1

BAB IPENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Perkembangan Kromatografi gas sebagai tekhnik analisis berjalan dengan suatu ledakan teknologi yang membawa revolusi dalam peralatan ilmiah. Pada akhir tahun1960-an para analis menjadi terbiasa dengan pemisahan campuran yang sangat rumit dalam beberapa menit atau bahkan detik dengan hasil yang sangat baik, dengan integrasi elektronik untuk mendapatkan luasan di bawah pita elusi maupun keluaran komputer dari analisis yang sempurna. Kuantitas nanogram, gram dan bahkan kadang-kadang pikogram, dapat dideteksi pada beberapa kasus yang mudah (1 nanogram = 10-19 gram; pikogram = 10-12 gram). Adalah bisa bagi penggunaan GC tidaklah tepat, untuk menginginkankemampuan yang serupa dengan kromatografi cair. Meskipun kromatografi gas memiliki kecepatan dan sensitivitas serta fungsi yang lebih dibanding teknik kromatografi kolom cair dalam mendeskripsikan pemisahan suatu senyawa, namun GC hanya proses distribusi satu fasa sajalah yang berperan penting, dimana hanya terdapat antaraksi cairan stasioner ditambah dengan parameter-parameter operasi temperatur dan laju reaksi. Dalam GC, perilaku molekul yang terlarut dalam fasa uap tidak bergantung pada kehadiran gas lainnya. Berbeda dengan LC, zat yang terlarut berinteraksi kuat dengan dengan cairan fasa bergerak, dimana interaksi fasa stasioner berpengaruh besar terhadap pengendalian retensi yang tidak terdapat dalam GC.

Perkembangan teknologi yang terus meningkat, menjelaskan bahwa LC kini kurang efisisen dalam penggunaannya, terutama dalam mendeteksi pemisahan pada sampel yang lebih kecil. Teknik LC yang sekarang dianggap merupakan kromatografi cair klasikal awalnya menggunakan pendekatan dengan menggunakan permukaan relatif diantara kolom dan aliran dasar yang kecil dibawah kebutuhan gravitasi atau tekanan yang rendah. Kekurangan LC yang lainnya yaitu waktu pemisahan yang memerlukan beberapa jam, pengumpulan fraksi yang harus dilakukan dengan pemisahan analising, penggunaannya yang belum otomatis, dan masih belum sesuai dengan sampel yang lebih kecil yang harus ditingkatkan kecepatannya, serta segala hal yang perlu diubah pada LC dengan pendekatan-pendekatan yang lebih modern.

Sebagai LC modern, HPLC muncul untuk meminimalisasi pekerjaan, kemampuan teknolgi, dan teori untuk memandu pengembanagn pada jalur yang rasional. ( Pada beberapa tulisan “HP” pada HPLC diartikan “tekanan tinggi”(high pressure) dan beberapa lainnya yang menghubungkan dengan masalah biaya bisa berpikir bahwa “HP” adalah singkatan dari biaya tinggi(high price) tetapi kebanyakan “HP” itu berarti “penampilan yang tinggi”(high performance).

Dengan kelebihannya, HPLC sendiri diantaranya digunakan pada proses pemisaha dan pengukuran untuk menghasilkan senyawa atau bahan dengan mudah dalam beberapa menit. HPLC diharapkan dapat memudahkan pemisahan-pemisahan senyawa yang lebih baik dalam komponen-komponen pada campuran.

B. TUJUAN

Pada pembahasan ini diberikan beberapa tujuan, yakni :1. Mengetahui latar belakang beralihnya penggunaan LC sebagai pemisahan komponen

cair hingga menjadi HPLC.2. Mengetahui prinsip dasar HPLC.3. Mengetahui instrumen-instrumen dari HPLC.4. Menjelaskan cara kerja instrumen HPLC.5. Mengetahui manfaat serta beberapa aplikasi penggunaan HPLC.C. RUMUSAN MASALAH

Adapun rumusan masalah yang diberikan yaitu : 1. Bagaimana latar belakang penggunaan HPLC sebagai pengganti LC daalam pemisahan

komponen cair ?2. Jelaskan prinsip dasar penggunaan HPLC!3. Sebutkan instrumen-instrumen dari HPLC! 4. Jelaskan cara kerja instrumen HPLC!5. Jelaskan beberapa aplikasi penggunaan HPLC!

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

A. LATAR BELAKANG PENGGUNAAN HPLC SEBAGAI PENGGANTI LCHPLC (High Performance liquid Chromatography) merupakan teknik dari aplikasi

LC (Liquid Chromatography) yang efisiensinya tinggi, baik daya pemisahan, dan kecepatan analisisnya. HPLC memiliki efisiensi yang sepadan dengan GLC (Gas Liquid Chromatography), dimana fasa bergerak memiliki kecepatan yang tinggi. HPLC juga merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.

LC sendiri merupakan bentuk kromatografi kolom dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan menunjang. Terdapat beberapa jenis LC (Liquid Chromatography) secara umum yakni:1. LSC (Liquid Solid Chromatography)

LSC termasuk kromatografi cair klasik yang kurang efisien terutama karena memerlukan waktu yang lama dalam menganalisis. Proses dasarnya pada LSC ini adalah metode adsorbsi murni, sebagai contoh silika maupun alumina dimasukkan kedalam kolom dan dielusi dengan larutan yang cocok.

2. LLC (Liquid Liquid Chromatography)Dengan proses dasarnya adalah partisi. Teknik LLC ini tergantung pada partisi zat

padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak

1

kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)

Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.

Kekurangan LC sendiri sebagai kromatografi cairan kolom klasik yaitu bahwa fasa cair yang bergerak mengalir secara lambat lewat kolom hanya dengan gravitasi. Metode maupun teori LC seperti LLC dan LSC memiliki ciri efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 μm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa.

Kelebihan dari HPLC dibandingkan LC konvensionalHPLC menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain: a. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat

diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai. Hal ini disebabkan karena HPLC dilengkapi dengan pompa yang menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu yang digunakan lebih sedikit. Pada pompa dikenal dua system dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masing-masing pompa mengatur laju alirlarutanyangberbeda.

b. Waktu retensi dapat ditentukan dengan mudah : yakni waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detector dan diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.waktu retensi ini biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, temperature , dan kolom.

c. Resolusi : Berbeda dengan GC, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada GC, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan fasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

d. Daya pisahnya baik

e. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. HPLC mempunyaibeberapa detektor yakni detektor fluoresensi, elektrokimia dan fluorometrik yang dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC.

f. Peka : kepekaan sangan bergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan.g. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi yakni dengan direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.

h. Keunggulan kolom HPLC: yakni kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC ≤ 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas dan mempengaruhi kesempurnan pemisahan yang lebih baik. Panjang kolom HPLC sendiri adalah 150-250 mm.

i. Dapat menganalisis zat dengan molekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan GC karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis spesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion sangat cocok untuk mengalisis zat – zat tersebut.

j. Dapat menghitung sampel dengan kadar yang rendah : hal ini bergantung pada detektor yang digunakan, namun deyektor HPLC dapat mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt (part per trillion)

k. Mudah rekoveri (memperoleh kembali) sampel : Umumnya detektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Sebagai gambaran berikut serangkaian instrumen HPLC

Gambar 1. Dionex DX-500 High Performance Liquid Chromatography

B. PRINSIP DASAR HPLC

Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada

1

bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.1. Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.2. Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

a. Parameter percobaan sama antara standar dan sampelb. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang samac. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan

larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. d. Berdasarkan area kromatograme. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

C. INSTRUMEN DARI HPLC

Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC dapat dilihat pada diagram blok HPLC berikut :

Gambar 2. Diagram Blok HPLC

1. Fasa gerak Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu

dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan defektor 4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

2. Pompa Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada

dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

a. Pompa reciprocating.Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),

oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan

1

garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. b. Pompa syringe

memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Gambar 3. HPLC Pump

3. Injektor (injector) Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi

yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum : Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Berikut digambarkan sampel injektor pada HPLC yaitu

Gambar 4. 4 Port Internal Sample Injector

4. Kolom (Column) Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis

tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada

temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography (EC).Berikut beberapa contoh kolom yang digunakan dalam HPLC

A. Analytical Columns – 50 to 300mm lengths, 4.6mm i.d.B. Short Columns – 10 or 50mm lengths, 4.6mm i.d.C. Narrow-Bore Columns – 50 to 300mm lengths, 3.0mm i.d.Smaller i.d. significantly reduces solvent usage. Compatible with both APCI and ESI.D. Capillary and LC/MS Columns – 50 to 300mm lengths, 150μm-2.1mm i.d.Small-bore columns compatible with LC/MS instrumentation.E. Preparative Columns – 50 to 300mm lengths, 7-50mm i.d.High volume and mass loading capacity.

1

5. Detektor (Detector) Adalah suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang

modern. Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).

Berikut detektor yang digunakan pada HPLCa. Klasifikasi detektor

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan : 1) Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul

sampel maupun fase gerak (bulk property detector) yaitu: Detektorindeksbias

merupakan detektor yang luas penggunaannya. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.a) Detektor konduktivitasb) Detektor tetapan dielektrika

2) Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (solute property detector) terdiri atas

a) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)

Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan

pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Kelebihan dari detektor ultrsviolet yaitu : sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi mudah operasinya digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang

gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Detektor polarografi dan radioaktif Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran.

b. Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu: 1)Detektorspektrofotometrik Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi.

Gambar 5. Detektor Spektrofotometri

3) DetektorFluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).

A. Analytical Columns – 50 to 300mm lengths, 4.6mm i.d.B. Short Columns – 10 or 50mm lengths, 4.6mm i.d.C. Narrow-Bore Columns – 50 to 300mm lengths, 3.0mm i.d.Smaller i.d. significantly reduces solvent usage. Compatible with both APCI and ESI.D. Capillary and LC/MS Columns – 50 to 300mm lengths, 150μm-2.1mm i.d.Small-bore columns compatible with LC/MS instrumentation.E. Preparative Columns – 50 to 300mm lengths, 7-50mm i.d.High volume and mass loading capacity.

1

Gambar 6. DetektorFluorometrik

3) Detektor Elektrokimia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer electron.

Gambar 7. Detektor elektrokimia

c.Desaindetector Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.d. Pemilihan detektor Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut : cukup sensitive

stabilitas dan keterulangan tinggi respon linear terhadap solute waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir relibilitas tinggi dan mudah digunakan tidak merusak cuplikan

6. Pengolahan DataHasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk

kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar berikut ini :

Gambar 3.2 : Kromatogram Dari Senyawa 5’ Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif

D. LANGKAH ANALISA INSTRUMEN HPLC

Mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom dalam tekanan tinggi. Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak agar dapat mengetahui kadar analit.

1

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.

Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai fungsi dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam. Hal ini sesuai dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai dengan prinsip tersebut maka komponen yang hidrofob dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan komponen yang hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah. Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruang pembuangan dari HPLC ini dicuci.

E. APLIKASI PENGGUNAAN INSTRUMEN HPLC

Berikut beberapa aplikasi pada penggunaan instrumen HPLC yaitu :1. Analisis Anion Nitrat (NO3

-)Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau

bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri. Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.2. Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.

Gambar 7. Susunan vitamin C

Keadaan vitamin C inaktif ini sering terjadi pada proses pemanasan (bila sayur-sayuran dimasak). Di dalam suasana asam vitamin ini lebih stabil daripada dalam basa yang menjadi inaktif (diketogulonic acid) (Prawirokusumo, 1991).3. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp terdapat komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol, heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi. Dalam hal ini, dibutuhkan cara eluasi gradient dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip pasangan ion.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia, diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.

1

Gambar 8. Senyawa Curcumin

4. Pengukuran Tingkat Kematangan Buah ManggisMutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang

menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak. 5. Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman

ObatSecara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain

melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).

Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan Karanganyar.

6. Uji kemumian sejumlah 277 obat/bahan obat diantaranya a. Tablet Asetazolamida b. Asetilsistein c. Larutan Asetilsistein d. Asam Folat e. Tablet Asam Folat f. Asam Mefenarnat g. Kapsul Asam Mefenamat h. Asiklovir i. Tablet Allopurinol j. dll

BAB IIIPENUTUP

A. KESIMPULAN

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. Ada dua tahap dalam analisis dengan menggunakan HPLC yaitu proses separasi/pemisahan dan identifikasi. HPL memilki kelebihan dibanding kromatografi cair konvensional yakni waktu analisis yang cepat, waktu resensi yang mudah ditentukan,tingkat reolusi yang tinggi, detector yang amat peka serta kelebihan lainnya yang menyebabkan bergesernya L menjadi HPLC.

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kuantitatif dan penentuan kualitatif. Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah jenis kolom, komposisi eluen (jenis dan perbandingan), volume injeksi (volume sampel loop), kolom, detektor, dan chart speed (bila manual).

HPLC memberikan peranan yang besar dalam kehidupan, antara lain: banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida, zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair , asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori, dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air ; digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia lainnya.