika terikat.

Disebabkan adanya interaksi adsorpsi antara solut denganresidu silanol dan pengotor logam yang ada pada silika.

Pengatasannya dengan menutup residu silanol dgn gugustrimeilsilil dan menggunakan silika dengan kemurnian tinggi(kandungan logam < 1 ppm).

7/22/2019 HPLC KAI

46/54

7/22/2019 HPLC KAI

47/54

Persyaratan Detektor

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat danreprodusibel

Mempunyai sensitifitas yang tinggi

Stabil dalam pengoperasiannya

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasisolut pada kisaran yang luas

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase

gerak

7/22/2019 HPLC KAI

48/54

Jenis Detektor KCKT

UV/Vis; 63%Indeks Bias;10%

Elektrokimia;10%

Fluoresensi; 8%

Konduktrimetri;5% Lain-lain; 4%

7/22/2019 HPLC KAI

49/54

Detektor Spektrofotometri UV-Vis

Detektor yang paling banyak digunakan dan berguna untukanalisis bidang farmasi.

Dapat berupa detektor dengan panjang gelombang tetap(misal 254, 280, 334, dan 436 nm) dan detektor dengan

panjang gelombang bervariasi.

7/22/2019 HPLC KAI

50/54

Detektor Photodiode-array (PDA)

Detektor PDA adalah detektor UV-Vis yang mampumemberikan kumpulan kromatogram secara simultan padapanjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses.

Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang

gelombang yang diinginkan (biasanya 190-400) dapatditampilkan.

PDA memberikan lebih banyak informasi komposisi sampeldibandingkan detektor UV/Vis.

7/22/2019 HPLC KAI

51/54

Detektor Fluoresensi

Fluoresensi adalah fenomena luminisensi yang terjadi ektikasuatu senyawa menyerap sinar UV atau visibel lalumengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar.

Detektor ini sangat spesifik dan sensitif.

7/22/2019 HPLC KAI

52/54

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias adalah detektor yang bersifat universalyang mampu memberikan respon pada setiap zat terlarut.

Detektor ini merespon setiap perbedaan indeks bias antaraanalit dengan pelarutnya.

Detektor ini terutama untuk senyawa-senyawa yang tidakmempunyai kromofor.

7/22/2019 HPLC KAI

53/54

Detektor Elektrokimia

Banyak senyawa organik dapat dioksidasi atau direduksi secaraelektrokimia pada elektroda yang cocok.

Kepekaan detektor elektrokimia pada umumnya tinggi.

Detektor elektrokimia yang paling banyak digunakan adalah

detektor konduktivitas dan detektor amperometri.

Keuntungan detektor ini adalah kepekaan yang tinggi,sedangkan kelemahannya adalah membutuhkan keterampilandan latihan yang cukup untuk mengoperasikan supaya didapat

baseline yang stabil.

7/22/2019 HPLC KAI

54/54