bab iii pom revisi

Upload: niko-tanzillafitsi

Post on 07-Jul-2015

4.797 views

Category:

Documents


8 download

TRANSCRIPT

16

BAB III TIN1AUAN KHUSUS BIDANG PENGU1IAN MIKROBIOLOGI 3.1Laboratorium Mikrobiologi Laboratoriummikrobiologiadalahtempatmelakukanberbagaikegiatan penguiiansecaramikrobiologi.StatuslaboratoriumBalaiBesarPengawasObat danMakanan(BBPOM)diBandung adalah terakreditasiolehKomiteAkreditasi NasionalIndonesiasebagailaboratoriumsesuaiSNI-19-17025-2000nomor Akreditasi LP-173-IDN seiak 25 iuli 2003 (sudah terakreditasi Maret 2007). 3.2Tujuan. Fungsi dan Tugas Laboratorium Mikrobiologi a) %uiuan dari dilakukannya penguiian mikrobiologi yaitu : 1. Pengawasan mutu 2. Perlindungan terhadap konsumen b)Fungsidarilaboratoriummikrobiologiadalahsebagaipelaksanaan pemeriksaan laboratorium, penguiian dan penilaianmutu produk secara mikrobiologi. c) %ugasBidangPenguiianMikrobiologiBalaiBesarPOMdiBandung berdasarkanpadaS.K.KepalabadanPOMNo.05018/2001yaitu melaksanakanpenyusunanrencanadanprogramsertaevaluasidan penyusunanrancanganpelaksanaanpemeriksaanlaboratorium, penguiian dan penilaian mutu secara mikrobiologi. 3.3Ruangan dan Sarana Laboratorium KebutuhanruangdibidangpenguiianmikrobiologiBBPOMdiBandung dapatdibedakanmeniadiduayaituruangstaIyangterpisahdarilaboratorium untukmencegahmikrobadanruanglaboratoriumyangdibagimeniadi:ruang penyiapansampel,ruangmediadanpereaksi,ruangpersiapandansterilisasi, ruangtimbang,ruanguiipotensi,ruangcemaranbakteri,ruangcemaraniamur, ruanginokulasi,danruanguiisterilitas.Kegiatanyangdilakukanmeliputi 17

penguiiansecaramikrobiologi,antaralainmendeteksicemaran,mengetahui kebenaran daya guna potensi antibiotik, uii sterilitas, dan lain-lain. 3.4Cara Berlaboratorium yang Baik a. SDM Meliputisumberdayamanusiayangberpendidikan,berpengalaman sertakompeten(selalumengikutipelatihanberieniangdan berkelaniutan). b. Bangunan Meliputigudang, ruang antara, ruangmedia, ruangcucidan sterilisasi alat,ruangpersiapan,ruanguiipotensi,ruanguiicemaran,ruanguii steril, ruang inkubasi, ruang inokulasi. c. Peralatan Peralatanharuslengkap,sesuairuanglingkupsertaiumlahpersonil, adapenanggungiawab,adadokumen,sertadikalibrasikarena berpengaruh terhadap hasil. Peralatanstandarminimumyangadadilaboratoriummikrobiologi diantaranya:otoklaI,oven,inkubator,tangasair,LaminarAirFlow, timbangan,stomacher,blender,tubemixer.anaerobiciar,lemaries, colonvcounter,zonereader,spektroIotomer,pHmeter,pompavakum,mikroskop,sentrifuge,pipetEppendroI,gunting,pisau, sendok, spatula, dan lain-lain. d. Media dan Pereaksi Penyimpananmedia dan pereaksiharus disimpan dalam ruang khusus, terkondisi, terpantau serta ada penanggung iawab. e. Bahan baku pembanding I. Standar acuan pustaka StandaracuanyangbiasadigunakandiLaboratoriumMikrobiologi antara lain : Farmakope Indonesia edisi IV Standar Nasional Indonesia Metode Analisa PPOMN 2006 Metode Analisa PPOMN 2002 Metode Analisa PPOMN 2001 18

Metode Analisa PPOMN 2000 Metode Analisa Suplemen 2000 Permenkes No. 661 tahun 1994 Surat Keputusan Kepala BPOM No.PR.02.21.1513 g. Penanganan sampel 1. Penerimaan Dilengkapidokumen,dicatatdandidokumentasikansertaada penanggung iawab. 2. Penyimpanan Ruangkhusus,sesuaipetuniukpenyimpanan,aman,ada penanggung iawab. 3. Penguiian Dibuat SPK, dilengkapi SPP. 4. Pelaporan Semuadatadicatatdandidokumentasikan,datayangsalahtidak bolehdihapus,koreksidilakukandenganmencoretdanparaI, dievaluasi (berieniang), dibuat kesimpulan. 5. Pengarsipan Arsipsampel,danarsiplaporan(datamentahdisimpanoleh penguii, sedangkan CP, LCP dan LHU disimpan di bagian lain). h. Sistem K3 (Keamanan dan Keselamatan Keria) Dilaboratoriummikrobiologidiwaiibkanuntukmenggunakanias laboratorium(pakaiankeria),menggunakanpengamankeriaseperti kacamata,masker,sarungtangandanlain-lain.%idakbekeria sendirian,dilarangmakan,minumdanmerokokdilaboratorium, pelatihanpenanganankecelakaankeriadilaboratorium,sertatidak ceroboh (membahayakan diri maupun orang lain). 3.5Metode Pengujian Mikrobiologi a. Perhitungan Metodeperhitungandigunakanuntukmengetahuiiumlahcemaran mikrobameliputipersiapandanhomogenisasicontoh,pengenceran, perhitungan koloni, pengambilan kesimpulan. 19

b. Isolasi Metodeisolasidigunakanuntukmengetahuiadanyacemaranbakteriataukapangpatogen.Meliputipersiapandanhomogenisasicontoh, isolasi, identiIikasi dan konIirmasi, pengambilan kesimpulan. 3.6Mikroorganisme 3.6.1 Kehidupan Mikroorganisme Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme yaitu: bakteri, protozoa, virus, alga dan cendawan. Mikroorganismesangat erat kaitannyadengankehidupankita,beberapadiantaranyabermanIaatdan yanglainmerugikan.Beberapamikroorganismemenyebabkanpenyakit tetapi ada pula yang bermanIaat dalam kegiatan manusia sehari-hari. Bahanmakananterdiridariprotein,karbohidrat,lemak,vitamin, danmineral.Bahanmakananmerupakanmediumpertumbuhanyang baikbagiberbagaimacammikroorganisme.Mikroorganismedapat membusukkanprotein,memIermentasikankarbohidratdanmeniadikan lemakdanminyakberbautengik.Pengendalianmikroorganismedalam bahanmakananpadaprinsipnyabertuiuanuntukmembuatbahan makananmeniaditahanlama,ataudengankatalainbertuiuanuntuk pengawetanbahanmakanan.Pengendalianmikroorganismeberarti mencegah pertumbuhan dari mikroorganisme tersebut, yang dapat berarti membunuh atau menghambat pertumbuhan itu sendiri. Biasanya tindakan inidilakukandenganperlakuanIisikatauperlakuankimia.Perlakuan Iisikdapatdilakukandengancaraperlakuantermal,perlakuan pengeringandanperlakuanpenyinaran(iradiasi).Perlakuankimiadapat dilakukandengancarapenggaraman,pengasaman,pengasapandan pemberian bahan pengawet. 1.MorIologi dan Struktur Sel Bakteri a. MorIologi bakteri Mikroorganismeterdiridariorganismeeukariotyaituorganisme yang memiliki selaput membran inti dan organisme prokariot yaitu organismeyangtidakmemilikiselaputmembraninti.Ukuran bakteri umumnya berkisar antara 1,0 x 2,05,0 m. 20

b. Struktur Sel Bakteri Strukturbakteridapatdibedakanmeniadistrukturdiluardandi dalam dinding sel. Struktur utama di luar dinding sel yaitu Ilagella, Iili,dankapsul.Flagellaberuparambutsangattipisyangmencuat daridalamsitoplasmamenembusdindingseldanterdiridari subunitproteinyangdisebutIlagelin.FlagellaberIungsisebagai alat gerak pada bakteri. c. Nutrisi dan Kultivasi Bakteri Untukmenuniangkehidupannya,makhlukhiduptermasukbakteri memerlukannutrisidankondisilingkunganyangsesuai.Begitu tersedia kondisi yang memuaskan untuk kultivasi, maka reproduksi dan pertumbuhan bakteri dapat diamati dan diukur. Persyaratannutrisiyangdiperlukanolehbakteridalambentukzat-zat kimiawi terdiri dari : - Sumber energi SemuaorganismeterbagimeniadiIototroIdankemotroI. FototroIadalahorganismeyangmenggunakancahayasebagai sumberenerginya,sedangkankemotroIadalahorganismeyang menggunakansenyawakimiasebagaisumberenergi.Bakteri ada yang termasuk IototroI dan kemotroI. - Karbon Sebagaisumberkarbondapatdigunakansenyawa-senyawa karbohidratsepertisenyawagula(glukosa,Iruktosa,maltosa, sukrosa, xilosa,mannitoldanpati). Karbohidrat sebagaisumber karbonpalingsederhanadapatdigunakansendiriatau digabungkan dengan senyawa lain yang sesuai.- SulIur dan IosIor SumbersulIurbagihewanadalahsenyawasulIurorganik, sedangkanbagitumbuhanadalahsenyawasulIuranorganik. Sumber IosIor biasanya berupa garam-garam IosIat. - Unsur logam Semuamakhlukhiduptermasukbakterimemerlukanbeberapa unsurlogamsepetinatrium,kalium,magnesium,mangan,besi, seng, tembaga, dan kobalt untuk menuniang pertumbuhannya.21

- Vitamin Vitamin bagimakhlukhidup berIungsi sebagai aktivator enzim. Semuabakterimembutuhkanvitaminuntukproses metaboliknya.- Air Airpadabakteriberperandalamprosesmetabolismedan disimpan dalam bentuk cairan sitoplasma. Selainmemerlukannutrienyangsesuaiuntukkultivasi,bakteri iugamemerlukankondisiIisikyangsesuaiagarpertumbuhannya optimum.Kebutuhanbakteriakannutrisidankondisi lingkungannya sangat bervariasi. Beberapa Iaktor lingkungan yang penting untuk menuniang kultivasi bakteri adalah : Suhu Semuaprosespertumbuhanmikroorganismebergantungpada reaksikimiawidankarenalaiureaksi-reaksiinidipengaruhi olehsuhu,makapolapertumbuhanbakteridapatdipengaruhi olehsuhu.Suhuiugamempengaruhilaiupertumbuhandan iumlahtotalpertumbuhanorganisme.Keragamansuhudapat iugamengubahprosesmetaboliktertentumorIologisel. Spesiesmikrobayangberbedasangatberagamkisaransuhu optimalnyauntuktumbuh,dimanabentukpsvchrophillic tumbuhterbaikpadasuhurendah(15-20C),bentuk mesophilictumbuhdenganbaikpadasuhu30-37Cdan kebanyakanbentukthermophillictumbuhdenganbaikpada suhu50-60C.Kebanyakanorganismeadalahmesophillic dimana suhu30Cadalah suhuoptimal untukberbagaibentuk yanghidupbebas.Bataskisaransuhuyangdapatditoleransi olehsetiapspesiesberhubunganeratdenganstabilitaspanas keseluruhanproteinspesiesyangdiukurdalamekstraksel. Mikroorganismebersamadengantumbuhandanhewan, menuniukkanresponterhadappanas(heatshockresponse)padasaatdipaparkenaikansuhusecaratiba-tibadiatas pertumbuhanoptimal.Selainberpengaruhpadalaiu 22

pertumbuhan,suhuyangekstrimiugadapatmembunuh mikroorganisme.BakteriiugamenuniukkanIenomenayang disebutcold-shockyaitupembunuhansel-seldengan pendinginancepat.Contohnyapendinginancepatpadakultur Escherichia coli dari suhu 37C ke 5C, dapat membunuh 90 sel-selnya. AtmosIer gas Gas-gasutamayangmempengaruhipertumbuhanbakteri adalahoksigendankarbondioksida.Bakterimemiliki keragaman yang luas dalam hal respon terhadap oksigen bebas, dan atas dasar inimaka bakteri dikelompokkanmeniadi empat yaitu aerobik (hanya tumbuh bila ada oksigen bebas), anaerob (hanyatumbuhtanpaoksigenbebas),anaerobfakultatif (tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob), serta mikroaerofilik (pertumbuhan terbaik bila ada sedikit oksigen bebas). Keasaman atau kebasaan (pH) KebanyakanorganismememilikikisaranpHoptimalyang sempit.SecaraempirispHoptimalharusditentukanuntuk masing-masingspesies.Kebanyakanorganismeneutralophiles tumbuhbaikpadapH6,0-8,0,beberapabentukacidophiles atauorganismeyangdapathidupdalamsuasanaasam memilikipHoptimalserendah3,0danyanglainnya alkalophilesatauorganismeyangdapathidupdalamsuasana basa memiliki pH optimal setinggi 10,5. 3.6.2Identifikasi Mikroorganisme KeberhasilanidentiIikasisuatumikroorganismetergantungpada beberapaIaktoryaitubiakanharusbenar-benarmurni,bekeriasecara berurutandarikarakteristikumumdanyangkhususberdasarkanciri-ciri organisme,menggunakansemuainIormasiyangtersediauntuk pendekatanhasilyangingintercapai,selalumenerapkanlogikapada setiap tahap pengeriaan,menggunakan penomoran uii untuk memastikan identiIikasi,danisolatyangdiuiidibandingkandenganbiakan perbandingan yang sudah distandarisasi. 23

BeberapahalyangharusdiperhatikandalammengidentiIikasi mikroorganisme : a. MorIologis Pengamatanspesimendenganbantuanmikroskop,baikdiwarnai denganpewarnaangramatautidak,teknikmikroskopelektron memungkinkanpengambilanspesimenmikrobasampaiukuran ultramikron. b. Nutrisi Penentuan zat kimia yang diperlukan untuk menuniang pertumbuhan mikroorganisme. c. Pertumbuhan mikroorganisme PenentuanproIilpertumbuhanmikrobapadaberbagaimacam medium baik yang cair maupun yang padat. d. Metabolisme Beberapauiidilakukanuntukmengetahuiapakahmikroba menyebabkanperubahankimiasuatuzatkhususatautidak. Misalnya, mikroba dapat mengubah karbohidrat meniadi asam.e. Susunan kimia Berbagaitekniktersediauntukmemcahkanseldanuntuk mengisolasikomponen-komponenselyangkhususdaricampuran yangdiperoleh,misalnyaIragmendindingsel,bahannukleus,dan membran. I. Patogenitas Penentuanpotensisuatubiakanmikrobauntukmenimbulkan penyakitdilakukandenganmenginokulasihewanatautumbuhan dengan biakan murni mikroorganisme. 3.6.3Mikroba yang diuji di laboratorium mikrobiologi MikrobayangdiuiidilaboratoriummikrobiologiBBPOM mencakupkapang,khamir,danbakteri.Untukbakteri,dapatdibedakan meniadibakteriindikatordanbakteripatogen.Bakteriindikatoradalah bakteri Ilora normal yang terdapatdi tubuhmanusia tetapi iika berada di dalamprodukuiimerupakanindikasikurangnyahigienissaatproses produksi.ContohnyaadalahStaphvlococcusaureus,Escherichiacoli, 24

danEnterococcus,sedangkanbakteripatogenadalahbakteriyang keberadaannyadalamprodukuiitidakbolehadakarenapasti menyebabkan penyakit, misalnya Salmonella.a. Staphvlococcus StaphvlococcusaureusmerupakanbakterigrampositiIyang berbentukbulatatauloniong(0,8-0,9m),dapatbergerak,tidak bersporadantersusundalamkelompok(sepertibuahanggur). Saureus bersiIat aerobdan tumbuhbaikpadaperbenihan sederhana padatemperaturoptimum37CdanpH7,4.Saereusmerupakan salahsatubakteriyangcukupkebaldiantaraorganisme-organisme tak berspora dan beberapa strain mampu menghasilkan racun protein yangstabilterhadappanas.Saereustahanpemanasanpadasuhu 60C selama 30 menit dan tahan terhadap Ienol 1 selama 15 menit. Saereusterdapatdiudara,debu,kotoran,air,susu,makananatau peralatanmasak,hewandanmanusia.Manusiadanhewan merupakan reservoir utama. Bakteri ini dapat ditemukan di berbagai bagian tubuh manusia sehat seperti hidung, tenggorokan, rambut,dan kulit,karenaitulahSaereusmudahmasukkedalammakanan. Pengidap(carrier)Saereuspadanasalsebanyak40-50dari populasi.Saereusiugaditemukanpadapakaian,sprei,danbenda lain di lingkungan manusia. -. Bacillus cereus acillus cereus adalah bakteri Gram positiI, berbentuk batang besar, bersiIataerobIakultatiI,menghasilkanenterotoksin,membenttuk spora yang tidak berkembang meniadi sporangium.c. Escherichia coli Escherichia coli adalah Ilora alami pada usus manusia atau binatang. PenentuanadanyaEcolipadaairminumdipakaisebagai pencemaran tinia manusia atau hewan. Bakteri ini berukuran 2,4 m x0,4-0,7m,GramnegatiI,bergerakaktiIdantidakberspora. BersiIatIakultatiI anaerobdan tumbuhpadaperbenihanbiasa. Suhu optimumpertumbuhanadalah37C.Bakteriinidapatbertahan berbulan-bulanpadatanahdandalamair,tetapidapatdimatikan denganpemanasanpada60Cselama20menit.Bakteriinipeka 25

terhadapstreptomisin,tetrasiklin,kloramIenikol,danasam nalidiksatEcolidapatmenyebabkaninIeksididalamdandiluar salurancerna,diantaranyainIeksisalurankemih,meningitis, peritonitis, dan pneumonia. /. Salmonella Salmonella merupakan bakteri patogen untuk manusia atau binatang. Salmonellatumbuhcepatdalammediayangsederhana,tetapi hampir tidak pernah memIermentasi laktosa atau sukrosa. Bakteri ini membentukasamdankadanggasdariglukosadanmanosaserta biasanyamemproduksiH2S.Bakteriiniiugatahanhidupdalamair membeku pada periode yang lama. Salmonella tahan terhadap bahan kimia tertentu (misalnya briliant green, sodium tetrathionate. sodium desoxvcholate)yangmenghambatbakterienteriklain;senyawa tersebutkemudianbergunauntukditambahkanpadamediauntuk mengisolasikanSalmonelladaritinia.Salmonellatvphimerupakan penyebabinIeksiutamapadamanusia,daninIeksidaribakteriini bersumber dari manusia.e. Pseu/omonas aeruginosa !seudomonasaeruginosaberbentukbatang,merupakanbakteri Gram negatiI berukuran 0,5-0,8 m sampai 1,5-3 m. Bergerak aktiI denganIlageldisalahsatuuiungnya.Bakteriinitumbuhpada kondisiaerob.Dapatditemukandiair,tanah,ataupadapermukaan kontak dengan air dan tanah, pada tumbuhan dan iuga hewan. 1. Ji-rio cholerae Bakteriinibentuknyabengkok,sepertikoma,berukuran1,5mx 0,2-0,4 m. 'cholerae ini sangat aerob, tumbuh pada pH basa (7,5-9,6)dansuhu22-40C(suhuoptimum37C).%umbuhbaikpada perbenihan biasa. Mati pada pemanasan 55C selama 15 menit. Mati olehpengeringan,demikianiugaakanmatisegarolehasam lambung. Peka terhadap streptomisin, kloramIenikol dan tetrasiklin. g. Clostri/ium per1ringens lostridiumperfringensberbentukbatangbesaryangdapat menghasilkansporadanmenghaslikandaerahhemolisispadapelat agardarah.perfringenstidakbergerak,hiduppadakondisi 26

anaerob.SporadapatdimatikandenganotoklaIpadasuhu121C selama 18 menit. Spora tahan terhadap antiseptik dan desinIektan.h. Can/i/a al-icans andida albicans adalah khamir berbentuk oval bertunas, berukuran 2-3mx4-6m.PadamediaPDA(!otatoDextroseAgar)yang diinkubasipadasuhukamar,terbentukkolonilunakberwarnakrim yang berbau seperti ragi.i. Aspegillus niger Aspergillusnigermerupakansalahsatuiamuryangseringdiiumpai dalam penguiian kapang atau khamir. 3.6.4 1enis penyakit akibat kontaminasi mikroba Dilihat dari sumber penyakit yang masuk ke dalam tubuh dan dapat menimbulkangeialasakit,makageialapenyakitmelaluimakanan dapat dibedakan meniadi dua macam, yaitu : 1. InIeksi IstilahinIeksidigunakanuntukmenyatakantertelannyaatau masuknyasuatumikroorganismepatogenkedalamtubuh, kemudiandapatmenembussistempertahanantubuh,hidupdan berkembang biak serta menimbulkan inIeksi. Bakteri yang biasa menimbulkan inIeksi diantaranya Salmonella sp., Shigella sp. 2. Intoksikasi (keracunan) Istilah intoksikasi digunakan untukmenyatakan tertelannya atau masuknyasuatutoksinkedalamtubuh.Misalnyaracunbotulin dan racun bongkrek pada tempe bongkrek. Faktor-Iaktoryangmenuniangteriadinyapenyakityangberasal darimakanandiantaranyayaitumakananyangkurangmatang, penyimpanan makanan pada suhu yang tidak sesuai, makanan yang diperolehdarisumberyangtidakbersih,alat-alatyangtercemar, kesehatanperseoranganyangkurangbaik,cara-carapengawetan yang kurang sempurna.Prosesmemasakyangkurangdapatteriadibilamemasakunggas ataudagingpanggangberukuranbesar,karenaukurannyadapat 27

menambahmasalahpenetrasipanasyangcukup.%anpa penggunaansuhuyangcukuptinggidancukuplama, mikroorganisme(termasukparasit)tidakterbunuhdanracunyang tahan panas (seperti racun botulin) tidak dapat termusnahkan. Penyimpanan makanan pada suhu yang kurang sesuai, seperti suhu kamaryanghangat,memudahkanpertumbuhanmikroba. Pertumbuhanmikrobadanpembentukanracunberkaitandengan waktudansuhu.Olehkarenaitu,penyimpananmakananuntuk waktu lama paling baik dilakukan pada suhu beku. Makananyangdiperolehdarisumberyangtidakamanberarti makanan tersebut sudah beracun seiak semula. Contoh makanan ini adalahspesiesiamurdankerangberacun.Pencemaranmakanan olehmikrorganismelewatalat-alatdapatdikurangibilapencucian alat-alat tersebut dilakukan dengan sanitasi yang baik. Beberapa ienis penyakit yang berasal dari makanan : 1. Salmonelasis SalmonelasismerupakaninIeksiolehbakteriSalmonella.yang menyerangsalurangastrointestinalyangmencakupperut,usus halusdanususbesar.%eriadinyasakitperutyangmendadak membedakannyadaripenyakitperutlainsepertidisentribasiler ataudisentriamuba.Waktumunculnyageialaadalahenam sampaienampuluhdelapaniamsetelahmakanyangtercemar Salmonella,ditandaiolehtimbulnyarasasakitperutmendadak.%erinIeksinyamanusiaolehSalmonellahampirselalu disebabkanolehkonsumsimakananatauminumanyang tercemar.Makananyangbiasanyatercemarmeliputikue-kue yangmengandungsusu,dagingcincang,sosis,daging panggang,ikan,udang,swike,ragi,kelapa,gelatinkering, mentega kacang, coklat, saus, dan telur. 2 Intoksikasi Stapvlococcal Keracunanmakananyangumumteriadidisebabkanoleh termakannyaenterotoksinyangdihasilkanolehStaphvlococcus aureusyangmencemarimakanan. Padaumumnyageiala-geiala mual,pusing,muntah,dandiaremunculduasampaienamiam 28

setelahmakanmakanan yang tercemar. Makanan yang tercemar iikadibiarkanpada suhukamarselamadelapansampaisepuluh iam,cukupuntukmenghasilkantoksindalamiumlahyang memadaiuntukmenyebabkankeracunan.Keracunanmakanan olehSaureusteriadiiikamenelanmakananyangtercemar enterotoksindari Saureusmisalnyadagingsapi,ikan,susudan hasil olahannya, coklat leleh. 3. InIeksi lostridial InIeksi ini dapat ditimbulkan oleh lostridium perfringens yaitu inIeksiiaringansepertiselulit,nekrosisotot,sertapenyakit gangguan cerna seperti sakit perut dan diare.4. Intoksikasi acillus cereus Keracunanmakananakibatacilluscereusditandaidengan geiala mual, muntah dan diare. 3.6.5 Media Perbenihan untuk Mikroorganisme Perbenihanmemberikanlingkunganyangdiusahakanmirip dengansuasanaalamiahyangdibutuhkanuntukpertumbuhanberbagai ienis mikroorganisme. KlasiIikasi perbenihan berdasarkan : a. Bentuk KlasiIikasiperbenihanberdasarkanbentuknyadibagimeniadi2yaitu perbenihan cair dan perbenihan padat. - Perbenihan cair Dipergunakansebagaiperbenihanpengkayaansebelumdisebarkan padaperbenihanpadat.%idakcocokdipergunakansebagai perbenihanuntukmenginokulasikanmikroorganismeuntuk memperolehbiakanmurni,iugatidakdapatdipakaiuntuk mempelaiari koloni bakteri.Jenis-ienis perbenihan cair : O Kaldu Cairan iernih tembus cahaya dan berwarna kuning ierami, dibuat dari ekstrak daging atau pepton. 29

O Pepton Merupakanproteinyangterhodrolisissebagiandengan menggunakanenzimhidrolitik,misalnyapepsin,tripsin,papain dan lain-lain. O kstrak ragi Dibuat dengan mengekstrasikan ragi yang diotolisiskan dengan air. Mempunyai kandungan vitamin B yang tinggi. - Perbenihan padat Dipergunakanuntukmempelaiarikolonibakteri.Pentingdalam menginokulasikan bakteri untuk mendapatkan biakan murni. O Agar-agar Isiperbenihanpadatyangpentingdanmerupakansenyawa polisakaridarumit,diperolehdarirumputlaut.Mencairpada suhu 80-100C dan membeku pada suhu 35-42C O Gelatin Merupakanproteinyangdibuatdenganhidrolisiskolagen menggunakanairmendidih.Mencairpadasuhu37C, membentukgelyangtembuscahayapadasuhu25C. Penggunaanutamagelatinialahuntukmenguiikemampuan bakteridalammencairkangelatintersebut.Jikaperbenihan menghitam, artinya ada pembentukan hidrogen sulIida. b. %uiuanKlasiIikasi perbenihan berdasarkan tuiuan terbagi meniadi perbenihan sederhana,perbenihankompleks,perbenihanbuatandanperbenihan khusus.- Perbenihan sederhana Disebutiugaperbenihandasar,terdiridariekstrakdaging,pepton, natrium klorida dan air. O Airpepton:dibuatdenganpenambahan1gpeptondan0,5g natrium klorida ke dalam 100 mL air suling. O Agargizi:kaldugiziditambah2agar-agarmembentukagar gizi. 30

- Perbenihan kompleks Mengandungzat-zatyangdipergunakanuntukkeperluankhusus atauuntukmenuniukkanadanyasiIat-siIatkhasbakteriatau mengandung zat-zat khusus untuk pembiakan bakteri tertentu. - Perbenihan buatan atau terarah Perbenihaninidibuathanyadarizatkimiamurnidansusunan kandunganmasing-masingzattidakditentukan,karenahanya digunakan untuk tuiuan penelitian. - Perbenihan khusus, dibagi meniadi beberapa, yaitu : O Perbenihan diperkaya Merupakanperbenihandasaryangditambahkanbahan-bahan tertentu seperti darah, serum atau telur. Contoh : agar darah O Perbenihan persemaian Perbenihan yang ditambahkan beberapa zat dengan tuiuan suatu organisme akan tumbuh lebih banyak dari pada organismeyang tidak diinginkan. Contoh : kaldu selenit F, kaldu tetrationat. O Perbenihan selektiI Perbenihanpersemaianyangditambahkanzatpenghambatpada suatu perbenihan padat. Contoh : perbenihan desoksikolat sitrat. O Perbenihan indikator Perbenihanmengandungindikatoryangberubahwarnaiika ditumbuhibakteri.Contoh:perbenihanWilsonBlair (SalmonellatvphimereduksibismuthsulIitmeniadisulIida dengan koloni spesiIik berwarna hitam berkilap logam). O Perbenihan diIerensial Perbenihaninidapatmenumbuhkanbeberapaienisbakteri, tetapimempunyaisiIatmampumemunculkanperbedaansiIat-siIatkhasbakteriatausatutipebakteriakantumbuhdengan khas.Contoh:EosinMethvlenlueAgar.etrimideAgar. Entrobacter sakazakii Isolation Agar. O Perbenihan gula-gula Perbenihanyangmengandung1gulatertentudidalamairbersama-samadenganindikatoryangcocok.Didalamnya 31

dimasukkantabungDurhamyangdibalikuntukmengetahui adanya pembentukan gas. Berbagai ienis media perbenihan untuk penguiian : - Bair/ Parker Agar (BPA) O Komposisi:agar,glisin,natriumpiruvat,kaseinyang didigesti enzim pankreas, litium klorida, veast extract. O pH : 7,00,2 pada suhu 25CO Kegunaan:dasarpreparasiagarBP-%(aird!arker EGG-YolkTellurite)untukisolasiselektiIdanenumerasi staIilokoki koagulasi positiI dalam makanan, kulit, tanah, dan bahanlainnya.Mediainimengandunglitiumkloridadan telluriteyangdapatmenghambatpertumbuhanIloralain, kemudianpiruvatdanglisinsecaraselektiImenstimulasi pertumbuhanStaphvlococcusStaphvlococcusakan membentukkolonihitamdarireduksitelluritmeniadi tellurium,dengandikelilingizonabening akibat lipolisisdan proteolisis kuning telur. - Bu11er Pepton Water (BPW) O Komposisi:gelatinyangdidigestienzimpankreas,natrium klorida, dinatrium hidrogen IosIat, kalium hidrogen IosIat. O pH : 7,20,2 pada suhu 25C O Kegunaan:mediapra-pengkayaanuntukisolasi Salmonella, khususnyamikroorganisme yangmerusak pada berbagai produk pangan. - Brilliant Creen Lactose Bile Broth (BGLB) O Komposisi : empedu sapi terdehidrasi, laktosa, gelatin yang didigestienzimpankreas,4-metilumbelliIeril--D-glukuronida, pewarna brilliant green O pH : 7,20,2 pada suhu 25C O Kegunaan : deteksi bakteri oliform padamakanan, produk olahansusu.air,danairbuangansertabahantersanitasi 32

lainnya.Keberadaan Ecolidan oliformlaindiindikasikan dengan adanya Iluorosensi pada tabung. - Brilliant Creen Agar (BGA) O Komposisi:agar,laktosa,sukrosaiaringanhewanyang didigestipepsin,kaseinyangdidigestienzimpankreas, natrium klorida, merah Ienol, pewarna brilliant green O pH : 6,90,2 pada suhu 25C O Kegunaan:isolasiselektiISalmonellaselainStvphidari Iesesatauspesimenlain,sertapadaprodukpangandan olahansusu.Salmonella,selainStvphi,munculsebagai kolonimerah,merahmuda,hinggaputihdandikelilingi zonamerahpadaagaryangmengindikasikanIermentasi non sukrosa atau laktosa. !roteus atau !seudomonasdapat munculsebagaikolonikecilberwarnamerah.Bakteriyang memIermentasilaktosa atau sukrosamunculsebagaikoloni kuning hiiau yang dikelilingi zona kuning hiiau pada agar. - Eosin Methvlene Blue Agar (EMBA) O Komposisi:agar,kaseinyangdidigestienzimpankreas, laktosa,sukrosa,kaliumhidrogenIosIat,eosin,metilen biru. O pH : 7,20,2 pada 25C O Kegunaan : isolasi, kultivasi, dan diIerensiasi bakteri enterik GramnegatiIberdasarkanIermentasilaktosa.Bakteriyang memIermentasilaktosa,khususnyaEcoli.munculsebagai kolonihiiaumetalik,hitamkebiruan,ataucoklat.Bakteri yangtidakmemIermentasilaktosamunculsebagaikoloni ungu muda yang transparan. - lui/ 1hioglvcolate Me/ium (FTM) O Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, glukosa, veastextract,natriumklorida,agar,L-sistin,natrium tioglikolat, resazurin. O pH : 7,10,2 pada suhu 25C 33

O Kegunaaan:kultivasimikroorganismeanaerob, mikroaeroIilik,danaerob.Digunakaniugadalamuii sterilitas alat dan produk kesehatan O Mekanismekeria:agenpereduksitioglikolatdansistem meniaminanaerobiosisyangcukupbahkanuntukbakteri anaerobyangselektiIsekalipun.GugussulIhidrilpada senyawainiiugamenginaktivasiarsenik,merkuridan komponen logam berat lain. - Letheen Broth (LB) O Komposisi : pepton dari daging, pepton dari kasein,ekstrak daging,ekstrakragi,natriumbisulIit,natriumklorida, lesitin. O pH : 7,20,2 pada suhu 25C O Warna media : keruh, kuning kecoklatan O Mekanismekeria:mediakayanutrisiyangiugaberIungsi untukmenetralisasikandungangugusamoniumkuartener dari bahan pengawet yang ada di dalam sampel uii. - MacConkev Broth(MCB) O Komposisi : gelatinyangdidigesti enzim pankreas, laktosa, empedu sapi, bromkresol ungu. O pH : 7,30,2 pada 25C O Kegunaan:kultivasidanisolasiselektiIbakterioliform dalam susu dan air. O Mekanismekeria:larutaninimengandunglaktosa,yang ketikaterdegradasimenghasilkanasamdangas.Gasyang terbentukditampungolehtabungDurhamdanasamyang dihasilkandideteksiolehindikatorbromkresolunguyang berubahmeniadikuning.mpedusapimeningkatkan pertumbuhandaribeberapaspesiesbakterisalurancerna danmenghambatmikroorganismelainnyayang tidakhidup di saluran cerna. 34

- Muller-Kau11mann 1etrathionate Aovo-iocin (MKTTn) O Komposisi : ekstrak daging, enzim pencerna kasein, natrium klorida, kalsium karbonat, natrium tiosulIat anhidrat, oxbile. briliant green O pH : 8.20,2 pada suhu 25C O Kegunaan:mediadiIerensiasiuntukprosespengkayaan terutama untuk bakteri Salmonella - Autrien Agar (NA) O Komposisi:agarpepton,natriumklorida,veastextract. beef extract O pH : 7,40,2 pada suhu 25C O Kegunaan:mediapertumbuhanyanguniversaluntuk menumbuhkan sedikit mikroorganisme tertentu. - Plate Count Agar (PCA)/1rvptone Clucose Yeast Extract Agar (TGEA) O Komposisi:agar,kaseinyangdidigestienzimpankreas, veast extract, glukosa O pH : 7,20,2 pada suhu 25C O Kegunaan : enumerasi bakteri viabel dalam susu dan produk olahannya, estimasi iumlah bakteri heterotroIik hidup dalam airsertakultivasidanpemeliharaanrevibacteriumcasei, epedermidis, dan Methvlobacterium mesophilicum Media %GAdigunakanuntukmelihatbakteriyangdapat membentuk spora seperti acillus subtilis. - Potato Dextrose Agar (PDA) O Komposisi:glukosa,agar,inIusikentang,larutanasam tartrat O pH : 5,60,2 pada suhu 25C O Kegunaan : kultivasi dan enumerasi kapang dan khamir O Mekanismekeria:inIuskarbohidratdarikentang menginisiasipertumbuhankapangdankhamir.NilaipH yangrendahsecaratidaklangsungdapatmenghambat pertumbuhanbakteri,namuniikapenumbuhandituiukan 35

untukpenghitungan(fungalcount)makapHharusdibuat hingga3,5.Fungsipenumbuhandalammediainiadalah untuk mengembangkan tvpical morphologv. - #appaport Jassila/is Soja (RVS) O Komposisi:peptondarisoymeal,magnesiumklorida heksahidrat,natriumklorida,dikaliumhidrogenIosIat, malchite greenO Kegunaan : media pengkayaan untuk Salmonella O Mekanismekeria:peptondarisovmeal,malachitegreen, danmagnesiumkloridamendukungpertumbuhan Salmonella pada suhu 42C. - Selenite Cvstine Broth (SCB) O Komposisi : pepton dari kasein, sistin, laktosa, dapar IosIat, dan natrium hidrogen selenit. O pH : 7,0 pada suhu 25C O Kegunaan:sebagaimediapengkayaanSalmonella.Selenit akanmenghambatpertumbuhanbakterioliformdan Enterococcuspada6-12iampertamainkubasisecara bertahap.SedangkanpadaSalmonella.!roteus.dan !seudomonas.selenithanyaakansedikitmenghambat pertumbuhan. - 1hiosul1ate Citrate Bile Salt Agar (TCBSA) O Komposisi:sukrosa,agar,natriumklorida,natriumsitrat, natriumbisulIit,veastextract,kaseinyangdidigestienzim pankreas,iaringanhewanyangdidigestipepsin,empedu sapi, natrium kolat, Ierri sitrat, timol biru, brom timol biru. O pH : 8,60,2 pada 25C O Kegunaan:isolasiselektiI'ibriocholeradan'parahaemolvticusdariberbagaispesimenklinikdan nonklinik. O Mekanismekeria:konsentrasitiosulIatdansitratyang tinggisertabasakuatdalammediuminisecaraluas menghambatpertumbuhanEnterobacteriaceaempedu 36

sapidankolatterutamamenekanEnterococci.Bakteri oliformlainyangmemungkinkantumbuhtidakdapat memetabolismesukrosa.Hanyabeberapagalur!roteus yangpositiIsukrosadapattumbuhdanmembentukkoloni berwarnakuningsepertikoloni'ibrio.%CBSA mengandung indikator campuran timol biru dan brom timol biruakanberubahwarnameniadikuningsaatasam terbentuk meskipun medium ini bersiIat basa kuat. - 1rvptone Sov Broth (TSB) O Komposisi:kaseinyangdidigestienzimpankreas,natrium klorida,kedelaiyangdidigestienzimpankreas,kalium hidrogen IosIat, glukosa. O pH : 7,30,2 pada suhu 25C O Kegunaan :kultivasi berbagai ienis mikroorganisme - 1rvptone Water/1rvptone Broth (TW/TB) O Komposisi:kaseinyangdidigestienzimpankreas,natrium klorida O pH : 7,50,2 pada suhu 25C O Kegunaan:merupakanmediauntukkultivasiproduksi indol oleh berbagai ienis mikroorganisme 3.7 METODE PENGU1IAN 3.7.1Sumber Metode Pengujian Balai Pengawas Obat dan Makanan memiliki kelompok penguiian untukmenguiisetiapobatdanmakananyangberedar,salahsatunya adalahpenguiianmikrobiologi.Penguiianmikrobiologipenting dilakukan untuk mengetahui mutu dan kehigienisan suatu produk. Dalam setiappenguiianmakanan,alatkesehatan,kosmetik,obattradisional, antibiotik,ataukomplemendilakukanberdasarkansuatuprosedur operasionalbakupenguiianmikrobiologiyangdisusunberdasarkan ketentuan yang ada di dalam : 1. Farmakope Indonesia IV 2. &nited State !harmacopoeia (USP) 37

ritish !harmacopoeia 4 Manual of Food Qualitv ontrol 5. Standar Nasional Indonesia (SNI) 6. PustakalainyangmenuniangprosedurpenguiianbesertadaItar kebutuhan alat dan media yang diperlukan. PusatPemeriksaanObatdanMakanan(PPOM)telahmenyusunBuku ProsedurOperasionalBakuPenguiianMikrobiologisebagaipedoman umumuntukpenguiianperbekalanIarmasidanmakananolehBalai Pengawas Obat dan Makanan di seluruh Indonesia. 3.7.2 Ketentuan Umum Secaragarisbesarmetodepenguiianmikrobiologidapat digolongkankedalamduakelompok,yaitupenguiiankuantitatiIdan kualitatiI.PenguiiankuantitatiIdilakukanuntukmengetahuicemaran mikroba,sedangkanpenguiiankualitatiIdilakukanuntuk mengidentiIikasi adanya cemaran bakteri atau kapang patogen. %ahapanpenguiiankuantitatiIterdiridaripersiapandan homogenisasicontohsampel,pengenceran,perhitungankoloni,dan pengambilankesimpulansedangkantahapandaripenguiiankualitatiI meliputipersiapandanhomogenisasisampel,pengenceran,isolasi, identiIikasi, konIirmasi, dan pengambilan keputusan. %ahapanpersiapandanhomogenisasicontohdilakukansesuai dengan bentuk sediaan dan kemasan dari sampel produk. Dalam tahap ini perludiperhatikanapakahsampelyangdiuiimengandungbahan penghambatpertumbuhanmikrobaatautidak.Padatahappersiapan, produkyangmengandungbahanpengawetperluditambahkanzat penetraluntukmenginaktivasipengawet.Zatpenetralyangbiasa digunakan adalah larutan 0,5 soy lecithin dan 4 polisorbat 20. Selaintahapan-tahapananalisis,penguiianmikrobiologiiuga sangatdipengaruhiolehketelitiankeriapadapenyiapanalatdanmedia. Pengawasanpadapekeriaaniniperludilakukansecaraterpadudan teratur. 38

3.7.3 PersiapandanHomogenisasiSampelMakanan.Obat Tradisional. kosmetik Homogenisasisampeladalahcarapersiapansampel(makanan, kosmetik,danobattradisional)untukmemperolehdistribusibakteri secara merata di dalam sampel uii. Prinsipdarihomogenisasisampeladalahmembebaskansel-sel bakteriyangmasihterlindungiolehpartikelsampeldanuntuk mengaktiIkankembalisel-selbakteriyangmungkinviabilitasnya berkurangkarenakondisiyangkurangmenguntungkanselamaproses pembuatan sampel. Adapunalat-alatyangdigunakanadalah:alatcincangyang sesuai,alathomogenisasi(stomacherataublender),wadahpencampur (blenderiar)darigelasataulogamyangtahansuhuotoklaI,timbangandengankapasitas2000gdantingkatkepekaan0,1g,pisau,garpu, sendok,gunting, spatula,pembukakaleng,gelaspiala,laburlenmeyer, tabung reaksi, dan botol pengencer steril, dan lain-lain. Larutan pengencer yang sering digunakan adalah :O Sampel makanan dan minuman Alkaline!eptoneWater(APW),uffered!eptoneWater(BPW), !eptone Dilution Fluid (PDF) O Sampel kosmetik Modified Letheen roth (MLB) O Sampel obat tradisional Letheen roth (LB), !eptone Dilution Fluid (PDF) Disiapkan peralatan untuk penyiapan sampel yang sudah steril atau dapat disterilkanmenggunakan apibunsensetelahterlebihdahuludibersihkan dengan alkohol 70 sesaat sebelum penguiian berlangsung. a. Wadah terbuat dari kertas atau plastik Padabagianwadahyangakandibersihkandenganalkohol70, kemudian dibuka secara aseptik 39

b. Wadah botol kaca Sumbatataututupbotoldibersihkandenganalkohol70,kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen c. Wadah kaleng Permukaankalengdicucidandibersihkandenganalkohol70, kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen Prosedur dalam melakukan homogenisasi sampel : A. Homogenisasi sampel makanan 1. Makanan bentuk cairan Sampeldikocoksebanyak25kali,dengancaraaseptikdipipet 25mLcuplikansampelkedalamwadahsterilyangsesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai homogensehinggadiperolehsuspensidenganpengenceran 1:10 (10-1) 2. Makanan bentuk serbuk Dengancaraaseptikditimbang25gcuplikankedalamkantong stomacher atau labu rlenmeyer atau wadah steril lain yang sesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai homogensehinggadiperolehsuspensidenganpengenceran 1:10 (10-1). 3. Makanan bentuk kental Dengancaraaseptikdipipet25mLatauditimbang25gcuplikan kedalamkantongstomacherataulaburlenmeyeratauwadah sterillainyangsesuai,kemudianditambahkan225mLlarutan pengencer,dikocoksampaihomogensehinggadiperolehsuspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) 4. Makanan bentuk padat Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam blender iar ataukantongstomacher,ditambahkan225mLlarutanpengencer, kemudiandihomogenkansehinggadiperolehsuspensidengan pengenceran 1:10 (10-1) 40

Catatan : - Untuk sampel keiu, cuplikan dihomogenkan dalam blender yang dihangatkan dalam larutan pengencer yang dihangatkan. - Untuk sampel mentega atau margarin, sampel dipanaskan dalam tangas air suhu40Cselama tidaklebihdari15menithingga bisa dipipet. Cuplikan dipipet 25 mL secara aseptik dengan pipet yangdihangatkankedalamwadahyangberisi225mLlarutan pengencerhangatdankemudiandikocokhomogensehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) 5. Makanan beku Sampelyangmasihbekuharusdipecahmeniadibagian-bagian yanglebihkecildenganmenggunakanperalatantumpul.Bila sampelbentukbalokbesar,misalikan ataudaging,cuplikandapat diambildenganbantuangergaii,pisauataubor.Caralainnya adalahsampelbekudapatdisimpanterlebihdahulupadasuhu lemariesselamatidaklebihdari12iamuntukmemudahkan pengambilancuplikan.Untuksampelyangtidakterlalubeku seperties krim, dapat dibiarkan terlebih dahulu pada suhu ruangan selamatidaklebihdari15menit.Setelahcukupleleh,sampel dalam kemasan diaduk homogen dengan hati-hati, kemudian secara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai ataublender,selaniutnyadihomogenkansehinggadiperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1 ) 6. Makanan yang dikalengkan Keadaanwadahdiamati.Bilakeadaannyanormal,dilakukanpra-inkubasi sebagai berikut : - Produk berkeasaman rendah pada suhu 30-35C selama 10 hari - Produk bersiIat asam pada suhu 25-30C selama 10 hari - Produk berkeasaman tinggi (dipersiapkan untuk penyimpanan di atas 40C) pada suhu 55C selama 5-7 hari Setelahmasainkubasi,kondisiwadahdiamatikembali.Dilihat adanyakebocoranpinholedankerusakankaleng.%erhadapkaleng yangutuhdilaniutkanpenguiian.Setelahwadahdibuka,diambil seiumlah25gcuplikandandimasukkankedalamwadahblender. 41

Ditambahkan225mLlarutanpengencersehinggadiperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10-1) B. Homogenisasi sampel obat tradisional 1. Sediaan bentuk serbuk Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikankedalamwadah steril,ditambahkan90mLPDF.Jikaiumlahsampelkurangdari10g,makapengambilancuplikandanpengencerdisesuaikan hinggadiperolehsuspensipengenceran1:10dandikocok homogen. 2. Sediaan bentuk raiangan Dengancaraaseptikseiumlahsampelbentukraiangandipotong-potongmenggunakanpisau(guntingsteril)meniadibagian-bagian yanglebihkecil.Sebagianditumbukdalamcawanmortarsupaya meniadi partikel yang lebih kecil. Dari sampel yang telah dipotong-potong,dengancaraaseptikditimbang10gcuplikandimasukkan kedalamwadahsterilyangsesuai,ditambahkan90mLPDF, dikocok homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10. 3. Sediaan bentuk kapsul Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikan,kedalamwadah sterilyangsesuaiditambahkan90mLLBdihomogenkansampai seluruhkapsulhancursehinggadiperolehsuspensipengenceran 1 : 10.4. Sediaan bentuk tablet dan pil Dengan cara aseptik ditimbang 10 cuplikan,kedalamwadah steril yangsesuaiditambahkan90mLLB,cuplikandibiarkanterendam sampailunakkemudiandihomogenkansehinggadiperoleh suspensipengenceran1:10.Bilacuplikansukarhancurlebih dahulu digerus secara aseptik di dalam mortar. 5. Sediaan bentuk cairan Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan, ke dalam wadah steril yangsesuaiditambahkan90mLLBkemudiandihomogenkan sehingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10. 42

6. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikankedalamwadah sterilyangsesuaiditambahkan1-2mL%ween80dandiaduk. SelaniutnyaditambahkanLetheenrothdiadukhomogenhingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10 C. Homogenisasi sampel kosmetik 1. Sediaan bentuk cair Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL MLB. Jika iumlah sampel kurang dari10mL,makavolumecuplikandanpengencerdisesuaikan hinggadiperolehsuspensidenganpengenceran10-1dandikocok homogen. 2. Sediaan bentuk padat dan serbuk Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikankedalamwadah sterilyangsesuai.Jikadiperlukancuplikanpadatdihancurkan terlebihdahulumenggunakanlumpang,mortardanalusteril. Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 10 mL %ween 80 steril,diadukhomogenhinggaterbentukpasta.Selaniutnya ditambahkanMLB,dicukupkanhinggadiperolehsuspensidengan pengenceran 10-1 dan dikocok homogen. 3. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikankedalamwadah sterilyangsesuaiditambahkan%ween80sambildiaduk, selaniutnyaditambahkanMLB,dicukupkanhinggadiperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan dikocok homogen. 4. Sediaan serbuk, sabun, cairan bentuk aerosol Bagianmulutpenyemprotdibersihkandengankapasberalkohol 70,kemudiandisemprotkanseiumlahcuplikankedalamwadah sterilyangsesuai.SetelahditimbangditambahkanMLB disesuaikan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1.

43

5. Sediaan yang mengandung lemak atau lilin (lipstick) Dengancaraaseptikditimbang10gcuplikankedalamwadah sterilyangsesuai.Jikadiperlukancuplikanpadatdihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang, mortar dan alu steril. Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 2 mL paraIin cair sterilsecaraperlahan-lahankemudianditambahkan10mL%ween 20,diadukhomogenhinggaterbentukpasta.Selaniutnya ditambahkanMLB,dicukupkanhinggadiperolehsuspensidengan pengenceran 10-1 dan diaduk homogen. 3.7.4 Metode Pengujian Produk A. Uji Angka Lempeng Total Ruang Lingkup Metodeinidigunakanuntukmenetapkanangkabakteri aerobmesoIildalamsampelmakanan,minuman, kosmetik, dan obat tradisional. Prinsip PertumbuhankolonibakteriaerobmesoIilyangmasih memiliki daya hidup, setelah cuplikan diinokulasikan pada medialempengagardengancaratuangdandiinkubasi pada suhu yang sesuai. Pereaksi khusus 1. Media padat !late ount Agar (1 Liter PCA 1 mL %%C 5) 2. Pengencer !eptonDilutionFluid(PDF)untuksampelmakanan, minumandanobattradisional,Letheenroth(LB) untuksampelkosmetikdanobattradisionalyang mengandung pengawet. 3. Pereaksi Triphenvl Tetrazolium hloride (%%C) Peralatan khusus Lemari aseptik tipe vertikal, stomacher atau blender, pipet ukur mulut lebar, alat hitung koloni, inkubator 35-37C 44

Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dilakukandengancara prosedurhomogenisasi sampel sesuaiienissampelsehinggadiperolehsuspensi sampel dengan konsentrasi10-1 dalam pengencer yang sesuai. 2. Pengenceran Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 1 mL ke dalam tabungberisi9mLpengencerpertamadikocok homogenhinggadiperolehsuspensipengenceran10-2. Pengencerandilaniutkandengancarayangsama hinggadiperoleh suspensidengan pengenceransesuai denganyangdiperlukan(duadigitdibawahsyarat SNI) 3. Inokulasi dan Inkubasi Daritiappengencerandipipet1mLkedalamcawan petri sterilmasing-masing dibuat duplo. Ke dalam tiap cawanpetriyangtelahdimasukkansampel, dituangkan15-20mLmediaPCAcairsuhu45C yangtelahditambahkanpereaksi%%C,segeracawan digoyangdandiputarsedemikianrupasehingga suspensitercampurmeratadalammediakemudian dibiarkan memadat. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengenceran dibuat uii kontrol (blanko). Pada satu cawandiisi1mLpengencertanpasampeldanmedia agar,padacawanyanglaindiisimedia.Setelahagar memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35-37C selama 24-48 iam dengan posisi dibalik.4. Pengamatan Setiap24iamkoloniyangtumbuhdalamcawanpetri diamati dan dihitung Interpretasi hasil 1. Dipilihcawanpetridarisatupengenceranyang menuniukkaniumlahkoloniantara25-250.Jumlah 45

kolonirata-ratadarikeduacawandihitunglalu dikalikandenganIaktorpengencerannya.Hasil dinyatakansebagaiAngkaLempeng%otaldalamtiap gram atau mL sampel. 2. Bilasalahsatudaricawanpetrimenuniukkaniumlah kolonikurangdari25ataulebihdari250koloni, dihitungiumlahrata-ratakoloni,kemudiandikalikan denganIaktorpengencerannya.Hasildinyatakan sebagaiAngkaLempeng%otaldalamtiapgramatau mL sampel. 3. Jikaterdapatcawan-cawandariduatingkat pengenceranyangberurutanmenuniukaniumlah koloniantara25-250,makadihitungiumlahkoloni darimasing-masingtingkatpengencerankemudian dikalikan dengan Iaktor pengencerannya. Apabila hasil perhitunganpadatingkatyanglebihtinggidiperoleh iumlahkolonirata-ratalebihbesardari2kaliiumlah rata-ratapengencerandibawahnya,makaAngka Lempeng%otaldipilihdaritingkatpengenceranyang lebihrendah(misalpadapengenceran10-2 iumlah kolonirata-rata140,padapengenceran10-3 iumlah kolonirata-rata32,makadipilihiumlahkoloni140x 102). Bilahasilperhitunganpadatingkatpengenceranlebih tinggidiperolehiumlahkolonirata-ratakurangdari2 kaliiumlahrata-ratapadapengencerandibawahnya makaAngkaLempeng%otaldihitungdarirata-rata iumlahkolonikeduatingkatpengencerantersebut (misalpada10-2iumlahkolonirata-rata240,pada pengenceran 10-3 iumlah koloni rata-rata 410, makaAngka Lempeng %otal adalah : 240 410 X 102 325 X 102 2 46

4. BilatidaksatupunkolonidalamcawanmakaAngka Lempeng%otaldinyatakansebagaikurangdarisatu (1) dikalikan Iaktor pengenceran terendah. 5. Jikaseluruhcawanmenuniukkaniumlahkolonilebih dari250,dipilihcawantingkatpengencerantertinggi kemudian dibagi meniadi beberapa sektor (2, 4, atau 8) dandihitungiumlahkolonidarisatusektor.Angka Lempeng %otal adalah iumlah koloni dikalikan dengan iumlahsektor,kemudiandihitungrata-ratadarikedua cawan dan dikalikan dengan Iaktor pengenceran. 6. Jumlahkolonirata-ratadari1/8bagiancawanlebih dari200,makaAngkaLempeng%otaldinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan Iaktor pengenceran 7. PerhitungandanpencatatanhasilAngkaLempeng %otalhanyaditulisdalamduaangka.Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan dibulatkan ke atas apabila lebih dari 5. Sebagai contoh :52,3 x 103 dibulatkan meniadi 52 x 103 83,6 x 103 dibulatkan meniadi 84 x 103 8. Jikadiiumpaikolonispreadermeliputiseperempat sampaisetengahbagiancawan,makadihitungkoloni yangtumbuhdiluardaerahspreader.Jika75dari seluruhcawanmempunyaikolonispreaderdengan keadaansepertidiatas,makadicatatsebagai'Spr. Untukkeadaaniniharusdicaripenyebabnyadan diperbaiki cara kerianya (penguiian diulang). 9. JikaDiiumpaikolonispreadertiperantai,makatiap satuderetkoloniyangterpisahdihitungsebagaisatu koloni,danbiladalamkelompokspreaderterdiridari beberapa rantai,maka tiap rantai dihitung sebagai satu koloni. 47

B. Uji Angka Kapang/Khamir Ruang Lingkup Metodeinidigunakanuntukmenetapkanangka kapang/khamirdalamsampelmakanan,minuman, kosmetik, dan obat tradisional. Prinsip Pertumbuhankapang/khamirsetelahcuplikan diinokulasikanpadamediayangsesuaidengancarasebar dan diinkubasi pada suhu 20-25C. Pereaksi khusus 1. Media dan Pengencer !eptoneDilutionFluid(PDF),!otatoDextroseAgar (PDA) yang ditambah kloramIenikol 2. Pereaksi 100 mg kloramIenikol per Liter media Peralatan khusus Lemariaseptik,stomacher ataublender.pipetukurmulut lebar, alat hitung koloni, inkubator 20-25C Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dilakukandengancara prosedurhomogenisasi sampel sesuaiienissampelsehinggadiperolehsuspensi sampel dengan konsentrasi 10-1 dalam pengencer yang sesuai. 2. Pengenceran Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 1 mL ke dalam tabungberisi9mLpengencerpertamadikocok homogenhinggadiperolehsuspensipengenceran10-2. Pengencerandilaniutkandengancarayangsama hinggadiperoleh suspensidengan pengenceran10-4atausesuai denganyangdiperlukan(duadigitdi bawah syarat SNI). 48

3. Inokulasi dan Inkubasi Daritiappengencerandipipet0,5mLkepermukaan lempengmediaPDAyangsebelumnyatelahdituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat, masing-masingdibuatduplo.Dengansegeralempengdigoyangdandiputarsedemikianrupasehingga suspensitersebarmerata.Untukmengetahuisterilitas mediadanpengencerdilakukanuiiblanko.Padasatu lempengPDAditeteskan0,5mLpengencerdisebar-ratakandanuntukuiimediadigunakansatulempeng PDA yang lain. Seluruh lempeng PDA diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu20-25C,denganposisitidakdibalik. Pengamatandanpenghitungankolonikapang/khamir dilakukanmulaihari ke-4 sampai ke-7. Koloni khamir memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai bakteri.Kolonikapangmemilikimiseliumatau Iilamen,sehinggapenampakanumumnyaseperti benang-benanghalusdanberspora.Jumlahkoloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Perhitungan Dipilihcawanpetridarisatupengenceranyang menuniukkaniumlahkoloni antara 10-150. Jumlahkoloni darikeduacawandihitunglaludikalikandenganIaktor pengencerannya.Bilapadacawanpetridariduatingkat pengenceranyangberurutanmenuniukkaniumlahantara 10-150,makadihitungiumlahkolonidandikalikan denganIaktorpengencerannya,kemudiandiambilangka rata-rata. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang/Khamir dalam tiap gram atau mL sampel. Untukbeberapakemungkinanlainyangberbedadari pernyataan di atas, maka diikuti petuniuk sebagai berikut : 1. Bilahanyasalahsatudiantarakeduacawanpetridari pengenceranyangsamamenuniukkaniumlahantara 49

10-150,dihitungiumlahkolonidarikeduacawandan dikalikan dengan Iaktor pengenceran. 2. Bilapadatingkatpengenceranyanglebihtinggi didapat iumlahkoloni lebih besar dari dua kali iumlah kolonipadapengencerandibawahnya,makadipilih tingkatpengenceranterendah(misal:pada pengenceran10-2diperoleh60kolonidanpada pengenceran10-3diperoleh30koloni,makadipilih iumlah koloni pada pengenceran 10-2 yaitu 60 koloni). Bilapadapengenceranyanglebihtinggididapat iumlahkolonikurangdariduakaliiumlahkoloni pengencerandibawahnya,makadiambilangkarata-ratadariiumlahkolonidarikeduapengenceran tersebut.HasildinyatakansebagaiAngkaKapang/Khamirdalamtiapgramsampel(Misalpada pengenceran10-2diperoleh6kolonidanpengenceran 10-3diperoleh10koloni),makaAngka Kapang/Khamir adalah : 6 10 2 3. Biladariseluruhcawanpetritidakadasatupunyang menuniukkaniumlahantara10-150koloni,maka dicatatangkasebenarnyadaritingkatpengenceran terendahdandihitungsebagaiAngkaKapang/Khamir Perkiraan. 4. Bilatidakadapertumbuhanpadasemuacawandan bukan disebabkan karena Iaktor inhibitor, maka Angka Kapang/Khamirdilaporkansebagaikurangdarisatu dikalikandenganIaktorpengenceranterendah(1x Iaktor pengenceran terendah). X 103 8 X 103 50

C. Uji Angka Escherichia coli dalam Makanan dan Minuman Ruang Lingkup Metodeinidigunakanuntukmenetapkanangka Escherichia coli dalam makanan dan minuman. Prinsip PertumbuhanbakteriEcolipadamedialempengselektiI yangsesuai,setelahcuplikandiinokulasikandengancara tuang,diinkubasipadasuhuyangsesuaidandilaniutkan dengan konIirmasi melalui uii biokimia. Pereaksi khusus 1. Media dan Pengencer !eptoneDilutionFluid(PDF),'ioletRedileAgar (VRBA),Escherichiacoliroth(CB),Eosine MethilenelueAgar(MBA),NutrientAgar(NA) atauTrvpticSovAgar(%SA),Trvptoneroth(%B), MR-'! Medium, Simmons itrate Medium (SCA) 2. Pereaksi LarutanIndol(Kovac`s),larutanmetilmerah,larutan alIa-naItol, larutan KOH 40. 3. Mikroba baku Escherichia coli A%CC 25922 Peralatan khusus Alat hitung koloni Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dilakukandengancara prosedurhomogenisasi sampel sesuaiienissampelsehinggadiperolehsuspensi sampel dengan konsentrasi 10-1 dalam pengencer yang sesuai. 2. Pengenceran Disiapkanduatabungataulebihyangmasing-masing telahdiisi 9mL PDF. Darihasilhomogenisasi sampel dipipet1mLsuspensipengenceran10-1kedalam tabungPDFpertamahinggadiperolehsuspensi 51

pengenceran10-2,dikocoksampaihomogen.Buat pengenceranberikutnyahingga10-3atausesuaiyang diperlukan. 3. Inokulasi dan Inkubasi Daritiappengencerandipipet1mLkedalamcawan petri steril,dibuatduplo,kemudiandituangkan15mL VRBAsuhu45C.Cawanpetrisegeradigoyangdan diputarsedemikianrupasehinggasuspensitersebar merata.Untukmengetahuisterilitasmediadan pengencerdilakukanuiiblanko.Padasatucawan diinokulasikan1mLpengencerdanmedia,danpada cawanyanglainhanyadiisimediaagar.Setelah memadat pada tiap cawan dituangkan lagi 5 mL media yangsama,diratakankeseluruhpermukaansebagai lapisanatasdandibiarkanmemadat.Kemudian diinkubasidenganposisidibalikpadasuhu35-37C selama18-24iam.Dihitungkoloniyangberwarna ungukemerahandengandiameter0,5mmataulebih yangdikelilingizonakemerahan.Dipilihcawanpetri darisatupengenceranyangmenuniukkaniumlah kolonispesiIikrata-rata30-100.Dicuplik10koloni spesiIiksecaraacakuntukdilaniutkandengan konIirmasi. KonIirmasi dan IdentiIikasi KolonispesiIikdanbiakanVRBAyangtelahditetapkan kemudiandiinokulasikanmasing-masingkemediaCB yangdilengkapidengantabungDurham,diinkubasipada suhu 44,50,5C selama 24-48 iam, diamati terbentuknya gas dalam tabung Durham. Dari biakan positiI membentuk gasdiinokulasikankelempengmediaMBAdan diinkubasipadasuhu35-37Cselama24-48iamdengan posisidibalik.DiamatipertumbuhankolonispesiIikpada biakanMBAdenganciri-ciribentukbulat,diameter2-3mm,warnahiiaudengankilaplogamdanbintikbiru 52

kehiiauanditengahnya.DipilihkolonispesiIikyang terpisah,diinokulasikanpadamediaNAatau%SAmiring untukdikonIirmasidenganuiibiokimiaIMVICsebagai berikut : O Uii Indol SatusengkelitbiakanNAatau%SAmiring diinokulasikanpadamediaTrvptonerothdan diinkubasipadasuhu35-37Cselama24-48iam.Ke dalambiakantersebutditambahkanbeberapatetes pereaksiIndol(Kovac`s)dandikocok,didiamkan selama10menit.Jikaterbentukcincinberwarna merahcherrvdipermukaanbiakanmenuniukkan reaksi Indol positiI. O Uii Metil Merah Satu sengkelitbiakanNAmiringdiinokulasikanpada mediaMR-VPdandiinkubasipadasuhu35-37C selama24-48iam.Kedalambiakantersebut ditambahkan 5 tetes larutan metil merah dan dikocok. Biakan yang kemudian berwarna merahmenuniukkan reaksi positiI O Uii Voges Proskauer Satu sengkelitbiakanNAmiringdiinokulasikanpada mediaMR-VPdandiinkubasipadasuhu35-37C selam24-48iam.Kedalambiakantersebut ditambahkan0,6mLlarutanalIa-naItoldan0,2mL larutanKOH40,dikocokdandibiarkanbeberapa menit.Biakanyangberwarnamerahmudahingga merahmenyalamenuniukkan reaksi positiI, bila tidak demikian berarti negatiI O Uii Sitrat SatusengkelitbiakanNAmiringdiinokulasikkan padamediaSCAdiinkubasipadasuhu35-37C selama24-48iam.Perubahanwarnabiakan 53

menuniukkanreaksipositiI,bilabiakantetap berwarna hiiau berarti negatiI. Interpretasi Hasil EscherichiacolidinyatakanpositiIiikahasiluiibiokimia adalah sebagai berikut :Indol: positiI () Metil Merah: positiI () Voges Proskauer: negatiI (-) Sitrat: negatiI (-) Pernyataan Hasil AngkaEcoliditetapkanberdasarkanpersentasedari10 kolonispesiIikyangdinyatakanpositiIsebagai Escherichia coli. Contoh : Darihasilperhitungandiperoleh78kolonipada pengenceran 10-2. Bila dari 10 koloni spesiIik yang dipilih setelahdikonIirmasiternyatahanya8koloniyangpositiI sebagaiEscherichiacoli,makaangkaEscherichiacoli dari sampel yang diuii adalah : 8/10 x 78 x102 62,4 x 102 koloni 62 x 102 koloni Jadi,AngkaEscherichiacoli62x102kolonipergram atau per mL sampel. D. UjiAngkaStaphvlococcusaureusdalamMakanandan Minuman Ruang Lingkup MetodeinidigunakanuntukmenetapkanStaphvlococcus aureus angka dalam makanan dan minuman. Prinsip PertumbuhanStaphvlococcusaureuspadamedialempengyangsesuai,mereduksikaliumtelurit,menghidrolisis kuning telur dan mengkoagulasi plasma. 54

Pereaksi khusus 1. Mediaaird!arkerAgarEggYolkTellurite(!A-EY). rainHeartInfusionroth(HI).uffered!eptone Water (!W). Trvpticase Sov Agar (%SA)2. Pereaksi ggolk%ellurite(5emulsikuningtelurdalam NaCl 1 :1 1 kalium telurite 1), koagulase plasma kelinci dengan D%A 3. Mikroba baku Staphvlococcus aureus A%CC 25923 Peralatan khusus Stomacherataublender,pipetukurmulutlebar,batang gelas bengkok, alat hitung koloni Prosedur Secaraaseptikditimbang25gcuplikanataudipipet25mL,dimasukkankedalamkantungstomacherdan ditambahkan225mLBPWataudilakukanhomogenisasi sampel sesuai prosedur cara homogenisasi. Dihomogenkan denganmenggunakanstomacherselama30detikhingga diperoleh suspensiyang homogen dengan pengenceran10-1. Disiapkan dua tabung yang masing-masing telah diisi dengan9mLBPW.Dipipet1mLdaripengenceran10-1. Dibuatpengenceranberikutnyahingga10-3.Disiapkan3 cawan berisi BPA- (triplo) untuk setiap pengenceran, dandarisetiappengencerandipipet0,3mL;0,3mLdan 0,4mLkelempengmediaBPA-.Segeradisebar ratakandenganmenggunakanbatanggelasbengkok. Apabilainokulumbelumterserapsemuaolehagar, biarkancawandenganposisikeatasdidalaminkubator selama10-60menit,kemudianinkubasicawandengan posisi dibalik pada suhu 35C selama 45-48 iam. Pilih dan hitungcawanyangmengandung20-200koloniterduga Saureus.KoloniSaureusadalahbulat,halus,konveks, 55

lembab,diameter2-3mm,berwarnaabu-abukehitaman, memucat di tepi koloni dan apabila dicuplik dengan iarum ose, koloni tampak seperti mentega sampai lengket. KonIirmasiDipilih10kolonispesiIikyangdidugaSaureusdaritiga cawanterhitung,masing-masingdiinokulasikankeagar miring%SA,diinkubasipadasuhu35Cselama18-24 iam.Diinokulasikan1sengkelitkedalamtabungreaksi kecilberisi0,2-0,3mLBHIB,inkubasikanpadasuhu35Cselama18-24iam.Ditambahkan0,5mLplasma kelincidandiadukmerata,diinkubasi 30C selama 6 iam. Diamatiteriadinyakoagulasiplasmakelincidalamsetiap tabungdenganmembalikkantabung,apabilamediatetap ditempatnyaberartidipertimbangkanpositiISaureus. LakukanpewarnaanGramuntukkoloniterdugadan kontrol positiI Saureus. Perhitungan Angka Saureus dinyatakan berdasarkanpersentasekoloni spesiIikyangtelahdikonIirmasisebagaiSaureus (koagulasi positiI) dikalikan iumlah koloni dari tiga cawan (triplo) dan Iaktor pengenceran. Angka Saureus :A 10 A : Koloni spesiIik Saureus (koagulasi positiI) B : iumlah koloni terduga Saureus dari tiga cawan (triplo) C : Iaktor pengenceran. Contoh ; PerhitungankoloniterdugaSaureuspadapengenceran 10-2(C)adalah90(B),dandari10koloniyang dikonIirmasi ternyata 9 positiI (A) sebagai S aureus maka angka Saureus per gram atau per mL sampel adalah : Angka Saureus :

.B.C x90 x 102 81 x102 koloni 9 10 56

E. UjiAngkaPalingMungkin(MPN)Coli1ormdalam Makanan dan Minuman. Ruang Lingkup MetodeinidigunakanuntukmenetapkanAngkaPaling Mungkin (MPN) oliform dalam makanan dan minuman. Prinsip Pertumbuhanbakterioliformsetelahcuplikan diinokulasikanpadamediacairyangsesuaidengan mengamati adanya reaksi Iermentasi dan pembentukan gas di dalam tabung Durham. Pereaksi khusus Media dan pengencer!eptonDilutionFluid(PDF),Maconkevroth(MCB), rilliant Green Lactose ile roth 2 (BGLB) Peralatan khusus Stomacherataublender,pipetukurmulutukuran1mL,5 mL, 10 mL,tabung reaksi dilengkapi tabung Durham. Prosedur Disiapkan2tabungreaksimasing-masingberisi9mL PDF.Darihasilhomogenisasipadapenyiapansampel dipipet1mLpengenceran10-1kedalamtabungPDF pertamahinggadiperolehsuspensidenganpengenceran 10-2dandikocoksampaihomogen.Selaniutnyadibuat pengenceran 10-3. 1. Uii Praduga (!resumptive test) Untuksetiappengencerandisiapkan3tabungreaksi berisi9mLMCByangdilengkapi tabung Durham.Ke dalam tiap tabungdarimasing-masingseridimasukkan 1 mL suspensi pengenceran. Diinkubasi pada suhu 37C selama24-48iam.Setelah24iamdicatatdandiamati adanyagasyangterbentukdalamtabung.Kemudian inkubasidilaniutkanhingga48iamdandicatat tabung-tabung yang menuniukkan uii positiI. 57

2. Uii Penegasan (onfirmative test) Biakandaritabungyangmenuniukkanuiipraduga positiIdipindahkan1sengkelitkedalamtabungreaksi berisi10mLBGLByangtelahdilengkapitabung DurhamSeluruhtabungdiinkubasipadasuhu37C selama24-48iam.Dilakukanpengamatanadanya pembentukan gas. Pernyataan Hasil JumlahtabungyangpositiIgasdicatatdandiruiukke tabelMPN.AngkayangdiperolehpadatabelMPN menyatakaniumlahbakterioliformdalamtiapgram atau tiap mL sampel yang diuii. F. UjiAngkaPalingMungkin(MPN)Coli1ormDalamAir Minum Ruang Lingkup MetodeinidigunakanuntukmendapatkanAngka PalingMungkin(MPN)oliformdalamairminum yang dikemas. Prinsip Pertumbuhanbakterioliformsetelahcuplikan dinokulasikanpadamediacairyangsesuaiyang ditandaidenganadanyareaksiIermentasidan pembentukan gas didalam tabung Durham Pereaksi Khusus Mac onkev roth (M). rillian Green Lactose ile roth 2 (BGLB) Peralatan Khusus %abung reaksi dilengkapi dengan tabung Durham Prosedur Menggunakan metode MPN 5 tabung 1. Uii Praduga (!resumptive test) Disiapkan5buahtabungmasing-masingberisi10 mLmediaMCBkonsentrasigandadan10tabung 58

masing-masingberisi5mLMCBkonsentrasi tunggal.Sampaiairdikocoksebanyak25kali.Ke dalam5buahtabungMCBkonsentrasiganda masing-masingdiinokulasidengan10mLsampel dan kedalam 5 tabung konsentrasi tunggal lainnya diinokulasidengan0,1mLsampel.Semuatabung MCBdinkubasipadasuhu35-37oCselama24-48 iam.Diamatiperubahanwarnatuknyagaspada setiap tabung. 2. Uii Penegasan (onfirmative test) Disiapkantabung-tabungdengantabungDurham yang di isi 10 mL media BGLB. Dari setiap tabung yangmenuniukangaspositiIpadauiipraduga, dikocokmasing-masingdiambil1sengkelit kemudiandiinokulasikankedalamtabungBGLB. Kemudiandiinkubasipadasuhu35-37oCselama 24-48iam.Diamatiterbentuknyagaspadasetiaptabung. Jumlah tabung yang positiI gas dicatat dan hasilnyadiruiukke%abelMPN(II).Angkayang diperolehdaritabelmenuniukanMPNoliform per 100 mL sampel air yang diuii. G. Uji AngkaPalingMungkin(MPN) Escherichia coli dalam Makanan dan Minuman Ruang Lingkup MetodeinidigunakanuntukmenetapkanAngkaPaling Mungkin(MPN)Escherichiacolidalammakanandan minuman. Prinsip PertumbuhankolonibakteriEcolisetelahcuplikan diinokulasikanpadamediacairyangsesuai,dengan mengamatiadanyareaksiIermentasidanpembentukan gasdidalamtabungDurham,dilaniutkandengan isolasi dan identiIikasi E coli 59

Pereaksi Khusus 1. Media dan Pengencer !eptonDilutionFluid(PDF),Maconkevroth (MCB),Escherichiacoliroth(CB),Eosin MethvlenlueAgar(MBA),Trvptoneroth. SimmonsitrateAgar(SCA),MR-'!Medium. NutrientAgar(NA)atauTrvpticaseSovAgar (%SA). 2. Pereaksi LarutanKovac`s,larutanmetilmerah,larutanalIa-naItol, larutan KOH 40. 3. Mikroba Baku Escherichia coli A%CC 25922 Peralatan Khusus Pipet ukur mulut lebar ukuran 25 mL, tabung reaksi dan tabung Durham Prosedur Dengancaraaseptik,ditimbang25gsampelkemudian ditambahkan225mLPDF,dikocokhomogenhingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1. Disiapkan 2tabungreaksimasing-masingberisi9mLPDF.Dari hasilhomogenisasipadapenyiapansampeldipipet1 mLpengenceran10-1 kedalamtabungPDFpertama hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-2 dan dikocokhinggahomogen.Dibuatpengenceran selaniutnya hingga 10-3. 1. Uii Praduga Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi berisi9mLMCByangdilengkapi tabungDurham Kedalamtiaptabungdarimasing-masingseri dimasukan1mLsuspensipengenceran.Diinkubasi padasuhu35-37oCselama24-48iam.Setelah24 iamdicatatdandiamatiperubahanwarnabiakan danadanyagasyangterbentukdidalamtiap 60

tabung. Kemudian diinkubasi dilaniutkan hingga 48 iamdandicatattabung-tabungyangmenuniukan gas positiI. 2. Uii Penegasan Biakandaritabungyangmenuniukanuiipraduga positiIdipindahkan1sengkelitkedalamtabung reaksi berisi 10 mL E roth yang telah dilengkapi dengantabungDurhamSeluruhtabungdiinkubasi pada suhu 44 0,5oC selama 24-48 iam. Dilakukan pengamatan terhadap pembentukan gas. Dari biakan ErothyangpositiI,masing-masing diinokulasikanpadalempengmediaMBA, diinkubasipadasuhu35-37oCselama24iam, diamati koloni spesiIik yang tumbuh. Dipilih koloni spesiIikyangtumbuhpadabiakanMBA, diinokulasikanpadamediaNAmiring, diinkkubasikanpadasuhu35-37oCselama24-48 iam dilaniutkan dengan uii IMVIC. a. Uii Indol DaribiakanNAmiringdiinokulasikanpada media Trvptone roth, diinkubasi pada 35-37oC selama24iam,tambahkan0,2-0,3mLlarutan Kovac`suntuktiapbiakandankocok,diamati setelah 10 menit. b. Uii Metil Merah DaribiakanNAmiringdiinokulasikanpada mediaMR-VPdiinkubasipadasuhu35-37oC selama48iam,kemudianditambahkan5tetes larutan metil merah pada tiap tabung biakan dan dikocok. Diamati perubahan warna biakan. c. Uii Voges Proskauer DaribiakanNAmiringdiinokulasikanpada suhu 35-37oC selama 48 iam. Pada 1 mL biakan 0,6mLlarutanalIa-naItoldan0,2mLlarutan 61

kaliumhidroksid40dikocokhomogen. Diamati perubahan warna biakan. d. Uii Sitrat DaribiakanNAmiringdiinokulasikanpada mediaSimmonsitrateAgar,diinkubasipada suhu35-37oCselama48iam,diamati pertumbuhan warna biakan. Pernyataan Hasil 1. UiipradugadinyatakanpositiIbila,padabiakan MCBteriadiperubahanwarnabiakandariungu meniadikuningdanberbentukgasdalamtabung Durham 2. UiipenegasandinyatakanpositiIbila,padabiakan E roth terbentuk gas di dalam tabung Durham 3. UiiIndoldinyatakanpositiIbila,terbentukcincin warna merah cherrv pada permukaan biakan. 4. UiiMetilMerahdinyatakanpositiIbilabiakan berubah meniadi merah. 5. UiiVogesProskauerdinyatakanpositiIbilawarna biakan meniadi merah. 6. UiiSitratdinyatakanpositiIbilawarnabiakan berubah meniadi biru. UiiEcolidinyatakanpositiIbilahasiluiiIMVIC adalah : Indol: PositiI Metil Merah: PositiI Voges-Proskauer: NegatiI Sitrat: NegatiI Bila uii penegasanmenuniukan hasil seperti tersebut di atas,makadinyatakanEscherichiacolipositiIdan nilainya diruiuk pada tabel MPN. 62

H. Uji EscherichiacolidalamMakanan.MinumandanObat Tradisional Ruang Lingkup Metodeinidigunakanuntukmenetapkanadanya bakteriEscherichiacolidalammakanandanobat tradisional. Prinsip PertumbuhanEcolipadamediaselektiIyangsesuai, dilaniutkandengankonIirmasiuiibiokimia,yang menghasilkansenyawaindoldantidakdapat menggunakan sitrat sebagai sumber energi. Pereaksi Khusus 1. Media dan Pengencer !eptonDilutionFluid(PDF):pengenceruntuk makanandanminuman,Letheenroth(LB): pengencer untuk obat tradisional, Trvptic Sov roth (%SB),EndoAgar.EosinMethvlenelueAgar (MBA),Trvptoneroth(%B),MR-'!Medium. Simmons itrate Agar (SCA),NutrientAgar (NA) atau Trvptic Sov Agar (%SA) 2. Pereaksi LarutanKovac`s(PereaksiIndol),larutanmetil merah,larutanalIa-naItol,larutanKalium hidroksida 40 3. Mikroba Baku Escherichia coli A%CC 25922 Peralatan Khusus Stomacher ataublender.pipetukurmulutlebarukuran 1mLdan10mL,batangkacabengkok,alathitung koloni Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dengancaraaseptikditimbang25gcuplikanke dalamkantongstomachersterilditambahkan225 63

mLPDF/LB.Dihomogenkanmenggunakan stomacher selama 30 detik. 2. Pengkayaan Dipipet10mLkedalam%SB90mL,diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 18-24 iam. 3. Isolasi Daribiakanpengkayaankemudiandigoreskan denganmenggunakansengkelitpadamediaMBA danEndo Agar diinkubasi pada 35-37oC selama 24 iamdenganposisicawandibalik.Diamatikoloni spesiIikyangtumbuhpadaMBAdenganciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hiiau dengan kilaplogamdanbintikbirukehiiauanditengahnya, danpadaEndoAgardenganciri-cirikolonibulat, diameter2-3mm,warnamerahkeunguandengan kilap logam. 4. IdentiIikasi dan KonIirmasi DipilihduaataulebihkolonispesiIikpadaMBA danEndoAgardiinokulasikanpadaNAatau%SA miring,kemudiandiinkubasipadasuhu35-37oC selama18-24iam.DariNAatau%SAmiring dilaniutkan dengan uii IMVIC sebagai berikut : a. Uii Indol SatusengkelitbiakanNAatau%SAmiring diinokulasikanpadamediaTrvptonerothdan diinkubasipadasuhu35-37oCselama24-48 iam.Kedalambiakanditambahkan1mL pereaksiIndol(Kovac`s)dikocokdan didiamkan beberapa menit. Warna merah cherrv yangberbentukcincinpadapermukaanbiakan menuniukan reaksi indol positiI. b.Uii Metil Merah SatusengkelitbiakanNAatau%SAmiring diinokulasikanpadamediaMR-VPdan 64

diinkubasipadasuhu35-37oCselama24-48 iam.Setelahdiinkubasitambahkam5tetes larutanmetilmerahdikocokhomogendan didiamkanbeberapamenit,bilabiakanmeniadi merah menuniukan hasil uii positiI. c. Uii Voges Proskauer SatusengkelitbiakanNAdan%SAmiring diinokulasikanpadamediaMR-VPdan diinkubasipadasuhu35-37oCselama24-48 iam.Setelahdiinkubasikanditambahkan3tetes larutan alIa-naItol dan 2 tetes larutan KOH 40 dikocokkemudiandidiamkanselamabeberapa menit.Jikawarnabiakanmeniadimerahmuda hinggamerahmenyalamenuniukanreaksi positiI. d. Uii Sitrat SatusengkelitbiakanNAatau%SAmiring diinokulasikan pada Simmons itrate Agar dan diinkubasipadasuhu35-37oCselama24-48 iam.Jikateriadiperubahanwarnabiakan menuniukan hasil uii positiI. Escherichia colidinyatakan positiI bila hasil uii IMVIC sebagai berikut : Indol: positiI () Metil merah: positiI () VP : negatiI (-) Sitrat: negatiI (-) Pernyataan Hasil Jikadaribiakan %SBdiperolehhasil seperti tersebutdi atas,makadapatdinyatakanterdapatbakteri Escherichia coli dalam tiap gram sampel. 65

I. UjiSalmonelladalamMakanan.MinumandanObat Tradisional Ruang Lingkup MetodeinidigunakanuntukmenetapkanadanyaSalmonelladalammakanan,minumandanobat tradisional. Prinsip Ada empat tahap untukmendeteksi adanya Salmonella. yaitu: 1. Pra-pengkayaandalammediacairnonselektiIyang diinkubasi pada 37 1oC selama 18 2 iam. 2. PengkayaandalammediacairselektiIyang diinkubasipada41,51oCselama243iam dalamRVScairdan371oCselama243iam dalam MK%%n cair. 3. InokulasidanidentiIikasidalamduamediapadat selektiI,mediaselektiIpertamadiinkubasipada371oCselama243iamdaninkubasimedia selektiIkeduadisesuaikandenganmediayang digunakan. 4. KonIirmasiterhadapidentitasSalmonelladengan uii biokimia dan serologi. Pereaksi Khusus 1. Media dan Pengencer uffered !eptone Water (BPW) : Muller Kaufmann TetrathionateNovobiocinroth(MK%%n), Rappaport'assiliadisMediumSova(RVS), ismuthGreenAgar(BGA),XvloseLvsine Desoxvcholate(XLD),TrvpticSovAgaratau NutrientAgarmiring.TripleSugarIronAgar (%SIA),&reaAgar(Cristensen),L-Lvsine DecarboxvlaseMedium.TrvptophanMediumatau 66

Trvptoneroth.MR-'!Medium.larutanNatrium klorida 0,85 Nutrient Agar (NA) semi padat. 2. Pereaksi LarutanalIa-naItol,larutanKOH40,larutan Kovac`s,cakramkertasONPG(o-nitrophenvlbeta-galactopiranoside), Salmonella antisera polivalen O, H dan Vi. 3. Mikroba baku Salmonella tvphimurium A%%C 14028 Peralatan Khusus Stomacher ataublender.pipetukurmulutlebarukuran 1mLdan10mL,inkubatoratautangasairpada37 1oC, inkubator atau tangas air pada 41,5 1oC Prosedur 1. HomogenisasiSampeldanPra-Pengkayaan NonSelektiI Dengancaraaseptikditimbang25gataudippipet 25mLcuplikankedalamkantongplastikstomachersterilditambahkan225mLBPW kemudiandihomogenkanmenggunakanstomacher selama 30 detik, dan diinkubasi pada suhu 37 1oC selama 18 2 iam. 2. Pengkayaan SelektiI Dengancaraaseptikdipipetbiakanprapengkayaan masing-masing1mLkedalam10mLMK%%n inkubasi pada suhu 37 1oC selama 24 iam 3 iam dan0,1mLkedalam10mLRVSinkubasipada suhu41,51oCselama243iam.Jagalahagar maksimum suhu inkubasi tidak melebihi 42,5oC. 3. Inokulasi dan IdentiIikasi DaribiakanMK%%ndanRVSdiinokulasikan masing-masingsebanyak1sengkelitpada permukaanBGAdanXLD,kemudiandiinkubasi 67

pada suhu 37 1oC selama 24 3 iam, koloni yang tumbuh diamati.Biakan diduga Salmonella positiI iika : PadaBGA:Kolonidaritidakberwarna,merah mudahinggamerahdantranslusenhinggakeruh dengan lingkaran merah muda sampai merah. PadaXLD:Kolonitranslusendenganbintikhitam ditengahnya,dandikelilingizonatransparan berwarna kemerahan. 4. KonIirmasi DipilihduaataulebihkolonispesiIikpadaBGA danXLD,padamedia%SA/NAmiring,kemudian diinkubasipadasuhu35-37oCselama18-24iam. DariNAatau%SAmiringdilaniutkandenganuii IMVIC sebagai berikut : 1. %SIA Inokulaikankolonitersangkadengancaratusuk dangoresanpadamedia%SIA,inkubasipada suhu371Cselama243iam.Amati perubahan warna yang teriadi. 2. Uii Urease Inokulasikankoloni tersangkapadamedia &rea Agar(Christensen)suhu371C.Amati perubahan warna biakan yang teriadi 3. Uii Dekarboksilasi Lisin InokulasikankolonitersangkapadamediaL-Lvsinedecarboxlase.diinkubasipadasuhu 371Cselama243iam.Amatiperubahan warna biakan dan kekeruhan yang teriadi. 4. Uii Voges Proskauer InokulasikankolonitersangkapadamediaMR-VPpadasuhu371Cselama243iam. %ambahkan 3 tetes larutan alIa-naItol dan 2 tetes 68

larutanKOH40.Amatiperubahanwarna biakan yang teriadi setelah 15 menit. 5. Uii Indol Inokulasikankolonitersangkapadamedia Trvptoneroth,inkubasipadasuhu371C selama243iam.%ambahkanbeberapatetes larutanKovac`s.Amatipembentukancincin merah. 6. Uii -Galaktosidase Suspensikan0,5mLNaCl0,85padabiakan NAmiringdalamtabungreaksikecilsteril. Masukkan sebuah cakram ONPG, inkubasi pada suhu 371C selama 243 iam Interpretasi Hasil %SIA:butt positiI, slant negatiI, gas positiI/negatiI Gas H2S:positiI Hidrolisis urea:negatiI Dekarboksilasi Lysine:positiI -Galaktosidase:negatiI Reaksi Voges Proskauer:negatiI Produksi indol:negatiI Persyaratan Makanandanminumantidakbolehmengandung Salmonella(negatiIper25gramatau25mL).Obat tradisional tidak boleh mengandung Salmonella (negatiI per gram atau per mL) 1. UjiStaphvlococcusaureusdalamSampelMakanan. Minuman. Kosmetik dan Obat Tradisional Ruang Lingkup Metodeinidigunakanuntukmenetapkanadanya Staphvlococcusaureusyangmasihmemilikidaya hidup dalam sampel kosmetik dan obat tradisional. 69

Prinsip PertumbuhanStaphvlococcusaureuspadamedia lempengyangsesuai,yangmereduksikaliumtelurit, menghidrolisiskuningtelur,memIermentasimanitol dan mengkoagulasi plasma Pereaksi Khusus 1. MediaLetheenroth(LB),aird!arkerAgar(BPA) emulsikuningtelur5Kaliumtelurit1, Manitol Salt Agar (MSA) emulsi kuning telur 5 kalium telurite1,'ogel-JohnsonAgar(VJA) Kalium%elurit1,TrvpticSovroth(%SB), NutrientAgar(NA)atauTrvpticSovAgar(%SA), BrainHeartInIusionBroth(BHIB),!eptone Dilution Fluid (PDF) 2. Pereaksi mulsikuningtelurdalamNaCl0,85(1:1), larutan Kalium telurit 15, plasma kelinci 3. Mikroba Baku Staphvlococcus aureus A%CC 25923 Peralatan Khusus Stomacher atau blender Prosedur 1. Homogenisasi sampel Dilakukansesuaidengancaraprosedur homogenisasi,digunakanPDFsebagaipengencer sampelmakanandanminuman,LBsebagai pengencersekaligusinaktivasipengawetuntuk sampel kosmetik dan obat tradisional. 2. Pengkayaan Dengancaraaseptikdipipet1mLsuspensidari homogenisasisampel,kedalam9mL %SB, setelah dikocokhomogendiinkubasipadasuhu35-37C selama 24 iam. 70

3. Isolasi SiapkanlempengmediaBPAdanMSAuntuk sampelmakanandanminuman,mediaVJAdan MSAuntuksampelkosmetikdanobattradisional. Daribiakanpengkayaandiambildengansengkelit untukdigoreskanpadalempengBPA/VJAdan MSA.DilakukanpulauntukkontrolpositiI Staphvlococcusaureus.Semualempengdiinkubasi pada suhu 35-37C selama 24-48 iam dengan posisi lempengdibalik.DiamatikolonispesiIikyang tumbuh dengan ciri-ciri sebagai berikut : PadaBPA:kolonicembung,warnakolonihitam mengkilat, dikelilibgi daerah keruh (opaque). PadaVJA:Kolonicembung,berwarnahitam mengkilat dan dikellilingi daerah berwarna kuning. PadaMSA:Kolonicembung,warnakuning dikelilingi daerah keruh dan media berubah meniadi kuning. 4. KonIirmasi DipilihkolonispesiIikdaribiakanBPA/VJA/MSA untukdiinokulasikanpadamediaBHIB,kemudian diinkubasipadasuhu35-37Cselama24iam dilaniutkandenganuiikoagulasi.Dipipet0,1mL biakanBHIBkedalamtabungreaksikecilsteril ditambahkan0,5mLplasmakelinci,diinkubasi pada35-37Cselama4-6iam.Diamatiadanya koagulasiplasma.Jikateriadikoagulasidinyatakan Staphvlococcus aureus positiI dalam sampel. 5. Uii mikroskopik DariNAmiringdibuatpewarnaanGram. StaphvlococcusaureusadalahGrampositiIbentuk kokus. 71

Pernyataan hasilJikadaribiakanpengkayaandiperolehhasilseperti tersebutdiatasmakadapatdinyatakanStaphvlococcus aureusadalahpositiIdalamtiapgramataumLsampel obattradisional.Untuksampelkosmetikdinyatakan dalam 0,1 g atau 0,1 mL sampel.