62245996 bab iii pom revisi

Upload: cupi-marceila

Post on 12-Jul-2015

1.782 views

Category:

Documents


9 download

TRANSCRIPT

BAB III TINJAUAN KHUSUS BIDANG PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

3.1

Laboratorium Mikrobiologi Laboratorium mikrobiologi adalah tempat melakukan berbagai kegiatan

pengujian secara mikrobiologi. Status laboratorium Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan (BBPOM) di Bandung adalah terakreditasi oleh Komite Akreditasi Nasional Indonesia sebagai laboratorium sesuai SNI-19-17025-2000 nomor Akreditasi LP-173-IDN sejak 25 juli 2003 (sudah terakreditasi Maret 2007).

3.2

Tujuan, Fungsi dan Tugas Laboratorium Mikrobiologi a) Tujuan dari dilakukannya pengujian mikrobiologi yaitu : 1. Pengawasan mutu 2. Perlindungan terhadap konsumen b) Fungsi dari laboratorium mikrobiologi adalah sebagai pelaksanaan pemeriksaan laboratorium, pengujian dan penilaian mutu produk secara mikrobiologi. c) Tugas Bidang Pengujian Mikrobiologi Balai Besar POM di Bandung berdasarkan pada S.K. Kepala badan POM No.05018/2001 yaitu melaksanakan penyusunan rencana dan program serta evaluasi dan penyusunan rancangan pelaksanaan pemeriksaan pengujian dan penilaian mutu secara mikrobiologi. laboratorium,

3.3

Ruangan dan Sarana Laboratorium Kebutuhan ruang di bidang pengujian mikrobiologi BBPOM di Bandung

dapat dibedakan menjadi dua yaitu ruang staf yang terpisah dari laboratorium untuk mencegah mikroba dan ruang laboratorium yang dibagi menjadi : ruang penyiapan sampel, ruang media dan pereaksi, ruang persiapan dan sterilisasi, ruang timbang, ruang uji potensi, ruang cemaran bakteri, ruang cemaran jamur, ruang inokulasi, dan ruang uji sterilitas. Kegiatan yang dilakukan meliputi 16

17 pengujian secara mikrobiologi, antara lain mendeteksi cemaran, mengetahui kebenaran daya guna potensi antibiotik, uji sterilitas, dan lain-lain.

3.4

Cara Berlaboratorium yang Baik a. SDM Meliputi sumber daya manusia yang berpendidikan, berpengalaman serta kompeten (selalu mengikuti pelatihan berjenjang dan

berkelanjutan). b. Bangunan Meliputi gudang, ruang antara, ruang media, ruang cuci dan sterilisasi alat, ruang persiapan, ruang uji potensi, ruang uji cemaran, ruang uji steril, ruang inkubasi, ruang inokulasi. c. Peralatan Peralatan harus lengkap, sesuai ruang lingkup serta jumlah personil, ada penanggung jawab, ada dokumen, serta dikalibrasi karena berpengaruh terhadap hasil. Peralatan standar minimum yang ada di laboratorium mikrobiologi diantaranya: otoklaf, oven, inkubator, tangas air, Laminar Air Flow, timbangan, stomacher, blender, tube mixer, anaerobic jar, lemari es, colony counter, zone reader, spektrofotomer, pH meter, pompa vakum, mikroskop, sentrifuge, pipet Eppendrof, gunting, pisau, sendok, spatula, dan lain-lain. d. Media dan Pereaksi Penyimpanan media dan pereaksi harus disimpan dalam ruang khusus, terkondisi, terpantau serta ada penanggung jawab. e. Bahan baku pembanding f. Standar acuan pustaka Standar acuan yang biasa digunakan di Laboratorium Mikrobiologi antara lain : Farmakope Indonesia edisi IV Standar Nasional Indonesia Metode Analisa PPOMN 2006 Metode Analisa PPOMN 2002 Metode Analisa PPOMN 2001

18 Metode Analisa PPOMN 2000 Metode Analisa Suplemen 2000 Permenkes No. 661 tahun 1994 Surat Keputusan Kepala BPOM No.PR.02.21.1513

g. Penanganan sampel 1. Penerimaan Dilengkapi dokumen, dicatat dan didokumentasikan serta ada penanggung jawab. 2. Penyimpanan Ruang khusus, sesuai petunjuk penyimpanan, aman, ada

penanggung jawab. 3. Pengujian Dibuat SPK, dilengkapi SPP. 4. Pelaporan Semua data dicatat dan didokumentasikan, data yang salah tidak boleh dihapus, koreksi dilakukan dengan mencoret dan paraf, dievaluasi (berjenjang), dibuat kesimpulan. 5. Pengarsipan Arsip sampel, dan arsip laporan (data mentah disimpan oleh penguji, sedangkan CP, LCP dan LHU disimpan di bagian lain). h. Sistem K3 (Keamanan dan Keselamatan Kerja) Di laboratorium mikrobiologi diwajibkan untuk menggunakan jas laboratorium (pakaian kerja), menggunakan pengaman kerja seperti kacamata, masker, sarung tangan dan lain-lain. Tidak bekerja sendirian, dilarang makan, minum dan merokok di laboratorium, pelatihan penanganan kecelakaan kerja di laboratorium, serta tidak ceroboh (membahayakan diri maupun orang lain).

3.5

Metode Pengujian Mikrobiologi a. Perhitungan Metode perhitungan digunakan untuk mengetahui jumlah cemaran mikroba meliputi persiapan dan homogenisasi contoh, pengenceran, perhitungan koloni, pengambilan kesimpulan.

19 b. Isolasi Metode isolasi digunakan untuk mengetahui adanya cemaran bakteri atau kapang patogen. Meliputi persiapan dan homogenisasi contoh, isolasi, identifikasi dan konfirmasi, pengambilan kesimpulan.

3.6

Mikroorganisme 3.6.1 Kehidupan Mikroorganisme Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme yaitu: bakteri, protozoa, virus, alga dan cendawan. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan kehidupan kita, beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lain merugikan. Beberapa mikroorganisme menyebabkan penyakit tetapi ada pula yang bermanfaat dalam kegiatan manusia sehari-hari. Bahan makanan terdiri dari protein, karbohidrat, lemak, vitamin, dan mineral. Bahan makanan merupakan medium pertumbuhan yang baik bagi berbagai macam mikroorganisme. Mikroorganisme dapat membusukkan protein, memfermentasikan karbohidrat dan menjadikan lemak dan minyak berbau tengik. Pengendalian mikroorganisme dalam bahan makanan pada prinsipnya bertujuan untuk membuat bahan makanan menjadi tahan lama, atau dengan kata lain bertujuan untuk pengawetan bahan makanan. Pengendalian mikroorganisme berarti mencegah pertumbuhan dari mikroorganisme tersebut, yang dapat berarti membunuh atau menghambat pertumbuhan itu sendiri. Biasanya tindakan ini dilakukan dengan perlakuan fisik atau perlakuan kimia. Perlakuan fisik dapat dilakukan dengan cara perlakuan termal, perlakuan pengeringan dan perlakuan penyinaran (iradiasi). Perlakuan kimia dapat dilakukan dengan cara penggaraman, pengasaman, pengasapan dan pemberian bahan pengawet. 1. Morfologi dan Struktur Sel Bakteri a. Morfologi bakteri Mikroorganisme terdiri dari organisme eukariot yaitu organisme yang memiliki selaput membran inti dan organisme prokariot yaitu organisme yang tidak memiliki selaput membran inti. Ukuran bakteri umumnya berkisar antara 1,0 x 2,0 5,0 m.

20 b. Struktur Sel Bakteri Struktur bakteri dapat dibedakan menjadi struktur di luar dan di dalam dinding sel. Struktur utama di luar dinding sel yaitu flagella, fili, dan kapsul. Flagella berupa rambut sangat tipis yang mencuat dari dalam sitoplasma menembus dinding sel dan terdiri dari subunit protein yang disebut flagelin. Flagella berfungsi sebagai alat gerak pada bakteri.. c. Nutrisi dan Kultivasi Bakteri Untuk menunjang kehidupannya, makhluk hidup termasuk bakteri memerlukan nutrisi dan kondisi lingkungan yang sesuai. Begitu tersedia kondisi yang memuaskan untuk kultivasi, maka reproduksi dan pertumbuhan bakteri dapat diamati dan diukur. Persyaratan nutrisi yang diperlukan oleh bakteri dalam bentuk zatzat kimiawi terdiri dari : - Sumber energi Semua organisme terbagi menjadi fototrof dan kemotrof. Fototrof adalah organisme yang menggunakan cahaya sebagai sumber energinya, sedangkan kemotrof adalah organisme yang menggunakan senyawa kimia sebagai sumber energi. Bakteri ada yang termasuk fototrof dan kemotrof. - Karbon Sebagai sumber karbon dapat digunakan senyawa-senyawa karbohidrat seperti senyawa gula (glukosa, fruktosa, maltosa, sukrosa, xilosa, mannitol dan pati). Karbohidrat sebagai sumber karbon paling sederhana dapat digunakan sendiri atau

digabungkan dengan senyawa lain yang sesuai. - Sulfur dan fosfor Sumber sulfur bagi hewan adalah senyawa sulfur organik, sedangkan bagi tumbuhan adalah senyawa sulfur anorganik. Sumber fosfor biasanya berupa garam-garam fosfat. - Unsur logam Semua makhluk hidup termasuk bakteri memerlukan beberapa unsur logam sepeti natrium, kalium, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, dan kobalt untuk menunjang pertumbuhannya.

21 - Vitamin Vitamin bagi makhluk hidup berfungsi sebagai aktivator enzim. Semua bakteri membutuhkan vitamin untuk proses

metaboliknya. - Air Air pada bakteri berperan dalam proses metabolisme dan disimpan dalam bentuk cairan sitoplasma.

Selain memerlukan nutrien yang sesuai untuk kultivasi, bakteri juga memerlukan kondisi fisik yang sesuai agar pertumbuhannya optimum. Kebutuhan bakteri akan nutrisi dan kondisi

lingkungannya sangat bervariasi. Beberapa faktor lingkungan yang penting untuk menunjang kultivasi bakteri adalah : Suhu Semua proses pertumbuhan mikroorganisme bergantung pada reaksi kimiawi dan karena laju reaksi-reaksi ini dipengaruhi oleh suhu, maka pola pertumbuhan bakteri dapat dipengaruhi oleh suhu. Suhu juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan organisme. Keragaman suhu dapat juga mengubah proses metabolik tertentu morfologi sel. Spesies mikroba yang berbeda sangat beragam kisaran suhu optimalnya untuk tumbuh, dimana bentuk psychrophillic tumbuh terbaik pada suhu rendah (15-20C), bentuk

mesophilic tumbuh dengan baik pada suhu 30-37C dan kebanyakan bentuk thermophillic tumbuh dengan baik pada suhu 50-60C. Kebanyakan organisme adalah mesophillic dimana suhu 30C adalah suhu optimal untuk berbagai bentuk yang hidup bebas. Batas kisaran suhu yang dapat ditoleransi oleh setiap spesies berhubungan erat dengan stabilitas panas keseluruhan protein spesies yang diukur dalam ekstrak sel. Mikroorganisme bersama dengan tumbuhan dan hewan, menunjukkan respon terhadap panas (heat shock response) pada saat dipapar kenaikan suhu secara tiba-tiba di atas pertumbuhan optimal. Selain berpengaruh pada laju

22 pertumbuhan, suhu yang ekstrim juga dapat membunuh mikroorganisme. Bakteri juga menunjukkan fenomena yang disebut cold-shock yaitu pembunuhan sel-sel dengan

pendinginan cepat. Contohnya pendinginan cepat pada kultur Escherichia coli dari suhu 37C ke 5C, dapat membunuh 90% sel-selnya. Atmosfer gas Gas-gas utama yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah oksigen dan karbondioksida. Bakteri memiliki

keragaman yang luas dalam hal respon terhadap oksigen bebas, dan atas dasar ini maka bakteri dikelompokkan menjadi empat yaitu aerobik (hanya tumbuh bila ada oksigen bebas), anaerob (hanya tumbuh tanpa oksigen bebas), anaerob fakultatif (tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob), serta mikroaerofilik (pertumbuhan terbaik bila ada sedikit oksigen bebas). Keasaman atau kebasaan (pH) Kebanyakan organisme memiliki kisaran pH optimal yang sempit. Secara empiris pH optimal harus ditentukan untuk masing-masing spesies. Kebanyakan organisme neutralophiles tumbuh baik pada pH 6,0-8,0, beberapa bentuk acidophiles atau organisme yang dapat hidup dalam suasana asam memiliki pH optimal serendah 3,0 dan yang lainnya alkalophiles atau organisme yang dapat hidup dalam suasana basa memiliki pH optimal setinggi 10,5.

3.6.2 Identifikasi Mikroorganisme Keberhasilan identifikasi suatu mikroorganisme tergantung pada beberapa faktor yaitu biakan harus benar-benar murni, bekerja secara berurutan dari karakteristik umum dan yang khusus berdasarkan ciri-ciri organisme, menggunakan semua informasi yang tersedia untuk pendekatan hasil yang ingin tercapai, selalu menerapkan logika pada setiap tahap pengerjaan, menggunakan penomoran uji untuk memastikan identifikasi, dan isolat yang diuji dibandingkan dengan biakan perbandingan yang sudah distandarisasi.

23 Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam mengidentifikasi mikroorganisme : a. Morfologis Pengamatan spesimen dengan bantuan mikroskop, baik diwarnai dengan pewarnaan gram atau tidak, teknik mikroskop elektron memungkinkan pengambilan spesimen mikroba sampai ukuran ultramikron. b. Nutrisi Penentuan zat kimia yang diperlukan untuk menunjang pertumbuhan mikroorganisme. c. Pertumbuhan mikroorganisme Penentuan profil pertumbuhan mikroba pada berbagai macam medium baik yang cair maupun yang padat. d. Metabolisme Beberapa uji dilakukan untuk mengetahui apakah mikroba menyebabkan perubahan kimia suatu zat khusus atau tidak. Misalnya, mikroba dapat mengubah karbohidrat menjadi asam. e. Susunan kimia Berbagai teknik tersedia untuk memcahkan sel dan untuk mengisolasi komponen-komponen sel yang khusus dari campuran yang diperoleh, misalnya fragmen dinding sel, bahan nukleus, dan membran. f. Patogenitas Penentuan potensi suatu biakan mikroba untuk menimbulkan penyakit dilakukan dengan menginokulasi hewan atau tumbuhan dengan biakan murni mikroorganisme.

3.6.3 Mikroba yang diuji di laboratorium mikrobiologi Mikroba yang diuji di laboratorium mikrobiologi BBPOM mencakup kapang, khamir, dan bakteri. Untuk bakteri, dapat dibedakan menjadi bakteri indikator dan bakteri patogen. Bakteri indikator adalah bakteri flora normal yang terdapat di tubuh manusia tetapi jika berada di dalam produk uji merupakan indikasi kurangnya higienis saat proses produksi. Contohnya adalah Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

24 dan Enterococcus, sedangkan bakteri patogen adalah bakteri yang keberadaannya dalam produk uji tidak boleh ada karena pasti menyebabkan penyakit, misalnya Salmonella. a. Staphylococcus Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk bulat atau lonjong (0,8-0,9 m), dapat bergerak, tidak berspora dan tersusun dalam kelompok (seperti buah anggur). S.aureus bersifat aerob dan tumbuh baik pada perbenihan sederhana pada temperatur optimum 37C dan pH 7,4. S.aereus merupakan salah satu bakteri yang cukup kebal diantara organisme-organisme tak berspora dan beberapa strain mampu menghasilkan racun protein yang stabil terhadap panas. S.aereus tahan pemanasan pada suhu 60C selama 30 menit dan tahan terhadap fenol 1% selama 15 menit. S.aereus terdapat di udara, debu, kotoran, air, susu, makanan atau peralatan masak, hewan dan manusia. Manusia dan hewan merupakan reservoir utama. Bakteri ini dapat ditemukan di berbagai bagian tubuh manusia sehat seperti hidung, tenggorokan, rambut,dan kulit, karena itulah S.aereus mudah masuk ke dalam makanan. Pengidap (carrier) S.aereus pada nasal sebanyak 40-50% dari populasi. S.aereus juga ditemukan pada pakaian, sprei, dan benda lain di lingkungan manusia. b. Bacillus cereus Bacillus cereus adalah bakteri Gram positif, berbentuk batang besar, bersifat aerob fakultatif, menghasilkan enterotoksin, membenttuk spora yang tidak berkembang menjadi sporangium. c. Escherichia coli Escherichia coli adalah flora alami pada usus manusia atau binatang. Penentuan adanya E.coli pada air minum dipakai sebagai pencemaran tinja manusia atau hewan. Bakteri ini berukuran 2,4 m x 0,4-0,7 m, Gram negatif, bergerak aktif dan tidak berspora. Bersifat fakultatif anaerob dan tumbuh pada perbenihan biasa. Suhu optimum pertumbuhan adalah 37C. Bakteri ini dapat bertahan berbulan-bulan pada tanah dan dalam air, tetapi dapat dimatikan dengan pemanasan pada 60C selama 20 menit. Bakteri ini peka

25 terhadap streptomisin, tetrasiklin, kloramfenikol, dan asam

nalidiksat. E. coli dapat menyebabkan infeksi di dalam dan di luar saluran cerna, diantaranya infeksi saluran kemih, meningitis, peritonitis, dan pneumonia. d. Salmonella Salmonella merupakan bakteri patogen untuk manusia atau binatang. Salmonella tumbuh cepat dalam media yang sederhana, tetapi hampir tidak pernah memfermentasi laktosa atau sukrosa. Bakteri ini membentuk asam dan kadang gas dari glukosa dan manosa serta biasanya memproduksi H2S. Bakteri ini juga tahan hidup dalam air membeku pada periode yang lama. Salmonella tahan terhadap bahan kimia tertentu (misalnya briliant green, sodium tetrathionate, sodium desoxycholate) yang menghambat bakteri enterik lain; senyawa tersebut kemudian berguna untuk ditambahkan pada media untuk mengisolasikan Salmonella dari tinja. Salmonella typhi merupakan penyebab infeksi utama pada manusia, dan infeksi dari bakteri ini bersumber dari manusia. e. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang, merupakan bakteri Gram negatif berukuran 0,5-0,8 m sampai 1,5-3 m. Bergerak aktif dengan flagel di salah satu ujungnya. Bakteri ini tumbuh pada kondisi aerob. Dapat ditemukan di air, tanah, atau pada permukaan kontak dengan air dan tanah, pada tumbuhan dan juga hewan. f. Vibrio cholerae Bakteri ini bentuknya bengkok, seperti koma, berukuran 1,5m x 0,2-0,4 m. V.cholerae ini sangat aerob, tumbuh pada pH basa (7,59,6) dan suhu 22-40C (suhu optimum 37C). Tumbuh baik pada perbenihan biasa. Mati pada pemanasan 55C selama 15 menit. Mati oleh pengeringan, demikian juga akan mati segar oleh asam lambung. Peka terhadap streptomisin, kloramfenikol dan tetrasiklin. g. Clostridium perfringens Clostridium perfringens berbentuk batang besar yang dapat menghasilkan spora dan menghaslikan daerah hemolisis pada pelat agar darah. C. perfringens tidak bergerak, hidup pada kondisi

26 anaerob. Spora dapat dimatikan dengan otoklaf pada suhu 121C selama 18 menit. Spora tahan terhadap antiseptik dan desinfektan. h. Candida albicans Candida albicans adalah khamir berbentuk oval bertunas, berukuran 2-3m x 4-6m. Pada media PDA (Potato Dextrose Agar) yang diinkubasi pada suhu kamar, terbentuk koloni lunak berwarna krim yang berbau seperti ragi. i. Aspegillus niger Aspergillus niger merupakan salah satu jamur yang sering dijumpai dalam pengujian kapang atau khamir.

3.6.4 Jenis penyakit akibat kontaminasi mikroba Dilihat dari sumber penyakit yang masuk ke dalam tubuh dan dapat menimbulkan gejala sakit, maka gejala penyakit melalui makanan dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu : 1. Infeksi Istilah infeksi digunakan untuk menyatakan tertelannya atau masuknya suatu mikroorganisme patogen ke dalam tubuh, kemudian dapat menembus sistem pertahanan tubuh, hidup dan berkembang biak serta menimbulkan infeksi. Bakteri yang biasa menimbulkan infeksi diantaranya Salmonella sp., Shigella sp. 2. Intoksikasi (keracunan) Istilah intoksikasi digunakan untuk menyatakan tertelannya atau masuknya suatu toksin ke dalam tubuh. Misalnya racun botulin dan racun bongkrek pada tempe bongkrek.

Faktor-faktor yang menunjang terjadinya penyakit yang berasal dari makanan diantaranya yaitu makanan yang kurang matang, penyimpanan makanan pada suhu yang tidak sesuai, makanan yang diperoleh dari sumber yang tidak bersih, alat-alat yang tercemar, kesehatan perseorangan yang kurang baik, cara-cara pengawetan yang kurang sempurna. Proses memasak yang kurang dapat terjadi bila memasak unggas atau daging panggang berukuran besar, karena ukurannya dapat

27 menambah penggunaan masalah suhu penetrasi yang cukup panas tinggi yang dan cukup. cukup Tanpa lama,

mikroorganisme (termasuk parasit) tidak terbunuh dan racun yang tahan panas (seperti racun botulin) tidak dapat termusnahkan. Penyimpanan makanan pada suhu yang kurang sesuai, seperti suhu kamar yang hangat, memudahkan pertumbuhan mikroba.

Pertumbuhan mikroba dan pembentukan racun berkaitan dengan waktu dan suhu. Oleh karena itu, penyimpanan makanan untuk waktu lama paling baik dilakukan pada suhu beku. Makanan yang diperoleh dari sumber yang tidak aman berarti makanan tersebut sudah beracun sejak semula. Contoh makanan ini adalah spesies jamur dan kerang beracun. Pencemaran makanan oleh mikrorganisme lewat alat-alat dapat dikurangi bila pencucian alat-alat tersebut dilakukan dengan sanitasi yang baik. Beberapa jenis penyakit yang berasal dari makanan : 1. Salmonelasis Salmonelasis merupakan infeksi oleh bakteri Salmonella, yang menyerang saluran gastrointestinal yang mencakup perut, usus halus dan usus besar. Terjadinya sakit perut yang mendadak membedakannya dari penyakit perut lain seperti disentri basiler atau disentri amuba. Waktu munculnya gejala adalah enam sampai enam puluh delapan jam setelah makan yang tercemar Salmonella, ditandai oleh timbulnya rasa sakit perut mendadak. Terinfeksinya manusia oleh Salmonella hampir selalu

disebabkan oleh konsumsi makanan atau minuman yang tercemar. Makanan yang biasanya tercemar meliputi kue-kue yang mengandung susu, daging cincang, sosis, daging panggang, ikan, udang, swike, ragi, kelapa, gelatin kering, mentega kacang, coklat, saus, dan telur. 2. Intoksikasi Stapylococcal Keracunan makanan yang umum terjadi disebabkan oleh termakannya enterotoksin yang dihasilkan oleh Staphylococcus aureus yang mencemari makanan. Pada umumnya gejala-gejala mual, pusing, muntah, dan diare muncul dua sampai enam jam

28 setelah makan makanan yang tercemar. Makanan yang tercemar jika dibiarkan pada suhu kamar selama delapan sampai sepuluh jam, cukup untuk menghasilkan toksin dalam jumlah yang memadai untuk menyebabkan keracunan. Keracunan makanan oleh S. aureus terjadi jika menelan makanan yang tercemar enterotoksin dari S.aureus misalnya daging sapi, ikan, susu dan hasil olahannya, coklat leleh. 3. Infeksi Clostridial Infeksi ini dapat ditimbulkan oleh Clostridium perfringens yaitu infeksi jaringan seperti selulit, nekrosis otot, serta penyakit gangguan cerna seperti sakit perut dan diare. 4. Intoksikasi Bacillus cereus Keracunan makanan akibat Bacillus cereus ditandai dengan gejala mual, muntah dan diare.

3.6.5 Media Perbenihan untuk Mikroorganisme Perbenihan memberikan lingkungan yang diusahakan mirip dengan suasana alamiah yang dibutuhkan untuk pertumbuhan berbagai jenis mikroorganisme. Klasifikasi perbenihan berdasarkan : a. Bentuk Klasifikasi perbenihan berdasarkan bentuknya dibagi menjadi 2 yaitu perbenihan cair dan perbenihan padat. - Perbenihan cair Dipergunakan sebagai perbenihan pengkayaan sebelum disebarkan pada perbenihan padat. Tidak cocok dipergunakan sebagai perbenihan untuk menginokulasikan mikroorganisme untuk

memperoleh biakan murni, juga tidak dapat dipakai untuk mempelajari koloni bakteri. Jenis-jenis perbenihan cair : Kaldu Cairan jernih tembus cahaya dan berwarna kuning jerami, dibuat dari ekstrak daging atau pepton.

29 Pepton Merupakan protein yang terhodrolisis sebagian dengan

menggunakan enzim hidrolitik, misalnya pepsin, tripsin, papain dan lain-lain. Ekstrak ragi Dibuat dengan mengekstrasikan ragi yang diotolisiskan dengan air. Mempunyai kandungan vitamin B yang tinggi. - Perbenihan padat Dipergunakan untuk mempelajari koloni bakteri. Penting dalam menginokulasikan bakteri untuk mendapatkan biakan murni. Agar-agar Isi perbenihan padat yang penting dan merupakan senyawa polisakarida rumit, diperoleh dari rumput laut. Mencair pada suhu 80-100C dan membeku pada suhu 35-42C Gelatin Merupakan protein yang dibuat dengan hidrolisis kolagen menggunakan air mendidih. Mencair pada suhu 37C, membentuk gel yang tembus cahaya pada suhu 25C. Penggunaan utama gelatin ialah untuk menguji kemampuan bakteri dalam mencairkan gelatin tersebut. Jika perbenihan menghitam, artinya ada pembentukan hidrogen sulfida.

b. Tujuan Klasifikasi perbenihan berdasarkan tujuan terbagi menjadi perbenihan sederhana, perbenihan kompleks, perbenihan buatan dan perbenihan khusus. - Perbenihan sederhana Disebut juga perbenihan dasar, terdiri dari ekstrak daging, pepton, natrium klorida dan air. Air pepton : dibuat dengan penambahan 1 g pepton dan 0,5 g natrium klorida ke dalam 100 mL air suling. Agar gizi : kaldu gizi ditambah 2% agar-agar membentuk agar gizi.

30 - Perbenihan kompleks Mengandung zat-zat yang dipergunakan untuk keperluan khusus atau untuk menunjukkan adanya sifat-sifat khas bakteri atau mengandung zat-zat khusus untuk pembiakan bakteri tertentu. - Perbenihan buatan atau terarah Perbenihan ini dibuat hanya dari zat kimia murni dan susunan kandungan masing-masing zat tidak ditentukan, karena hanya digunakan untuk tujuan penelitian. - Perbenihan khusus, dibagi menjadi beberapa, yaitu : Perbenihan diperkaya Merupakan perbenihan dasar yang ditambahkan bahan-bahan tertentu seperti darah, serum atau telur. Contoh : agar darah Perbenihan persemaian Perbenihan yang ditambahkan beberapa zat dengan tujuan suatu organisme akan tumbuh lebih banyak dari pada organisme yang tidak diinginkan. Contoh : kaldu selenit F, kaldu tetrationat. Perbenihan selektif Perbenihan persemaian yang ditambahkan zat penghambat pada suatu perbenihan padat. Contoh : perbenihan desoksikolat sitrat. Perbenihan indikator Perbenihan mengandung indikator yang berubah warna jika ditumbuhi bakteri. Contoh : perbenihan Wilson Blair

(Salmonella typhi mereduksi bismuth sulfit menjadi sulfida dengan koloni spesifik berwarna hitam berkilap logam). Perbenihan diferensial Perbenihan ini dapat menumbuhkan beberapa jenis bakteri, tetapi mempunyai sifat mampu memunculkan perbedaan sifatsifat khas bakteri atau satu tipe bakteri akan tumbuh dengan khas. Contoh : Eosin Methylen Blue Agar, Cetrimide Agar, Entrobacter sakazakii Isolation Agar. Perbenihan gula-gula Perbenihan yang mengandung 1% gula tertentu di dalam air bersama-sama dengan indikator yang cocok. Di dalamnya

31 dimasukkan tabung Durham yang dibalik untuk mengetahui adanya pembentukan gas.

Berbagai jenis media perbenihan untuk pengujian : - Baird Parker Agar (BPA) Komposisi : agar, glisin, natrium piruvat, kasein yang didigesti enzim pankreas, litium klorida, yeast extract. pH : 7,0 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : dasar preparasi agar BP-EYT (Baird Parker EGG-Yolk Tellurite) untuk isolasi selektif dan enumerasi stafilokoki koagulasi positif dalam makanan, kulit, tanah, dan bahan lainnya. Media ini mengandung litium klorida dan tellurite yang dapat menghambat pertumbuhan flora lain, kemudian piruvat dan glisin secara selektif menstimulasi pertumbuhan Staphylococcus. Staphylococcus akan

membentuk koloni hitam dari reduksi tellurit menjadi tellurium, dengan dikelilingi zona bening akibat lipolisis dan proteolisis kuning telur. - Buffer Pepton Water (BPW) Komposisi : gelatin yang didigesti enzim pankreas, natrium klorida, dinatrium hidrogen fosfat, kalium hidrogen fosfat. pH : 7,2 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : media pra-pengkayaan untuk isolasi

Salmonella, khususnya mikroorganisme yang merusak pada berbagai produk pangan. - Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) Komposisi : empedu sapi terdehidrasi, laktosa, gelatin yang didigesti enzim pankreas, 4-metilumbelliferil--D-

glukuronida, pewarna brilliant green pH : 7,2 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : deteksi bakteri Coliform pada makanan, produk olahan susu, air, dan air buangan serta bahan tersanitasi

32 lainnya. Keberadaan E.coli dan Coliform lain diindikasikan dengan adanya fluorosensi pada tabung. - Brilliant Green Agar (BGA) Komposisi : agar, laktosa, sukrosa jaringan hewan yang didigesti pepsin, kasein yang didigesti enzim pankreas, natrium klorida, merah fenol, pewarna brilliant green pH : 6,9 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : isolasi selektif Salmonella selain S.typhi dari feses atau spesimen lain, serta pada produk pangan dan olahan susu. Salmonella, selain S.typhi, muncul sebagai koloni merah, merah muda, hingga putih dan dikelilingi zona merah pada agar yang mengindikasikan fermentasi non sukrosa atau laktosa. Proteus atau Pseudomonas dapat muncul sebagai koloni kecil berwarna merah. Bakteri yang memfermentasi laktosa atau sukrosa muncul sebagai koloni kuning hijau yang dikelilingi zona kuning hijau pada agar. - Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) Komposisi : agar, kasein yang didigesti enzim pankreas, laktosa, sukrosa, kalium hidrogen fosfat, eosin Y, metilen biru. pH : 7,2 0,2 pada 25C Kegunaan : isolasi, kultivasi, dan diferensiasi bakteri enterik Gram negatif berdasarkan fermentasi laktosa. Bakteri yang memfermentasi laktosa, khususnya E.coli, muncul sebagai koloni hijau metalik, hitam kebiruan, atau coklat. Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa muncul sebagai koloni ungu muda yang transparan. - Fluid Thioglycolate Medium (FTM) Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, glukosa, yeast extract, natrium klorida, agar, L-sistin, natrium tioglikolat, resazurin. pH : 7,1 0,2 pada suhu 25C

33 Kegunaaan : kultivasi mikroorganisme anaerob,

mikroaerofilik, dan aerob. Digunakan juga dalam uji sterilitas alat dan produk kesehatan Mekanisme kerja : agen pereduksi tioglikolat dan sistem menjamin anaerobiosis yang cukup bahkan untuk bakteri anaerob yang selektif sekalipun. Gugus sulfhidril pada senyawa ini juga menginaktivasi arsenik, merkuri dan komponen logam berat lain. - Letheen Broth (LB) Komposisi : pepton dari daging, pepton dari kasein, ekstrak daging, ekstrak ragi, natrium bisulfit, natrium klorida, lesitin. pH : 7,2 0,2 pada suhu 25C Warna media : keruh, kuning kecoklatan Mekanisme kerja : media kaya nutrisi yang juga berfungsi untuk menetralisasi kandungan gugus amonium kuartener dari bahan pengawet yang ada di dalam sampel uji. - MacConkey Broth (MCB) Komposisi : gelatin yang didigesti enzim pankreas, laktosa, empedu sapi, bromkresol ungu. pH : 7,3 0,2 pada 25C Kegunaan : kultivasi dan isolasi selektif bakteri Coliform dalam susu dan air. Mekanisme kerja : larutan ini mengandung laktosa, yang ketika terdegradasi menghasilkan asam dan gas. Gas yang terbentuk ditampung oleh tabung Durham dan asam yang dihasilkan dideteksi oleh indikator bromkresol ungu yang berubah menjadi kuning. Empedu sapi meningkatkan pertumbuhan dari beberapa spesies bakteri saluran cerna dan menghambat mikroorganisme lainnya yang tidak hidup di saluran cerna.

34 - Muller-Kauffmann Tetrathionate Novobiocin (MKTTn) Komposisi : ekstrak daging, enzim pencerna kasein, natrium klorida, kalsium karbonat, natrium tiosulfat anhidrat, oxbile, briliant green pH : 8.2 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : media diferensiasi untuk proses pengkayaan terutama untuk bakteri Salmonella. - Nutrien Agar (NA) Komposisi : agar pepton, natrium klorida, yeast extract, beef extract pH : 7,4 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : media pertumbuhan yang universal untuk

menumbuhkan sedikit mikroorganisme tertentu. - Plate Count Agar (PCA)/Tryptone Glucose Yeast Extract Agar (TGEA) Komposisi : agar, kasein yang didigesti enzim pankreas, yeast extract, glukosa pH : 7,2 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : enumerasi bakteri viabel dalam susu dan produk olahannya, estimasi jumlah bakteri heterotrofik hidup dalam air serta kultivasi dan pemeliharaan Brevibacterium casei, B.epedermidis, dan Methylobacterium mesophilicum. Media TGEA digunakan untuk melihat bakteri yang dapat membentuk spora seperti Bacillus subtilis. - Potato Dextrose Agar (PDA) Komposisi : glukosa, agar, infusi kentang, larutan asam tartrat pH : 5,6 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : kultivasi dan enumerasi kapang dan khamir Mekanisme kerja : infus karbohidrat dari kentang

menginisiasi pertumbuhan kapang dan khamir. Nilai pH yang rendah secara tidak langsung dapat menghambat pertumbuhan bakteri, namun jika penumbuhan ditujukan

35 untuk penghitungan (fungal count) maka pH harus dibuat hingga 3,5. Fungsi penumbuhan dalam media ini adalah untuk mengembangkan typical morphology. - Rappaport Vassiladis Soja (RVS) Komposisi : pepton dari soymeal, magnesium klorida heksahidrat, natrium klorida, dikalium hidrogen fosfat, malchite green Kegunaan : media pengkayaan untuk Salmonella Mekanisme kerja : pepton dari soymeal, malachite green, dan magnesium klorida mendukung pertumbuhan

Salmonella pada suhu 42C. - Selenite Cystine Broth (SCB) Komposisi : pepton dari kasein, sistin, laktosa, dapar fosfat, dan natrium hidrogen selenit. pH : 7,0 pada suhu 25C Kegunaan : sebagai media pengkayaan Salmonella. Selenit akan menghambat pertumbuhan bakteri Coliform dan Enterococcus pada 6-12 jam pertama inkubasi secara bertahap. Sedangkan pada Salmonella, Proteus, dan Pseudomonas, selenit hanya akan sedikit menghambat pertumbuhan. - Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBSA) Komposisi : sukrosa, agar, natrium klorida, natrium sitrat, natrium bisulfit, yeast extract, kasein yang didigesti enzim pankreas, jaringan hewan yang didigesti pepsin, empedu sapi, natrium kolat, ferri sitrat, timol biru, brom timol biru. pH : 8,6 0,2 pada 25C Kegunaan : isolasi selektif Vibrio cholera dan

V. parahaemolyticus dari berbagai spesimen klinik dan nonklinik. Mekanisme kerja : konsentrasi tiosulfat dan sitrat yang tinggi serta basa kuat dalam medium ini secara luas menghambat pertumbuhan Enterobacteriaceae. Empedu

36 sapi dan kolat terutama menekan Enterococci. Bakteri Coliform lain yang memungkinkan tumbuh tidak dapat memetabolisme sukrosa. Hanya beberapa galur Proteus yang positif sukrosa dapat tumbuh dan membentuk koloni berwarna kuning seperti koloni Vibrio. TCBSA

mengandung indikator campuran timol biru dan brom timol biru akan berubah warna menjadi kuning saat asam terbentuk meskipun medium ini bersifat basa kuat. - Tryptone Soy Broth (TSB) Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, natrium klorida, kedelai yang didigesti enzim pankreas, kalium hidrogen fosfat, glukosa. pH : 7,3 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : kultivasi berbagai jenis mikroorganisme

- Tryptone Water/Tryptone Broth (TW/TB) Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, natrium klorida pH : 7,5 0,2 pada suhu 25C Kegunaan : merupakan media untuk kultivasi produksi indol oleh berbagai jenis mikroorganisme

3.7

METODE PENGUJIAN 3.7.1 Sumber Metode Pengujian Balai Pengawas Obat dan Makanan memiliki kelompok pengujian untuk menguji setiap obat dan makanan yang beredar, salah satunya adalah pengujian mikrobiologi. Pengujian mikrobiologi penting

dilakukan untuk mengetahui mutu dan kehigienisan suatu produk. Dalam setiap pengujian makanan, alat kesehatan, kosmetik, obat tradisional, antibiotik, atau komplemen dilakukan berdasarkan suatu prosedur operasional baku pengujian mikrobiologi yang disusun berdasarkan ketentuan yang ada di dalam : 1. Farmakope Indonesia IV 2. United State Pharmacopoeia (USP)

37 3. British Pharmacopoeia 4. Manual of Food Quality Control 5. Standar Nasional Indonesia (SNI) 6. Pustaka lain yang menunjang prosedur pengujian beserta daftar kebutuhan alat dan media yang diperlukan.

Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan (PPOM) telah menyusun Buku Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi sebagai pedoman umum untuk pengujian perbekalan farmasi dan makanan oleh Balai Pengawas Obat dan Makanan di seluruh Indonesia.

3.7.2

Ketentuan Umum Secara garis besar metode pengujian mikrobiologi dapat

digolongkan ke dalam dua kelompok, yaitu pengujian kuantitatif dan kualitatif. Pengujian kuantitatif dilakukan untuk mengetahui cemaran mikroba, sedangkan pengujian kualitatif dilakukan untuk

mengidentifikasi adanya cemaran bakteri atau kapang patogen. Tahapan pengujian kuantitatif terdiri dari persiapan dan

homogenisasi contoh sampel, pengenceran, perhitungan koloni, dan pengambilan kesimpulan sedangkan tahapan dari pengujian kualitatif meliputi persiapan dan homogenisasi sampel, pengenceran, isolasi, identifikasi, konfirmasi, dan pengambilan keputusan. Tahapan persiapan dan homogenisasi contoh dilakukan sesuai dengan bentuk sediaan dan kemasan dari sampel produk. Dalam tahap ini perlu diperhatikan apakah sampel yang diuji mengandung bahan penghambat pertumbuhan mikroba atau tidak. Pada tahap persiapan, produk yang mengandung bahan pengawet perlu ditambahkan zat penetral untuk menginaktivasi pengawet. Zat penetral yang biasa digunakan adalah larutan 0,5% soy lecithin dan 4% polisorbat 20. Selain tahapan-tahapan analisis, pengujian mikrobiologi juga sangat dipengaruhi oleh ketelitian kerja pada penyiapan alat dan media. Pengawasan pada pekerjaan ini perlu dilakukan secara terpadu dan teratur.

38 3.7.3 Persiapan dan Homogenisasi Sampel Makanan, Obat

Tradisional, kosmetik Homogenisasi sampel adalah cara persiapan sampel (makanan, kosmetik, dan obat tradisional) untuk memperoleh distribusi bakteri secara merata di dalam sampel uji. Prinsip dari homogenisasi sampel adalah membebaskan sel-sel bakteri yang masih terlindungi oleh partikel sampel dan untuk mengaktifkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan selama proses pembuatan sampel. Adapun alat-alat yang digunakan adalah : alat cincang yang sesuai, alat homogenisasi (stomacher atau blender), wadah pencampur (blender jar) dari gelas atau logam yang tahan suhu otoklaf, timbangan dengan kapasitas 2000 g dan tingkat kepekaan 0,1 g, pisau, garpu, sendok, gunting, spatula, pembuka kaleng, gelas piala, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, dan botol pengencer steril, dan lain-lain. Larutan pengencer yang sering digunakan adalah : Sampel makanan dan minuman Alkaline Peptone Water (APW), Buffered Peptone Water (BPW), Peptone Dilution Fluid (PDF) Sampel kosmetik Modified Letheen Broth (MLB) Sampel obat tradisional Letheen Broth (LB), Peptone Dilution Fluid (PDF)

Disiapkan peralatan untuk penyiapan sampel yang sudah steril atau dapat disterilkan menggunakan api bunsen setelah terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70% sesaat sebelum pengujian berlangsung. a. Wadah terbuat dari kertas atau plastik Pada bagian wadah yang akan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dibuka secara aseptik

39 b. Wadah botol kaca Sumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen c. Wadah kaleng Permukaan kaleng dicuci dan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen

Prosedur dalam melakukan homogenisasi sampel : A. Homogenisasi sampel makanan 1. Makanan bentuk cairan Sampel dikocok sebanyak 25 kali, dengan cara aseptik dipipet 25 mL cuplikan sampel ke dalam wadah steril yang sesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) 2. Makanan bentuk serbuk Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong stomacher atau labu Erlenmeyer atau wadah steril lain yang sesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1). 3. Makanan bentuk kental Dengan cara aseptik dipipet 25 mL atau ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong stomacher atau labu Erlenmeyer atau wadah steril lain yang sesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) 4. Makanan bentuk padat Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam blender jar atau kantong stomacher, ditambahkan 225 mL larutan pengencer, kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1)

40 Catatan : - Untuk sampel keju, cuplikan dihomogenkan dalam blender yang dihangatkan dalam larutan pengencer yang dihangatkan. - Untuk sampel mentega atau margarin, sampel dipanaskan dalam tangas air suhu 40C selama tidak lebih dari 15 menit hingga bisa dipipet. Cuplikan dipipet 25 mL secara aseptik dengan pipet yang dihangatkan ke dalam wadah yang berisi 225 mL larutan pengencer hangat dan kemudian dikocok homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) 5. Makanan beku Sampel yang masih beku harus dipecah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil dengan menggunakan peralatan tumpul. Bila sampel bentuk balok besar, misal ikan atau daging, cuplikan dapat diambil dengan bantuan gergaji, pisau atau bor. Cara lainnya adalah sampel beku dapat disimpan terlebih dahulu pada suhu lemari es selama tidak lebih dari 12 jam untuk memudahkan pengambilan cuplikan. Untuk sampel yang tidak terlalu beku seperti es krim, dapat dibiarkan terlebih dahulu pada suhu ruangan selama tidak lebih dari 15 menit. Setelah cukup leleh, sampel dalam kemasan diaduk homogen dengan hati-hati, kemudian secara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai atau blender, selanjutnya dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1 ) 6. Makanan yang dikalengkan Keadaan wadah diamati. Bila keadaannya normal, dilakukan prainkubasi sebagai berikut : - Produk berkeasaman rendah pada suhu 30-35C selama 10 hari - Produk bersifat asam pada suhu 25-30C selama 10 hari - Produk berkeasaman tinggi (dipersiapkan untuk penyimpanan di atas 40C) pada suhu 55C selama 5-7 hari Setelah masa inkubasi, kondisi wadah diamati kembali. Dilihat adanya kebocoran pinhole dan kerusakan kaleng. Terhadap kaleng yang utuh dilanjutkan pengujian. Setelah wadah dibuka, diambil sejumlah 25 g cuplikan dan dimasukkan ke dalam wadah blender.

41 Ditambahkan 225 mL larutan pengencer sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1)

B. Homogenisasi sampel obat tradisional 1. Sediaan bentuk serbuk Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah steril, ditambahkan 90 mL PDF. Jika jumlah sampel kurang dari 10 g, maka pengambilan cuplikan dan pengencer disesuaikan hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10 dan dikocok homogen. 2. Sediaan bentuk rajangan Dengan cara aseptik sejumlah sampel bentuk rajangan dipotongpotong menggunakan pisau (gunting steril) menjadi bagian-bagian yang lebih kecil. Sebagian ditumbuk dalam cawan mortar supaya menjadi partikel yang lebih kecil. Dari sampel yang telah dipotongpotong, dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan dimasukkan ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL PDF, dikocok homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10. 3. Sediaan bentuk kapsul Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan, ke dalam wadah steril yang sesuai ditambahkan 90 mL LB dihomogenkan sampai seluruh kapsul hancur sehingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10. 4. Sediaan bentuk tablet dan pil Dengan cara aseptik ditimbang 10 cuplikan, ke dalam wadah steril yang sesuai ditambahkan 90 mL LB, cuplikan dibiarkan terendam sampai lunak kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10. Bila cuplikan sukar hancur lebih dahulu digerus secara aseptik di dalam mortar. 5. Sediaan bentuk cairan Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan, ke dalam wadah steril yang sesuai ditambahkan 90 mL LB kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10.

42 6. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai ditambahkan 1-2 mL Tween 80 dan diaduk. Selanjutnya ditambahkan Letheen Broth diaduk homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10

C. Homogenisasi sampel kosmetik 1. Sediaan bentuk cair Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL MLB. Jika jumlah sampel kurang dari 10 mL, maka volume cuplikan dan pengencer disesuaikan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan dikocok homogen. 2. Sediaan bentuk padat dan serbuk Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai. Jika diperlukan cuplikan padat dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang, mortar dan alu steril. Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 10 mL Tween 80 steril, diaduk homogen hingga terbentuk pasta. Selanjutnya ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan dikocok homogen. 3. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai ditambahkan Tween 80 sambil diaduk, selanjutnya ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan dikocok homogen. 4. Sediaan serbuk, sabun, cairan bentuk aerosol Bagian mulut penyemprot dibersihkan dengan kapas beralkohol 70%, kemudian disemprotkan sejumlah cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai. Setelah ditimbang ditambahkan MLB disesuaikan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1.

43 5. Sediaan yang mengandung lemak atau lilin (lipstick) Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai. Jika diperlukan cuplikan padat dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang, mortar dan alu steril. Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 2 mL parafin cair steril secara perlahan-lahan kemudian ditambahkan 10 mL Tween 20, diaduk homogen hingga terbentuk pasta. Selanjutnya ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan diaduk homogen.

3.7.4

Metode Pengujian Produk A. Uji Angka Lempeng Total Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk menetapkan angka bakteri aerob Prinsip Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil yang masih memiliki daya hidup, setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pereaksi khusus 1. Media padat Plate Count Agar (1 Liter PCA+ 1 mL TTC 5%) 2. Pengencer Pepton Dilution Fluid (PDF) untuk sampel makanan, minuman dan obat tradisional, Letheen Broth (LB) untuk sampel kosmetik dan obat tradisional yang mengandung pengawet. 3. Pereaksi Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) Peralatan khusus Lemari aseptik tipe vertikal, stomacher atau blender, pipet ukur mulut lebar, alat hitung koloni, inkubator 35-37C mesofil dalam sampel makanan, minuman,

kosmetik, dan obat tradisional.

44 Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dilakukan dengan cara prosedur homogenisasi sampel sesuai jenis sampel sehingga diperoleh suspensi sampel dengan konsentrasi 10-1 dalam pengencer yang sesuai. 2. Pengenceran Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 1 mL ke dalam tabung berisi 9 mL pengencer pertama dikocok homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 10-2. Pengenceran dilanjutkan dengan cara yang sama hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran sesuai dengan yang diperlukan (dua digit di bawah syarat SNI) 3. Inokulasi dan Inkubasi Dari tiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan petri steril masing-masing dibuat duplo. Ke dalam tiap cawan petri yang telah dimasukkan sampel,

dituangkan 15-20 mL media PCA cair suhu 45C yang telah ditambahkan pereaksi TTC, segera cawan digoyang dan diputar sedemikian rupa sehingga suspensi tercampur merata dalam media kemudian dibiarkan memadat. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengenceran dibuat uji kontrol (blanko). Pada satu cawan diisi 1 mL pengencer tanpa sampel dan media agar, pada cawan yang lain diisi media. Setelah agar memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35-37C selama 24-48 jam dengan posisi dibalik. 4. Pengamatan Setiap 24 jam koloni yang tumbuh dalam cawan petri diamati dan dihitung Interpretasi hasil 1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250. Jumlah

45 koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil

dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau mL sampel. 2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25 atau lebih dari 250 koloni, dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau mL sampel. 3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat

pengenceran yang berurutan menunjukan jumlah koloni antara 25-250, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali jumlah rata-rata pengenceran di bawahnya, maka Angka Lempeng Total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (misal pada pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140 x 102). Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah rata-rata pada pengenceran dibawahnya maka Angka Lempeng Total dihitung dari rata-rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut (misal pada 10-2 jumlah koloni rata-rata 240, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 410, maka Angka Lempeng Total adalah : 240 + 410 2X 102

= 325 X 102

46 4. Bila tidak satupun koloni dalam cawan maka Angka Lempeng Total dinyatakan sebagai kurang dari satu (