40

BAB IV

METODE PENELITIAN

Pendekatan penelitian

Penelitian ini menggunakan jenis eksperimental laboratorium dengan metode post test only with control dengan tujuan untuk mengetahui kadar IL-1 lambung tikus wistar yang diinduksi aspirin 200 mg/KgBB selama 3 hari.36 Penelitian ini menggunakan tikus putih strain wistar jantan, berjumlah 18 ekor, berusia 12 minggu, dipelihara di Laboratorium Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Terapi yang diberikan setelah paparan dengan diberikan ekstrak daun sirih merah 50 mg/kgBB, 100 mg/KgBB, 200 mg/KgBB dan misoprostol 400 g/KgBB selama 7 hari secara peroral.25,38,49

Tempat dan waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan pada Pebruari hingga Juli 2013, dengan pelaksanaan awal yaitu pembuatan ekstraksi daun daun sirih merah dilakukan di laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang, evaporasi ekstrak daun sirih merah dilakukan di laboratorium Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, aklimatisasi tikus dan pemberian pajanan menggunakan fasilitas laboratorium ilmu Faal di Gedung Kebidanan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, pembedahan hewan coba dan pemeriksaan kadar IL-1 dilakukan di laboratorium Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

Tabel 4.1 Rencana jadwal penelitian

Populasi dan sampel

Sampel yang digunakan adalah tikus jantan putih strain wistar (Rattus novergicus strain wistar) dengan berat 140-160 gram berusia 12 minggu, karena lambung tikus memiliki anatomi dan fisiologi yang sama dengan manusia yaitu monogastrik dan lapisan glandular yang terdiri dari sel mukus, sel parietal, sel chief dan sel. Estimasi besar sampel penelitian menggunakan rumus Faderer yaitu:(pn-1) (p-1) 15

(6n-1) (6-1) 15

6n 5 15

n 3,33

maka jumlah sampel tikus sebanyak 18 ekor dengan 6 kelompok uji yang masing-masing terdiri dari 3 ekor dan metode pembagian kelompok dengan Non Probability Sampling.

Bahan dan alat

Alat dan bahan pemeliharaan tikus

Pemeliharaan tikus dalam penelitian ini, menggunakan beberapa peralatan dan bahan antara lain: tikus, kandang tikus, pakan, botol air, sekam, timbangan, sarung tangan dan masker.

Alat dan bahan pembuatan dan evaporasi ekstraksi daun sirih merah (Piper crocatum)

Ekstraksi daun sirih merah menggunakan peralatan dan bahan, meliputi simplisia daun sirih merah, tabung enlemeyer, beker glass, gelas ukur, corong, batang pengaduk, aluminium voil, kertas saring, kertas label, sarung tangan, klip plastik, pipet , rotavapor, wadah porselen dan timbangan.

Alat dan bahan pemberian pajanan Aspirin, misoprostol dan ekstrak daun sirih merah pada tikus

Pajanan aspirin, misoprostol, dan ekstrak daun sirih merah menggunakan peralatan dan bahan, meliputi mikrotube, aspirin 200 mg/KgBB, misoprostol 400 g/KgBB, aquades, sonde, kertas label, ekstrak daun sirih merah dosis 50 mg/KgBB, 100 mg/KgBB, dan 200 mg/KgBB.

Alat dan bahan pembedahan tikus

Pembedahan tikus menggunakan peralatan dan bahan, meliputi gunting, pinset, pengait jaringan, sarung tangan, papan pembedahan dan wadah organ.

Alat dan bahan pemeriksaan kadar IL-1 Lambung

Pemeriksaan IL-1 menggunakan peralatan dan bahan, meliputi ependrof, pipet mikro, yellow tip, blue tip, vortex VELP Scientifica, inkubator, elisa reader Awereness Tech. Inc, reagen : standart, sample diluents, antibody IL-1, SA-HRP, BSA, HCL, PBS, wash buffer, sure blue TMB dan microwell.

4.5 Tahapan Penelitian

4.5.1 Aklimatiasasi Tikus

Tikus diadaptasikan dalam kandang di menggunakan fasilitas laboratorium ilmu Faal di Gedung Kebidanan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang selama 7 Minggu. Pada adaptasi tikus, dilakukan penimbangan berat badan setiap minggunya, pemberian makan sebanyak 50gr/ekor/hari dengan menggunakan makanan standart, pemberian minum ad libitum, pencahayaan menggunakan lampu hanya pada malam hari.

4.5.2 Pembuatan ekstrak daun sirih

Serbuk daun sirih merah (Piper crocatum) 30 gram dimaserasi dengan larutan 300 ml ethanol 96% selama 24 jam dan diambil filtratnya dengan penyaringan.65 Kemudian dilakukan remaserasi 3 x 24 Jam. Hasil saringan diuapkan dengan rotary vacuum evaporator pada suhu 400C dengan kecepatan putaran 70 rpm. Ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) diencerkan dengan Aquades sesuai dengan dosis yang telah ditentukan.

4.5.3 Proses perlakuan

Sampel di bagi dalam 6 perlakuan sebagai berikut:

Tabel 4.2 Pembagian kelompok penelitian

Normal

Kontrol negative

Disonde 1 ml aquades dan dilakukan pembedahan bersama kelompok perlakuan.

Perlakuan

Kontrol Positif

Puasa 24 jam dan diinduksi Aspirin (200 mg/kgBB) sebelum makan selama 3 hari tanpa terapi serta dilakukan pembedahan bersama kelompok perlakuan.

Perlakuan 1

Puasa 24 jam dan diinduksi Aspirin (200 mg/kgBB) sebelum makan selama 3 hari serta diberikan ekstrak daun sirih pada hari ke-4 dengan dosis 50 mg/kgBB/hari selama 1 minggu, kemudian dilakukan pembedahan.

Perlakuan 2

Puasa 24 jam dan diinduksi Aspirin (200 mg/kgBB) sebelum makan selama 3 hari serta diberikan ekstrak daun sirih pada hari ke-4 dengan dosis 100 mg/kgBB/hari selama 1 minggu, kemudian dilakukan pembedahan.

Perlakuan 3

Puasa 24 jam dan diinduksi Aspirin (200 mg/kgBB) sebelum makan selama 3 hari serta diberikan ekstrak daun sirih pada hari ke-4 dengan dosis 200 mg/kgBB selama 1 minggu. Kemudian dilakukan pembedahan setelah 1 minggu.

Perlakuan 4

Puasa 24 jam dan diinduksi Aspirin (200 mg/kgBB) sebelum makan selama 3 hari serta diberikan terapi misoprostol (400 g/KgBB) pada hari ke-4 selama 1 minggu 2 kali sehari. Kemudian dilakukan pembedahan setelah 1 minggu.

Teknik pembedahan Tikus

Langkah awal yang harus dilakukan adalah tikus dianestesi menggunakan eter dengan cara memasukkan tikus ke dalam wadah tertutup yang berisi kapas yang dibasahi eter, dan ditunggu selama 15 menit. Kemudian tikus dibedah dengan hati-hati. Pembedahan dilakukan pada bagian perut, tikus diletakkan dengan posisi perut di atas pada papan pembedahan. Kemudian diambil bagian lambung, diisolasi dan dipotong. lambung dibilas dengan NaCl-fisiologis 0,9%, dimasukkan dalam larutan Phospate Buffer Saline-azida (PBS-azida) pH 7,4.

Pemeriksaan kadar IL-1 Lambung

Pemeriksaan kadar IL-1 Lambung tikus dilakukan di Laboratorium faal Universitas Brawijaya. Metode yang digunakan dalam pengukuran kadar IL-1 adalah metode Elisa Indirect. Menurut Crowther, langkah-langkah pengukuran sebagai berikut:

Sebanyak 1 gram sampel jaringan lambung diambil lalu dicuci dengan Pbs, dihancurkan sampai halus. Ditambahkan cairan PMSF 1 ml: 100 mg kemudian pindahkan ke tube dicampur menggunakan Vortex selama kurang lebih 5 detik dan diinkubasi 30 menit dalam suhu 40C.Dilakukan sentrifugasi selama 20 menit dengan microcentrifuge 2000Rpm.Supernatan 5 l dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan 1:20 hingga 200l/well, dipindahkan kedalam tube dan diinkubasi pada suhu 40C semalam. Setelah itu, dicuci dalam PBS-Tween 2% sebanyak dua kali, @ 5 menit.Diblok dengan Blocking buffer (BSA 1% dalam PBS) 50L/well, Lalu diinkubasi selama 45 menit dalam suhu ruangan dan dicuci PBS-Tween 2% sebanyak dua kali, @ 5 menit.

Coating Ab Primer 50 l/well IL-1 1:1500 dalam PBS, ditutup dengan aluminium foil yang baru, diinkubasi selama 1 jam suhu ruangan dan dicuci PBS-Tween 2% sebanyak dua kali, @ 5 menit.

Coating Ab Sekunder 1:1000 dalam PBS dengan Ab sekunder yang digunakan adalah IgG Biotin Anti Mouse, ditutup dengan aluminium foil yang baru, diinkubasi selama 1 jam dalam suhu rungan dan dicuci PBS-Tween 2% sebanyak dua kali, @ 5 menit.Ditambahkan substrat SA-HRP 1:1000, diinkubasi selama 1 jam dalam suhu rungan dan dicuci PBS-Tween 2% sebanyak dua kali, @ 5 menit.Ditambahkan 100 l substrat sureblue TMB pada tiap sumur. Inkubasi selama 10-30 menit pada suhu 37C.Ditambahkan HCl 1N sebagai stop reaction dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37C. Dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.

4.6 Pengumpulan dan analisa data

Hasil pengukuran kadar IL-1 akan dikumpulkan dan dianalisa secara statistic dengan menggunakan ANOVA yang dilanjutkan dengan uji BNT (Beda Nyata Kecil), hasil dinyatakan bermakna bila p