TESIS – SK142502

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN TANAMAN OBAT TRADISIONAL BALI DAN ISOLASI SENYAWA TERPENOID DARI EKSTRAK METANOL DAUN PARE (Momordica charantia)

Luh Lian Pertiwi NRP 1414 201 038 DOSEN PEMBIMBING Prof. Dr. Taslim Ersam, MS Sri Fatmawati, M.Sc., Ph.D. PROGRAM MAGISTER BIDANG KEAHLIAN KIMIA ORGANIK JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2016

ii

ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF BALINESE MEDICINAL PLANTS AND THE ISOLATION OF TERPENOID COMPOUNDS FROM METHANOL EXTRACT OF Momordica charantia LEAVES

Luh Lian Pertiwi NRP 1414 201 038 SUPERVISOR Prof. Dr. Taslim Ersam, MS Sri Fatmawati, M.Sc., Ph.D. MAGISTER PROGRAM ORGANIC CHEMISTRY CHEMISTRY DEPARTMENT FACULTY OF MATHEMATICS AND NATURAL SCIENCES INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2016

THESIS - SK142502

iv

Aktivitas Antioksidan Tanaman Obat Tradisional Bali dan Isolasi Senyawa Terpenoiud dari Ekstrak Metanol Daun Pare (Momordica charantia)

Nama Mahasiswa : Luh Lian Pertiwi NRP : 1414 201 038 Pembimbing : Prof. Dr. Taslim Ersam, MS

Sri Fatmawati, M.Sc. Ph. D

ABSTRAK

Masyarakat Bali sejak jaman dahulu memiliki tradisi pengobatan yang disebut “Usadha”. Usadha memberikan banyak informasi mengenai tanaman obat yang dapat digunakan pada berbagai macam jenis penyakit. Dari ketigabelas sampel yang diuji Pare (Momordica charantia) dipilih sebagai sampel pada penelitian ini berdasarkan aktivitas antioksidan dan penelusuran literatur. Antioksidan dapat menurunkan kondisi stress oksidatif yang menyebabkan kerusakan sel, jaringan atau organ. Stess oksidatif dapat memicu penyakit- penyakit degeneratif seperti diabetes, kanker, jatung dan penuaan. Senyawa triterpenoid 3,7,23-trihidroksid-5,24-dien-19-al (Momordicine I) (1) dan 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5,23-dien-19-al (2) telah diisolasi dari ekstrak metanol daun pare. Ekstrak metanol menunjukkan aktivitas antioksidan dengan IC50 = 27,58 μg/mL untuk radikal kation ABTS (2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid). Senyawa momordicine I menunjukkan penghambatan antioksidan yang rendah yaitu 36,76±0,07% pada metode ABTS jika dibandingkan dengan asam galat (IC50 1,36 μg/mL) sebagai kontrol positif.

Kata kunci: antioksidan, Momordica charantia, tanaman obat tradisional Bali,

isolasi, ABTS

v

Antioxidant Activities of Balinese Medicinal Plants and The Isolation of Terpenoid Compounds from Methanol Extract of Momordica charantia

Leaves

By : Luh Lian Pertiwi NRP : 1414 201 038 Supervisor : Prof. Dr. Taslim Ersam, MS

Sri Fatmawati, M.Sc., Ph. D.

ABSTRACT

Balinese people from long time ago have a m edicinal tradition called “Usadha”. Usadha gives some information about medicinal plants that can be used for some of desease. Pare (Momordica charantia) was chosen from 13 traditional plants based on antioxidant activity and literature. A ntioxidant can decrease oxidative stress caused damage of cells, tussue and organ. Stess oxidative thought to make significant contribution to degeneratif desease. Triterpene compound 3,7,23-trihydroxy-5,24-dien-19-al (Momordicine I) (1) dan 3β,7β-dihydroxy-25-methoxy-cucurbita-5,23-dien-19-al (2) was isolated from methanol extract of M. charantia leaves. Methanol extract shows antioxidant activity in ABTS (2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) IC50 27.58 μg/ mL. Compound 3,7,23-trihydroxy-5,24-dien-19-al (1) showed lower inhibition in ABTS 36,76±0,07% compared with gallic acid (IC50 1.34 μg/mL) as positive control.

Keywords: antioxidant, Momordica charantia, traditional herbal plant Bali, isolation, ABTS

vi

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang selalu melimpahkan

rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan dengan baik

naskah tesis yang berjudul “Aktivitas Antioksidan Tanaman Obat Tradisional

Bali dan Isolasi Senyawa Terpenoid dari Ekstrak Metanol Daun Pare

(Momordica charantia)”. Tulisan ini tidak akan terwujud tanpa bantuan,

dukungan, doa, serta dorongan semangat dari semua pihak, untuk itu penulis

sangat berterimakasih kepada:

1. Prof. Dr. Taslim Ersam, MS, selaku dosen pembimbing I dan Kepala

Laboratorium Kimia Bahan Alam dan Sintesis atas bimbingan dan juga

fasilitas penelitian sehingga pengerjaan tesis berjalan dengan lancar.

2. Sri Fatmawati, M.Sc., Ph.D. selaku dosen pembimbing II, atas semua

pengarahan, masukan, dan ilmu yang diberikan selama proses pengerjaan

tesis ini.

3. Prof. Mardi Santoso, Ph.D., Suprapto, M.Si., Ph.D., dan Dra. Ratna Ediati,

MS., Ph.D. selaku dosen penguji.

4. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Kementrian Pusat Teknologi dan

Pendidikan Tinggi atas bantuan dana penelitian yang telah diberikan.

5. Bapak Edi dari UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi

atas bantuan dalam mengidentifikasi tanaman.

6. Prof. Dr Yana M. Syah dan Elvira Hermawati, M.Si. dari Jurusan Kimia

ITB yang telah membantu dalam melakukan analisis menggunakan

spectrometer NMR.

7. Erfan Rofianto dari Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia ITS yang

telah membantu dalam melakukan analisis menggunakan spectrometer

inframerah.

8. Bapak dan Ibu dosen yang telah mendidik dan menginspirasi penulis

selama menempuh studi dikampus perjuangan ini.

9. Ibu, Ayah, adik beserta keluarga besar, atas dukungan, motivasi, kasih

sayang serta doa yang selalu menyertai penulis dalam penyelesaian tesis

ini.

vii

10. Teman- teman mahasiswa program magister Jurusan Kimia FMIPA dan

rekan seperjuangan Laboratorium Kimia Bahan Alam dan Sintesis yang

telah menemani penulis dalam pengerjaan tesis ini dan semangat yang

telah diberikan.

11. Semua pihak yang mendukung terlaksananya penulisan naskah proposal

ini.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa naskah tesis ini tidak lepas dari

kekurangan, maka dari itu penulis terbuka terhadap saran yang membangun.

Semoga naskah tesis ini memberikan manfaat bagi pembaca.

Surabaya, Juli 2016

Penulis

viii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ......................................................................................................vi

DAFTAR ISI .................................................................................................................. viii

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ........................................................................................................... xii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ......................................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian........................................................................................... 3

1.4 Manfaat ......................................................................................................... 3

BAB II KAJIAN PUSTAKA ............................................................................................. 5

2.1 Tanaman Obat Tradisional Bali ..................................................................... 5

2.1.2 Centella asiatica (Daun Pegagan) ....................................................... 11

2.1.3 Euphorbia hirta (Patikan Kebo) .......................................................... 11

2.1.4 Pluchea indica (Daun Beluntas) .......................................................... 13

2.1.5 Physalis angulata (Daun Ciplukan) .................................................... 14

2.1.6 Gynura segetum (Daun Dewa) ............................................................ 15

2.1.7 Gynura procumbens (Daun Sambung nyawa) ..................................... 16

2.1.8 Paederia foetida (Daun Ksimbukan) ................................................... 17

2.1.9 Celosia argentea (Daun Barococo) ..................................................... 18

2.1.10 Ocimum tenuiflorum (Daun Tulasi) ................................................... 19

2.1.11 Gigantochloa apus (Daun Bambu tali) .............................................. 20

2.1.12 Piper crocatum (Daun Sirih merah) .................................................. 20

2.1.13 Cymbopogon nardus (Daun Serai merah) ......................................... 21

2.2 Tinjauan Antioksidan .................................................................................. 22

2.3 Metode Pemisahan ...................................................................................... 24

2.3.1 Ekstaksi ............................................................................................... 24

2.3.2 Kromatografi ....................................................................................... 25

2.4 Metode Pemurnian ...................................................................................... 27

2.4.1 Kristalisasi .......................................................................................... 27

2.4.2 Uji titik leleh ....................................................................................... 28

2.5 Penentuan Struktur ...................................................................................... 28

2.5.1 Spektrofotometri Ultra Violet ............................................................. 28

2.5.2 Spektrofotometri Inframerah ............................................................... 28

ix

2.5.3 Spektrofotometri Resonansi Magnet Inti ............................................. 29

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................................ 33

3.1 Alat dan Bahan ............................................................................................ 33

3.1.1 Alat ..................................................................................................... 33

3.1.2 Bahan .................................................................................................. 33

3.2 Prosedur Penelitian...................................................................................... 34

3.2.1 Persiapan Uji Pendahuluan Skrining Antioksidan ............................... 34

3.2.2 Uji Aktivitas Antioksidan ................................................................... 34

3.2.3 Ektraksi dan Isolasi ............................................................................. 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 39

4.1 Skrining Antioksidan .................................................................................. 39

4.2 Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Daun Pare ............................................ 41

4.2.1 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pare dengan Metode DPPH ....... 43

4.2.2 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pare dengan Metode ABTS ....... 44

4.3 Isolasi Senyawa Ekstrak Metanol dari Daun Pare ....................................... 46

4.3.1 Ekstraksi ............................................................................................. 46

4.3.2 Fraksinasi Ekstrak Metanol Daun Pare ............................................... 46

4.3.3 Fraksinasi Fraksi R dan Isolasi Senyawa R6 ....................................... 49

4.3.4 Fraksinasi Fraksi R5 dan Isolasi Senyawa R5d ................................... 53

4.4 Penentuan Struktur ...................................................................................... 56

4.4.1 Penentuan Struktur Senyawa R6b ....................................................... 56

4.4.2 Penentuan Struktur Senyawa R5d ....................................................... 59

4.5 Aktivitas Biologis Senyawa yang telah diisolasi ......................................... 67

4.5.1 Aktivitas Antioksidan ......................................................................... 67

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 71

5.1 Kesimpulan ................................................................................................. 71

5.2 Saran ........................................................................................................... 71

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 73

LAMPIRAN A: SKEMA KERJA .................................................................................... 81

LAMPIRAN B: SPEKTRA NMR ................................................................................... 87

x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1Momordica charantia (Pare) ................................................................ 5

Gambar 2.2 Centella asiatica (Daun Pegagan) ..................................................... 11

Gambar 2.3 Euphorbia hirta (Daun Patikan Kebo) .............................................. 12

Gambar 2.4 Pluchea indica (Daun Beluntas) ........................................................ 13

Gambar 2.5 Physalis angulata (Daun Ciplukan)................................................... 14

Gambar 2.6 Gynura segetum (Daun Dewa) .......................................................... 15

Gambar 2.7 Gynura procumbens (Daun Sambung Nyawa) .................................. 16

Gambar 2.8 Paederia foetida (Daun Ksimbukan) ................................................. 17

Gambar 2.9 Celosia argenta (Daun Barococo) ..................................................... 18

Gambar 2.10 Ocimum tenuiflorum (Daun Tulasi) ................................................. 19

Gambar 2.11 Gigantochloa apus (Daun Bambu tali) ............................................ 20

Gambar 2.12 Piper crocatum (Daun Sirih merah) ................................................ 21

Gambar 2.13 Cymbopogon nardus (Daun serai merah) ........................................ 22

Gambar 2.14 Reaksi antara DPPH (24) dan Antioksidan ..................................... 23

Gambar 2.15 Reaksi antara ABTS (26) dengan Antioksidan ............................... 24

Gambar 4.1 Hasil Skrining Antioksidan 13 Daun Obat Tradisional Bali………..39

Gambar 4.2 Kromatogram empat ekstrak daun pare ............................................. 42

Gambar 4.3 Reaksi antara Radikal Kation DPPH (24) dan Asam Galat ............... 42

Gambar 4.4 Reaksi antara Radikal Kation ABTS (26) dan Asam Galat ............... 43

Gambar 4.5 Penghambatan radikal kation ABTS (26) oleh ekstrak daun M.

charantia ........................................................................................... 44

Gambar 4.6 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS (26) Ekstrak etil

asetat ................................................................................................. 45

Gambar 4.7 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS (26) Ekstrak Metanol

Daun M. charantia ............................................................................ 45

Gambar 4.8 Kromatogram Monitoring KLT hasil KCV ke-1 etil asetat:n-heksana

80% ................................................................................................... 47

Gambar 4.9 Kromatogram Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-1 ............................. 48

xi

Gambar 4.10 Kromatogram Monitoring KLT hasil KCV ke-2 dengan eluen etil

asetat: n-heksana 50% .................................................................... 49

Gambar 4.11 Kromatogram KLT Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-2 .................. 50

Gambar 4.12 Kromatogram Hasil KCV ke-3(a) dan Kromatogram KLT fraksi

Gabungan fraksi 41-53 (b) ............................................................. 51

Gambar 4.13 Kromatogram KLT Tiga Eluen (a) dan Kromatogram KLT 2D (b)

Senyawa R6b .................................................................................. 52

Gambar 4.14 Kromatogram Monitoring KLT Hasil KCV ke-3 dengan eluen etil

asetat: n-heksana 50% .................................................................... 53

Gambar 4.15 Kromatogram KLT Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-4 .................. 54

Gambar 4.16 Kromatogram KLT Hasil KKG Senyawa R5d dengan eluen etil

asetat: n-heksana 60% .................................................................... 55

Gambar 4.17 Kromatogram KLT Tiga Eluen (a) dan Kromatogram KLT 2D (b)

Senyawa R5d .................................................................................. 55

Gambar 4. 18 Spektrum Inframerah (IR) Senyawa R6b ....................................... 56

Gambar 4.19 Struktur 3,7,23-trihidroksi-kukurbita-5,24-dien-19-al dengan nama

lain Momordicine I ......................................................................... 59

Gambar 4.20 Spektrum Inframerah (IR) senyawa R5d ........................................ 60

Gambar 4.21 Perbandingan struktur senyawa R6b dengan senyawa R5d ............ 62

Gambar 4.22 Struktur senyawa 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-

19-al ................................................................................................ 62

Gambar 4.23 Korelasi Parsial 1 Senyawa R5d ..................................................... 65

Gambar 4.24 Korelasi Parsial 2 Senyawa R5d ..................................................... 66

Gambar 4.25 Korelasi Parsial 3 Senyawa R5d ..................................................... 66

Gambar 4.26 Korelasi HMBC senyawa R5d (2) .................................................. 67

Gambar 4. 27 Aktivitas Penghambatan Radikal DPPH dari Senyawa Momordicine

I (R6b), Fraksi R dan Asam galat (kontrol positif). ........................ 68

Gambar 4. 28 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS dari Senyawa

Momordicine I (R6b), Fraksi R dan Asam galat (Kontrol positif) . 69

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1Pergeseran Kimia 13C-NMR ................................................................... 30

Tabel 2.2 Pergeseran Kimia 1H-NMR ................................................................... 31

Tabel 4.1 Perbandingan Aktivitas Antioksidan Dari 5 Tumbuhan………………40

Tabel 4.2 Pengelompokan Fraksi Hasil Pemisahan KCV ke-1 ............................. 48

Tabel 4.3 Penggabungan Fraksi Hasil Fraksinasi KCV ke-2 ................................ 49

Tabel 4.4 Pengelompokan Fraksi Hasil KCV ke-3 ............................................... 51

Tabel 4.5 Penggabungan Fraksi Hasil Fraksinasi KCV ke-3 ................................ 54

Tabel 4.6 Perbandingan Data 1H-NMR dan 13C-NMR Senyawa R6 dengan

Momordicine I (3,7,23-trihidroksi-kukurbita-5,24-dien-19-al) ........... .58

Tabel 4.7 Perbandingan data senyawa R5d (2) dengan senyawa R6b (1) ............. 61

Tabel 4.8 Perbandingan 13C-NMR Senyawa R5d dengan Senyawa 3β,7β-

dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al ................................ 63

Tabel 4.9 Data C-NMR, HMQC dan HMBC senyawa R5d ................................. 64

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Peningkatan radikal bebas dalam tubuh dapat memicu terjadinya stress

oksidatif. Stress oksidatif merupakan suatu keadaan di dalam tubuh yang terjadi

akibat ketidakseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas. Hal tersebut

mengakibatkan senyawa antioksidan tidak dapat bekerja secara maksimal untuk

mengatasi radikal bebas. Radikal bebas ini dapat menyerang membran sel melalui

reaksi oksidasi asam lemak tak jenuh yang mengakibatkan penurunan fluiditas

membran, sehingga merusak struktur dan fungsi membran (Tandon et al., 2004).

Banyaknya radikal bebas dalam tubuh menyebabkan penyakit degeneratif,

diantaranya diabetes, jantung koroner, kanker serta penuaan. Pencegahan penyakit

tersebut dapat menggunakan terapi senyawa antioksidan. Antioksidan merupakan

suatu senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah terjadinya

reaksi oksidasi. Terbentuknya radikal bebas dapat dicegah oleh antioksidan

(Tapan, 2005). B erdasarkan sumbernya, senyawa antioksidan dikelompokkan

menjadi dua jenis, yaitu senyawa antioksidan alami dan sintesis. Senyawa

antioksidan sintesis mempunyai efektivitas yang tinggi, namun belum tentu aman

bagi kesehatan. Antioksidan alami didapatkan dengan memanfaatkan senyawa

bahan alam yang terkandung dalam tumbuhan (Newman, 2000). Beberapa sumber

antioksidan alami diantaranya vitamin C (asam askorbat), vitamin E (tokoferol),

vitamin A (karotenoid), beberapa polifenol meliputi flavonoid, antosianin, dan

likopen.

Keanekaragaman tumbuhan di Indonesia merupakan sumber senyawa-

senyawa bahan alam yang dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan. Pulau Bali

merupakan bagian dari pulau-pulau di Indonesia yang memiliki kearifan lokal

yang sangat kuat. Bali adalah daerah tujuan wisata yang sudah dikenal dunia sejak

tahun 1970. Sejak saat itu banyak wisatawan asing maupun wisatawan lokal

2

datang ke Bali untuk menikmati kekayaan, keindahan alam dan keunikan

budayanya. Salah satu hal yang menarik adalah keindahan alamnya. Potensi hasil

alam telah dimanfaatkan dalam bentuk spa dan berbagai puri (rumah) pengobatan.

Masyarakat Bali dalam keseharianya masih memanfaatkan tumbuhan sebagai

sarana penyembuhan penyakit. Pemanfaatan tumbuhan sebagai media obat telah

diwariskan secara turun-temurun sebagai tradisi pengobatan yang biasa disebut

dengan “Usadha”. Usadha adalah ilmu pengobatan tradisional Bali, yang sumber

ajarannya terdapat pada Lontar. Lontar adalah kitab yang menjadi sumber

pengobatan tradisional Bali. Salah satu lontar yang terkenal adalah Lontar

Rukmini Tatwa, yang mengandung sistem pengobatan, bahan obat dan cara

pengobatan tradisional di Bali (Tengah, 1995).

Keanekaragaman tanaman obat di Bali merupakan sumber senyawa-

senyawa bahan alam yang dapat dimanfaatkan dalam pengobatan alternatif

khususnya pada penyakit- penyakit seperti kanker, diabetes, jatung koroner dan

stroke. Sebuah buku yang berjudul “Rahasia Pengobatan Tradisional Bali dalam

Lontar Rukmini Tatwa” telah menuliskan tentang tanaman obat di Bali serta cara

pengobatannya. Rahasia pengobatan tradisional Bali dan beberapa fakta diatas

menunjukkan perlunya mengungkap aktivitas antioksidan dari tanaman obat

tradisional Bali.

Tiga belas tanaman obat dipilih dari hasil survei dan wawancara

masyarakat di daerah Singaraja-Bali yang daunnya akan digunakan pada

penelitian ini. Ketiga belas tanaman tersebut adalah daun pegagan (Centella

asiatica), daun barokoko (Celosia argenta), daun sereh merah (Cymbopogon

nardus), daun tulasi (Ocimum tenuiflorum), daun kesimbukan (Paederia foetida),

daun patikan kebo (Euphorbia hirta), daun sirih merah (Piper crocatum), daun

beluntas (Plunchen indica), daun bamboo tali (Gigantochoa apus), daun dewa

(Gynura segetum), daun sambung nyawa (Gynura procumbens) dan daun

ciplukan (Physalis angulate). Tanaman obat tradisional Bali diskrining aktivitas

antioksidannya dengan metode DPPH (1,1-diphenil-2-picrylhydrazil) dan metode

ABTS (2,2’azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).

3

Berdasarkan hasil skrining antioksidan dan penelusuran literatur dari 13

tanaman obat tersebut maka, daun pare (Momordica charantia) yang dipilih

sebagai sampel pada penelitian ini. Kubola (2008) telah melaporkan aktivitas

antioksidan ekstrak daun pare pada DPPH IC50 sebesar 9.72 μg/mL. Uji

antioksidan ABTS pada extrak daun pare belum pernah dilaporkan. Daun pare (M.

charantia) selanjutnya dilakukan fraksinasi dan isolasi senyawa aktif yang

berpotensi sebagai senyawa antioksidan (ABTS).

1.2 Rumusan Masalah

Salah satu hal yang menarik dari Bali adalah hasil alamnya. Hasil alam

ini dimanfaatkan dalam bentuk spa dan puri/ griya/ rumah pengobatan. Sampai

saat ini penelitian tentang tanaman obat tradisional Bali masih sedikit. Bagaimana

aktivitas ekstrak metanol daun pare pada ABTS dan apakah masih ada peluang

senyawa baru dan aktif sebagai antioksidan.

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data aktivitas antioksidan dari

tanaman obat tradisional Bali. Hasil skrining menunjukkan daun pare memiliki

potensi sebagai antioksidan. Selanjutnya dilakukan isolasi dan fraksinasi untuk

memperoleh senyawa baru dan aktif sebagai antioksidan dari daun pare.

1.4 Manfaat

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan bukti ilmiah tentang

pengobatan menggunakan tanaman obat tradisional. Potensi tanaman obat Bali

dapat menjadi salah satu pengobatan alternative yang diharapkan mampu menarik

minat wisatawan. Penelitian ini juga diharapkan dapat dapat memajukan

pariwisata Bali sehingga tidak hanya dikenal dalam bidang spa namun juga dalam

pengobatan tradisionalnya. Potensi tanaman sebagai antioksidan diharapkan dapat

menjadi peluang baru sebagai antioksidan alami.

4

“halaman ini sengaja dikosongkan”

5

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Obat Tradisional Bali

2.1.1 Momordica charantia (Pare)

Momordica charantia (Pare) seperti dapat dilihat pada Gambar 2.1. P are

memiliki karakteristik pahit, banyak dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai

peluruh dahak, obat cacing, obat luka, peluruh haid, pencahar, penurun panas dan

mengobati diabetes melitus. Tanaman ini merupakan tanaman obat yang telah

dilaporkan memiliki aktivitas hypoglikemia, sitotoksik, analgesik dan antilipid

(Singh et al, 1998).

Gambar 2.1Momordica charantia (Pare)

Taksonomi tumbuhan Pare

Kingdom : Plantae

Devisio : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Dilleniidae

Ordo : Violales

Family : Cucurbitaceae

Genus : Momordica

Species : Momordica charantia L

6

Ekstrak metanol daun M. charantia kaya akan kandungan phenol dan

memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi setelah diukur dengan metode DPPH

(23) sebesar 9,72±0,25 sehingga cocok digunakan sebagai antioksidan alami

(Kubola et al, 2008). Konstituen M. charantia yang dapat memberikan effek

antidiabet yaitu triterpen, proteid, steroid, alkaloid, lipid dan senyawa fenolat

(Joseph et al 2013). Ekstrak daun M. charantia memiliki potensi sebagai

antidiabet yang berpotensi sebagai obat alternative hiperglisemia dengan

penghambatan penyerapan glukosa di usus (Mahomoodally et al, 2007). Biji M.

charantia yang berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase (Matsuur et al, 2002).

Ektrak peroksida dari M. charantia juga berpotensi sebagai inhibitor α-

glukosidase (He et al, 2014).

Senyawa- senyawa triterpenoid yang telah diisolasi dari tumbuhan pare

yaitu momordicine I (1) dan momordicine II (3) yang diisolasi dari daun (Bing et

al, 2008), asam 3β-hidroksimultiflora-8-en-17-oic (4), cucurbita-1(10)-5,22,24-

tetraen-3α-ol (5) dan 5β,19β-epoksicucurbita-6,22,24-trien-3α-ol (6) diisolasi dari

batang (Liu et al, 2010). Senyawa- senyawa triterpenoid juga telah diisolasi dan

diuji aktivitasnya sebagai antidiabetes dan antiobesitas diantaranya

momordicoside Q (7), momordicoside R ( 8), momordicoside S (9),

momordicoside T ( 10), momorcharaside B (11) dan karaviloside XI (12) yang

diisolasi dari buah (Tan et al, 2008). Senyawa triterpenoid yang telah diisolasi dan

diuji aktivitas antikanker yaitu (23E)-5β,19-epoksicucurbita-6,23,25-triene-3β-ol

(13) dan (19R, 23E)-5β,19-epoksi-19-ethoksicucurbita-6,23-diene-3β,25-diol (14)

yang telah diisolasi dari buah (Cao et al, 2011). Sterol glikosida juga diisolasi dari

buah pare yaitu 25β-isopropenylchole-5(6)-ene-3-O-β-D-glucopyranoside (15)

(Peng et al, 2012). Jia-Qing dkk (2013) telah mengisolasi senyawa dari ekstrak

etanol telah dihidrolisis yaitu cucurbita-6,22(E), 24-trien-3β-ol-19,5β-olide (16).

Li dkk (2014) t elah mengisolasi senyawa golongan triterpenoid dari daun pare

diantaranya yaitu momordicine IV, aglycone of m omordicoside I, aglycone of

momordicoside L dan karavilagenin D. Beberapa senyawa triterpenoid baru yang

diisolasi dari daun dan batang oleh Zhao dkk (2014) dilaporkan diantaranya

karavilagenin F (17), karavilosides XII (18), karavilosides XIII (19),

momordicines VI, VI, VII (20,21,22) dan kuguacin R (23).

7

HO OH

OROHC

HO

HO

COOH

HO

O

(1) R= H (2) (3) R= Glc

(5)

(4)

(6)

8

R1O

O

OH

OHOR2

R1O

OH

OHOR2

OH

R1O

O

HO

O

O

R1O

O

OHO

(7) R1= Glc, R2= H (8) R1= All, R2=

Glc

(10) R1= Glc, R2= Glc

(11) R1= Xyl, R2=

(14)

(13)

(15)

9

OOHO

HOHO

OH

HO

O

H3CO OH

OH

OCH3

HO OH

OHC

R1O

O

OR2

O OH

OHC

OR

O

H3CO

O

HO OH

OH

O

HOH

(16)

(17)

(18) R1= -COCH3. R2=Glc

(19) R1= H, R2= All

(20)

(21) R= H

(22) R=Me

(23)

10

Bioaktivitas Momordica charantia

Aktivitas antibakteri ekstrak daun M. charantia telah dilakukan secara

invitro pada beberapa bakteri diantaranya Escherichia coli, Salmonella paratyphi,

Shigella dysenterae, dan Streptomyces griseus. Ekstrak tanaman M. charantia

juga menunjukkan aktivitas antiprotozoal pada Entamoeba histolytica (Khan et al,

1998). Ekstrak buah juga telah dilaporkan oleh Yesilada et al (1999) menunjukkan

aktivitas pada organisme Helicobacterpylori dengan kisaran antara 1,95 dan 2,50

µg/m.

Zhao et al (2014) melaporkan telah melakukan uji sitotoksik sel kanker pada

senyawa momordicine IV, V, VI yang telah diisolasi dari ekstrak metanol batang

M. charantia. Hasil uji menunjukkan senyawa momordicine IV dan V

menunjukkan IC50 >40 µmol/L pada cell HL-60, SMMC-7721, A-549, MCF-7

dan SW480, sedangkan momordicine VI menunjukkan aktivitas yang lebih kecil

dengan IC50 16,2; 20,3; 20,5; 16,9; dan 14,3 µmol/L.

Uji aktivitas antioksidan dari ekstrak buah, batang, daun M. charantia telah

diuji dengan metode yaitu DPPH. Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak daun

memiliki IC50 yang lebih tinggi sebesar 9,72 ± 0,25 sedangkan batang, buah segar

dan buah matang memiliki IC50 17,8 ± 0,66 ; 11,0 ±0,76 dan 27,6 ± 0,23 (Kubola

et al, 2008). Kubola (2008) j uga melaporkan bahwa ekstrak daun menunjukkan

aktivitas antioksidan yang tinggi berdasarkan pada uji DPPH dan FRAP,

sedangkan ekstrak buah menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi pada

kapasitas total antioksidan, β-carotene-linoleate dan hidroksi radikal scavenging.

Liu et al (2010) telah melaporkan diisolasi dari ekstrak batang M. charantia.

Ketiga senyawa yang berhasil diisolasi yaitu asam 3β-hidroksimultiflora-8-en-17-

oic (3), cucurbita-1(10)-5,22,24-tetraen-3α-ol (4) dan 5β,19β-epoksicucurbita-

6,22,24-trien-3α-ol (5). Ketiga senyawa tersebut menunjukkan IC50 268,5 ±7,9 ,

352 ± 11,5 d an 458,9 ± 13,0 µM. Penghambatan Xhantine Oxidase (XO) juga

dilakukan pada ketiga senyawa tersebut dan menunjukkan IC50 142,3 ± 30,2 , 36,8

± 20,5 dan 124,9 ± 8,3 µM.

11

2.1.2 Centella asiatica (Daun Pegagan)

Gambar 2.2 Centella asiatica (Daun Pegagan)

Centella asiatica (Gambar 2.2) y ang disebut juga pegagan termasuk ke

dalam famili Umbelliferae atau Apiaceae. Masyarakat bali menyebut tanaman ini

dengan nama “daun piduh” dan banyak dimanfaatkan sebagai obat disentri,

penambah nafsu makan, lepra, luka, sipilis dan DM. Kandungan metabolit

sekunder yang terdapat pada ekstrak C. asiatica merupakan golongan triterpenoid

seperti asam asiatat, asam madekasat, glikosida, asiatikosida dan medekatikosida

(Zainol et al, 2002). Asiaticosida merupakan golongan terpenoid utama yang

terdapat pada ekstrak metanol C. asiatica yang berpotensi menangkal radikal

bebas (Padmaja et al, 2012).

Aktivitas antioksidan tertinggi pada C. asiatica terletak pada bagian daun

dan akar sebanding dengan aktivitas α-tocopherol (Zainol et al, 2002). Aktivitas

antioksidan ekstrak metanol dari C. asiatica yang diuji dengan menggunakan

metode DPPH yaitu 0,07 µ g/mL (Anand et al, 2010) sedangkan pada ekstrak

etanol persentase penghambatannya sebesar 61,2% (Pan et al, 2011). Tingginya

aktivitas antioksidan dan kadar phenol pada ekstrak C. asiatica dapat

dimanfaatkan sebagai teh herbal (Ariffin et al, 2011).

2.1.3 Euphorbia hirta (Patikan Kebo)

Euphorbia hirta yang lebih dikenal dengan “patikan kebo” yang banyak

dimanfaatkan sebagai pelancar ASI, peluruh dahak, menhentikan pendarahan,

12

pereda kejang, radang usus besar, bronchitis, asma, gangguan penglihatan dan

menstabilkan gula darah di dalam tubuh. Kandungan fitokimia pada ekstrak E.

hirta mengandung tannin, terpenoid, alkaloid, steroid, flavonoid dan senyawa

fenolat. Golongan terpenoid pada E. hirta ditemukan beberapa 24-hydroperoxy-

cycloart-25-en-3β-ol, 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol, cyloartenol, lupeol, α-

amyrin dan β-amyrin (Ragasa et al, 2013). Tanaman E. hirta dapat dilihat pada

Gambar 2.3.

Gambar 2.3 Euphorbia hirta (Daun Patikan Kebo)

Aktivitas antioksidan dan skrining fitokimia pada ekstrak metanol E. hirta

memiliki kadar fenolat yang tinggi 206,17±1,95 mg GAE/g dan aktivitas

antioksidan 0,803 µ g/mL yang diuji dengan menggunakan metode DPPH (23)

(Bazma et al, 2011). Aktivitas antioksidan yang diuji dengan metode DPPH (23)

pada beberapa variasi pelarut maka didapatkan hasil IC50 yaitu ekstrak metanol

0,58 µg/mL, ekstrak n-heksana 0,38 µg/mL dan ekstrak air 1,13 µg/mL (Ashraf et

al, 2014). Beberapa aktivitas E. hirta diantaranya sebagai antibakteri, antimikroda

yang bersifat sitotoksik (Perumal et al, 2012).

Ekstrak etanol E. hirta telah diisolasi dan ditemukan 9 senyawa diantaranya

scopoletin, scoparone, isoscopoletin, quercetin, isorhamnetin, pinocembin,

kaemferol, luteolin dan gallic acid (Yi et al, 2012).

13

2.1.4 Pluchea indica (Daun Beluntas)

Pluchea indica atau yang lebih dikenal dengan nama Beluntas cukup

popular dikalangan masyarakat untuk melancarkan haid, penurun panas, bau

mulut, bau badan, nyeri pada perut bagian bawah, peluruh kencing dan

menurunkan gula darah (Yuniarti, 2008). Komposisi tannin pada P. indica pada

keadaan segar yaitu 0,61% s edangkan pada keadaan kering sebesar 1,885%

kandungan tannin tersebut dapat menurunkan asam glutamate pada tikus

(Susetyarini, 2011). Tanaman P. indica dapat dilihat pada Gambar 2.4

Gambar 2.4 Pluchea indica (Daun Beluntas)

Aktivitas antioksidan pada ekstrak metanol yang diuji dengan metode

DPPH (24) sebesar 96 µmol TE/ gfw dan metode ABTS (26) sebesar 3,75 µmol

TE/ g fw (Andarwulan et al, 2010). Ekstrak 50% metanol dari P. indica yang di

isolasi dan diuji aktivitas penghambatannya terhadap α-glukosidase khususnya

maltase yaitu 3 ,5-di-O-caffeoylquinic acid (1166 µM), 4,5-di-O-caffeoylquinic

acid methyl ester (208 µM), 3,4,5-tri-O-caffeoylquinic acid methyl ester (2 µM),

3,4,5-tri-O-caffeoylquinic acid (13 µM) dan 1,3,4,5-tetra-O-caffeoylquinic acid

(11 µM) (Arsiningtyas et al, 2014).

Senyawa yang pertama kali diisolasi dari P. indica adalah glikosida

(Unchiyama et al, 1989). Senyawa golongan flavonoid yang terdapat pada P

indica adalah 81% que rcetin (Andarwulan et al, 2010). Ekstrak metanol dari P.

indica memperlihatkan aktivitas kolagenase sebesar 78% yang diisolasi dengan

menggunakan HPLC sehingga menghasilkan 3 senyawa (Ohtsuki et al, 2008).

14

2.1.5 Physalis angulata (Daun Ciplukan)

Physalis angulata yang biasa dikenal dengan nama “ciplukan” biasanya

dimanfaatkan oleh masyarakat untuk penyembuhan patah tulang, penguat jantung,

kseleo, nyeri perut, kencing nanas, kencing manis dan mengaktifkan fungsi

kelenjar tubuh. Tanaman ini merupakan yang biasa tumbuh di tanah- tanah

kosong seperti dipinggir selokan ataupun dilereng tepi sungai. Pada jenis P.

angulata pada umumnya ditemukan glikosida flavonoid berupa lutoelin.

Tanaman P. angulata dapat dilihat pada Gambar 2.5.

Gambar 2.5 Physalis angulata (Daun Ciplukan)

Ekstrak metanol daun P. angulata yang berupa serbuk dilarutkan dalam air

berefek antidiabetes pada pemberian jangka panjang. Beberapa penelitian

terdahulu juga menyebutkan bahwa P. angulata infusa daun dengan kadar 20%

dan 40% dapat berefek menurunkan kadar glukosa darah yang dicapai pada jam

ke 4. Sedangkan ektrak daun yang dilarutkan dalam dapat menurunkan gula darah.

Penemuan dari peneliti lain diketahui bahwa senyawa yang diisolasi dari daun

dapat menurunkan kadar glukosa darah atas dasar stimulasi produksi insulin di

pankreas sedangkan ektrak daun dapat mempengaruhi sel beta pankreas dan dapat

menyebabkan penimbunan glikogen dalam hepatosit. Ekstrak etil asetat dari P.

angulata memiliki aktivitas antikanker dan antiinflamasi (Hseu et al, 2011).

Hasil isolasi dari P. angulata telah menghasilkan 11 senyawa namun 7

diantaranya sudah pernah dilaporkan yaitu physagulins L-O, withagulatin A,

physagulin K, withaminimin, physagulin J, physagulin B, pubesenolide,

15

physagulin D sedangkan senyawa yang baru ditemukan yaitu physagulin L,

physagulin M, physagulin N dan physagulin O (He et al, 2007). Sitotoksivitas dari

11 senyawa tersebut diukur dengan human colorectal-arcinomma (HCT-116) dan

human non-cell cancer (NCI-H460) dengan menggunakan topocetan sebagai

kontrol positif. Senyawa withagulatin A dan physagulin B sedangkan physagulin

L dan physagulin M cukup aktif dibandingkan dengan yang lain.

2.1.6 Gynura segetum (Daun Dewa)

Gambar 2.6 Gynura segetum (Daun Dewa)

Gynura segetum (Gambar 2.6) yang biasa disebut juga “daun dewa”

termasuk ke dalam family tumbuhan Asteraceae. Masayarakat biasa

memanfaatkanya untuk mencegah pembekuan darah, menghentikan pendarahan,

membersihkan racun dan menjaga kadar gula dalam darah. Tumbuhan ini dikenal

kaya mengandung saponin, tannin, flavonoid dan minyak atsiri. Suharyani (2003)

melaporkan bahwa tanaman ini dapat menyembuhkan penyakit kanker, DM dan

hipertensi. Ekstrak methanol dari G. segetum memiliki aktivitas antioksidan yang

baik terkait dengan total fenolik dan flavonoid. Uji aktivitas antioksidan ekstrak

metanol dari G. segetum dengan variasi konsentrasi secara berturut- turut yaitu

100 ppm (14,6±0,4), 200 ppm (20,01±0,4), 300 ppm (25,6±1,0), 400 ppm (31,5±

0,15) dan 500 ppm (36,8±0,4) (Seow et al, 2011).

Beberapa senyawa yang telah diisolasi diantaranya triterpen, lignans,

lumicrome, cerebroside, asam fenolat (Zhu et al, 2013). Pemberian perlakuan

pada embrio choriollantoic dengan menggunakan ekstrak daun dan fraksinya

16

(100 µg/disc) memperlihatkan besarnya anti-angiogenik jika dibandingkan

dengan sramin (50µg/ disc) sebagai kontrol positif (Seow et al, 2011). Ekstrak

metanol G. segetum digunakan untuk penyembuahan kanker, inflamasi, diabetes,

hipertensi dan penyakit kulit (Seow et al, 2014). Ekstrak metanol sangat

menghambat pembentukan jaringan granuloma pada tikus dan berpotensi sebagai

anti-inflamasi yang dimediasi melalui inhibisi pro-inflamasi cytokines dan

aktivitas enzim COX-2.

2.1.7 Gynura procumbens (Daun Sambung nyawa)

Gambar 2.7 Gynura procumbens (Daun Sambung Nyawa)

Gynura procumbens dengan nama lainnya adalah “sambung nyawa” dapat

dilihat pada Gambar 2.7. Masyarakat biasa memanfaatkan tanaman ini untuk

menurunkan tekanan darah, ginjal, disentri, menghentikan. pendarahan, mengatasi

tidak datang haid dan menurunkan kadar gula dalam darah (Kaewseejan et al,

2015). Tumbuhan ini kaya dengan berbagai kandungan kimia yang sudah

diketahui antara lain alkaloida, saponin, tannin, flavonoid dan triterpenoid.

Metabolit yang terdapat dalam ektrak yang etanol 95% antara lain asam

klorogenat, asam kafeat, asam vanilat, asam p-kumarat dan asam p-hidroksi

benzoate. Hasil analisis kualitatif dengan metode KLT dapat dideteksi keberadaan

sterol, triterpen, senyawa fenolik, polifenol dan minyak atsiri.

Aktivitas antioksidan pada G. procumbens sangat baik yang diakibatkan

karena adanya fenol dan kandungan flavonoid Uji DPPH (24) pada ekstrak G.

17

procumbens dengan variasi pelarut hasilnya yaitu ekstrak metanol 93,5±1,22,

ekstrak etanol 57,21±1,51 dan ekstrak air 56,84±1,37 (Akowuah et al, 2002).

Efek antidiabetes oleh ekstrak air telah diberikan pada tikus yang sudah

diinduksi streptozotocin. Hasilnya menunjukkan adanya penurunan glukosa darah

setelah 14 hari. Ekstrak G. procumbens juga memberikan efek minimal pada β-

cell pada pankreas. Penelitian ini membuktikan ekstrak air G. procumbens dapat

diberikan untuk menurunkan glukosa darah. Ekstraksi daun G. procumbens

dengan variasi etanol: air diantaranya 95%, 75%, 50%, 25% dan 0% dengan hasil

variasi 25% adalah yang terbaik (Algariri et al, 2013). Fraksi n-butanol dari G.

procumbens mampu menurunkan kadar gula dalam darah (Akowuah et al, 2002).

2.1.8 Paederia foetida (Daun Ksimbukan)

Paederia foetida yang biasa dikenal dengan nama “ksimbukan” atau

“simbukan” biasanya secara liar di tepi hutan ataupun memang sengaja ditaman.

Tanaman ini dipercaya masyarakat mampu mengobati sakit perut, perut kembung,

disentri, masuk angin, nyeri lambung, herpes dan kencing manis. Skrining

fitokimia pada daun P. foetida terdapat saponin, tannin, phenol, flavonoid,

terpenoid, alkaloid, glikosida dan gula pereduksi (Upadhyaya, 2013). Pada P.

foetida L steroid dan antraquinon tidak terdeteksi. Tanaman P. foetida dapat

dilihat pada Gambar 2.8.

Gambar 2.8 Paederia foetida (Daun Ksimbukan)

18

Aktivitas antioksidan pada P. foetida dengan ektrak etanol memperlihatkan

penghambatan radikal bebas yang tinggi setelah diuji dengan metode DPPH (24)

dan ABTS (26). Persentase inhibisi ekstrak P. foetida uji DPPH (24) dengan

pelarut 80% e tanol yaitu 82,0%, 74,6 %, 80,3% de ngan kontrol positif asam

askorbat sebesar 88,2%. Pada ekstrak ABTS (26) dengan 80% pelarut yaitu 80%,

77,12%, 71,2%, 75,8% da n kontrol positive asam askorbat (Upadhyaya, 2013).

Beberapa aktivitas dari ekstrak etanol P. foetida yaitu antilipidemik,

antihiperglikemia dan antioksidan (Kumar et al, 2014).

Ekstrak etanol daun P. foetida memiliki aktivitas antimikroba pada Bacilus

subtilis dan Staphylococus aureus (Upadhyaya, 2013). Pemberian ekstrak P.

foetida dapat meningkatkan berat badan, insulin plasma dan dapat menurunkan

kolestrol dan gula darah (Kumar et al, 2014).

2.1.9 Celosia argentea (Daun Barococo)

Gambar 2.9 Celosia argenta (Daun Barococo)

Celosia argentea (Gambar 2.9) yang lebih dikenal dengan Barococo atau

Bayem ekor kucing biasa tumbuh di piggir jalan dekat selokan atau tanah lapang

yang terlantar. Tanaman ini biasa digunakan masyarakat untuk obat hipertensi,

sebuah penelitian menyebutkan bahwa C. argentea memiliki kadar fenol yang

tinggi yang telah diuji penghambatanya dengan menggunakan DPPH (24) dan

ABTS (26). Sejak adanya yang melaporkan jika C. argentea memiliki kadar fenol

19

yang tinggi maka dilakukan penelitian aktivitas antioksidan pada C. argentea

untuk mengetahui persentase penghambatannya. Skrining fitokimia dari ekstrak

metanol C. argentea mengandung flavonoid, saponin, triterpenoid dan senyawa

fenolat (Kumar et al, 2014).

Aktivitas antioksidan yang diukur dengan metode DPPH (24) yang

menggunakan asam askorbat sebagai standar menunjukkan adanya korelasi

dengan hasil yang ditemukan sebagai efisiensi inhibisi. Aktivitas antioksidan yang

diukur dengan menggunakan metode DPPH (24) sebesar 70,81% dan ABTS (26)

62,25 (Rub et al, 2013). Ekstrak etanol dari biji C. argentea telah diisolasi

sehingga mendapatkan 2 senyawa diantaranya Celosin I dan Celosin II (Wu et al,

2013).

2.1.10 Ocimum tenuiflorum (Daun Tulasi)

Ocimum tenuiflorum (Gambar 2.10) yang dikenal dengan nama tulasi

biasa dimanfaatkan untuk kencing manis, kencing batu dan baik untuk pencernaan.

Sebuah penelitian melaporkan bahwa O. tenuiflorum memiliki aktivitas

antioksidan yang tinggi. Beberapa senyawa yang telah ditemukan seperti asam

oleanik dan asam ursolik mengakibatkan tingginya aktivitas antioksidan terhadap

peroksidasi lemak di hati. Ekstrak O. tenuiflorum mengandung minyak atsiri yang

sangat banyak dan kaya akan senyawa fenolat dan golongan polifenol lainya

seperti flavonoid dan antosianin (Phippen dan Shimon, 2000).

Gambar 2.10 Ocimum tenuiflorum (Daun Tulasi)

20

Adanya kandungan eugenol pada ekstrak O. tenuiflorum berkontribusi

pada aktivitas antioksidannya (Dorman et al, 2000). Ekstrak air daun O.

tenuiflorum mampu menurunkan kadar gula dalam darah pada ikan yang telah

diinduksi diabetes (Arenal et al, 2012).

2.1.11 Gigantochloa apus (Daun Bambu tali)

Gigantochloa apus atau masyarakat biasa menyebutnya dengan bambu tali

yang dapat dilihat pada Gamber 2.11. Tanaman ini dimanfaatkan sebagai obat

ginjal, membersihkan paru- paru, merangsang produksi cairan tubuh, anti toxic,

kencing manis, maag dan liver. Kandungan senyawa kimia pada tumbuhan ini

diantaranya saponin, asparagine, protosarsapogenin dan beta-sitosterol.

Gambar 2.11 Gigantochloa apus (Daun Bambu tali)

Aktivitas antibakteri ekstrak etanol dan ekstrak metanol dari G. apus

memperlihatkan bahwa ekstrak metanol memberikan aktivitas yang lebih baik

pada E. coli (Mulyono et al, 2013). Senyawa bioaktif utama yang terdapat pada

kedua ekstrak etanol dan ekstrak metanol G. apus adalah asam amino.

2.1.12 Piper crocatum (Daun Sirih merah)

Piper crocatum atau yang biasa disebut sirih merah, di Bali selain

digunakan untuk persembahyangan sirih juga dimanfaatkan sebagai obat.

21

Beberapa penelitian menyebutkan kandungan pada P. crocatum adalah terpenoid,

alkaloid dan flavonoid. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol P. crocatum diuji

dengan menggunakan metode DPPH (24) dan tocopherol digunakan sebagai

kontrol positif. Ekstrak etanol memperlihatkan IC50 sebesar 85, 82 ppm dan

inhibisi dari oksidasi asam lemak sebesar 80, 40% (Alfarabi et al, 2010).

P. betle adalah salah satu tumbuhan yang terbukti secara ilmiah berkhasiat

sebagai obat antidiabetes. Sirih merah telah diketahui memiliki potensi yang sama

dengan sirih hijau (Arawbewela et al, 2006). Sebuah penelitian melaporkan P.

crocatum mampu sebagai obat diabetes (Emrizal et al, 2014). Beberapa aktivitas P.

crocatum yang telah ditemukan adalah sebagai antibakteri, memperbaiki pankreas

yang rusak dan sebagai hepatoprotektor. Potensi P. crocatum sebagai aktivitas

enzim glukosa oksidase (Laela et al, 2008). Dari penelitian tersebut diketahui

bahwa ektrak P. crocatum dengan menggunakan etanol 30% berpotensi sebagais

activator enzim glukosa oksidase. Tanaman P. crocatum dapat dilihat pada

Gambar 2.12.

Gambar 2.12 Piper crocatum (Daun Sirih merah)

2.1.13 Cymbopogon nardus (Daun Serai merah)

Cymbopogon nardus atau yang biasa disebut dengan serai merah atau serai

wangi. Tanaman ini dimanfaatkan untuk mengobati penyakit kulit, bau mulut dan

kanker. Beberapa penelitian melaporkan kandungan minyak atsiri pada C. nardus

22

memiliki aktivitas antimikroba, antifungi, antinociceptive dan neurobehavioral.

Ekstrak metanol C. nardus mampu menhambat pertumbuhan dari Aspergillus

niger (Billerbeck et al, 2001). Tanaman C. nardus dapat dilihat pada Gambar 2.13.

Gambar 2.13 Cymbopogon nardus (Daun serai merah)

Kandungan minyak atsiri pada C. nardus yang dianalisis dengan GC-MS

terdiri dari 16 m onoterpene (79,8%), 9 seswuiterpen (11,5%) d an 4 non -terpen

(1,4%) (Ali et al, 2003). C. nardus juga telah dilaporkan dapat dimanfaatkan

sebagai parfum, penurun panas, dan digunakan sebagai obat dalam masalah

menstruasi (Abena et al, 2007). Komposisi kimia, sitotoksik dan antiplasmodial

pada minyak atsiri dari C. nardus yang diteliti telah memperlihatkan

antitripanosomal (Kpoviessi et al, 2013).

2.2 Tinjauan Antioksidan

Radikal bebas adalah suatu senyawa yang mengandung satu atau lebih

elektron tidak berpasangan. Adanya elektron tidak berpasangan menyebabkan

senyawa tersebut sangat reaktif sehingga dapat menyerang elektron pada molekul

lain. Antioksidan dapat menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi

kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya

reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stress

oksidatif. Senyawa antioksidan alami pada tumbuhan umumnya adalah senyawa

fenolik yang berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin,

tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang

23

memiliki antivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, katekin dan

kalkon.

Terdapat dua metode uji antioksidan yang dapat dilakukan yaitu metode uji

DPPH (24) (1,1-diphenil-2-picrylhydrazil) dan uji metode ABTS (25) (2,2’-azino-

bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid). DPPH (24) dan ABTS (26)

merupakan senyawa radikal yang relatif stabil serta keduanya telah lazim

digunakan untuk analisis antioksidan pada bahan alam. Pada metode DPPH (24)

senyawa ini akan bereaksi dengan antioksidan yang akan mendonorkan satu

elektronya sehingga membentuk senyawa lebih stabil. DPPH (24) radikal

merupakan senyawa yang berwarna ungu yang memiliki kstabilan tinggi pada

suhu ruang biasanya digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan. Tingginya

kstabilan radikal pada DPPH (24) disebabkan karena adanya elektron bebas yang

terdelokalisasi di seluruh bagian molekul dan tidak mudah mengalami dimerisasi

(Molyneux P., 2004).

N N

O2N

O2N

NO2 NHN

O2N

O2N

NO2H

Gambar 2.14 Reaksi antara DPPH (24) dan Antioksidan

Gambar 2.14 menunjukkan reaksi penangkapan radikal DPPH (24) oleh

antioksidan yang berupa donasi proton kepada radikal. Senyawa yang

memungkinkkan mendonasikan protonya memiliki aktivitas penangkapan radikal

cukup kuat. Senyawa tersebut adalah senyawa fenol, flavonoid, tannin, senyawa

yang memiliki banyak gugus sulfida, dan alkaloid. Donasi proton menyebabkan

radikal bebas DPPH (24) (berwarna ungu) menjadi senyawa non ra dikal

(berwarna kuning). Dengan demikian aktivitas penangkapan radikal dapat

dihitung dari peluruhan radikal DPPH (24). Kadar radikal DPPH (24) yang tersisa

diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 515 nm (Munim et al,

(24) (25)

24

2003). Kelebihan metode DPPH (24) yaitu memiliki teknis yang sederhana dan

pengerjaanya relative lebih cepat sedangkan kelemahannya DPPH (24) hanya

larut dalam pelarut organik terutama alkohol sehingga tidak dapat digunakan

untuk menentukan aktivitas antioksidan hidrofilik (Prior et al, 2005).

S

N

SO3H

N N

S

N

SO3H

C2H5 C2H5

e- e-

S

NH

SO3H

N N

S

N

SO3H

C2H5 C2H5

Gambar 2.15 Reaksi antara ABTS (26) dengan Antioksidan

ABTS (26) memiliki sifat sebagai radikal kation dengan pusat nitrogen

yang memiliki karakteristik warna biru. Apabila ABTS (26) tereduksi oleh

antioksidan akan berubah menjadi bentuk nonradikal dan tidak berwarna. ABTS

(26) merupakan metode spektrometri yang digunakan untuk mengetahui aktivitas

antioksidan. Prinsip dari ABTS (26) adalah dekolorinasi radikal kation yang

diukur pada panjang gelombang 734 nm (Zurowska et al, 2012). Reaksi ABTS

(26) dengan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.15. Kontrol positif (trolox)

memiliki IC50 pada DPPH (24) sebesar 3,09±0,88 µg/mL dan IC50 pada ABTS

(26) sebesar 4,11± 1,36 µg/mL (Cos et al., 2003).

2.3 Metode Pemisahan

2.3.1 Ekstaksi

Ekstraksi adalah suatu teknik pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan

suatu senyawa dalam pelarut tertentu (Harbone J.B., 1987). Ekstraksi dibagi

menjadi dua macam, yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi padat-cair (Pavia dan

(26)

(27)

25

Kniz, 1990). Ekstraksi cair- cair atau partisi merupakan jenis ekstraksi yang

berdasarkan pada perbedaan distribusi suatu senyawa diantara dua pelarut yang

tidak saling larut (Svehla G., 1990). Ekstraksi padat-cair terbagi menjadi tiga

metode, yaitu maserasi, perkolasi, dan sokletasi. Maserasi merupakan metode

ekstraksi padat-cair dengan cara perendaman sampel dengan pelarut pada suhu

kamar. Perkolasi adalah metode ekstraksi padat-cair dengan cara mengalirkan

pelarut secara perlahan-lahan ke dalam suatu kolom yang berisi sampel. Sokletasi

adalah teknik ekstraksi padat-cair dengan menggunakan alat soklet pada suhu titik

didih pelarut yang digunakan (Pavia dan Kniz, 1990). Hasil ektraksi berupa

filtrate (zat terlarut dalam pelarut). Setelah pelarutnya diuapkan dengan

menggunakan penguap vacuum putar (rotatory vacuum evaporator) akan

menghasilkan ektrak yang berbentuk padatan atau cairan (Harbone J.B., 1987).

2.3.2 Kromatografi

Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sangat penting sehingga

ilmuwan mampu memisahkan komponen- komponen campuran yang kompleks

yang susah dilakukan dengan metode lainnya. Dalam metode pemisahan secara

kromatografi sample diangkut dalam fasa gerak berupa gas, cairan atau fluida.

Fasa gerak ini didorong melewati fasa diam yang tidak larut dalam fasa gerak

yang ditempatkan dalam suatu kolom atau pada permukaan padatan. Kedua fasa

dipilih sedemikian rupa sehingga komponen- komponen sample dapat tersebar

dalam fasa diam dan fasa gerak. Komponen- komponen yang ditahan dengan kuat

oleh fasa diam akan bergerak lambat dalam aliran fasa gerak, sedangkan

komponen- komponen yang tertahan dengan lemah akan bergerak lebih cepat.

Akibat dari perbedaan mobilitas ini, komponen- komponen sampel akan terpisah

menjadi pita- pita diskrit atau zone yang dapat dianalisis baik secara kualitatif atau

kuantitatif . Berikut jenis- jenis kromatografi.

a. Kromatografi kolom

Kromatografi Kolom merupakan teknik pemisahan berdasarkan pada

distribusi kelarutan suatu senayawa pada fase gerak (eluen) dan daya absorbsi

senyawa terhadap fase diam (adsorben) dalam suatu kolom. Senyawa-

26

senyawa yang belum murni akan memperlihatkan adanya pita-pita senyawa

pasda kolom ketika dielusi dengan suatu pelarut tertentu. Hal ini disebabkan

oleh perbedaan kepolaran dari masing- masing senyawa (Gritter et al, 1991).

Kromatografi kolom adalah salah satu teknik yang digunakan untuk

pemisahan dan pemurnian senyawa yang terkandung di dalam tumbuhan.

Kromatografi kolom banyak digunakan karena cara kerjanya sederhana dan

pemisahan yang dihasilkan cukup baik. Selain itu, pengerjaanya dapat

diulang untuk mendapatkan hasil yang lebih murni.

b. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu jenis kromatografi

cair,dimana medium pemisahnya berupa lapisan silika padat setebal 0,1- 0,3

mm pada lempeng kaca, plastik atau alumunium. Zat padat yang lazim

digunakan adalah alumina, gel silika, dan selulosa. KLT digunakan sebagai

monitoring dari hasil pemisahan dan kemurnian suatu senyawa isolat dengan

melihat noda-noda yang terdapat pada plat KLT setelah proses elusi. Dari

Noda-noda tersebut dapat dihitung nilai perbandingan jarak perpindahan zat

terlarut dan jarak pergerakan pelarut pada waktu yang sama. Nilai

perbandinga ini disebut dengan nilai Rf (Underwood et al, 1986).

Kromatografi lapis tipis selain digunakan pada proses pemurnian, sering

juga digunakan untuk memilih pelarut atau kombinasi pelarut dalam

kromatografi kolom yang dilakukan dengan membandingkan hasil

kromatografi lapis tipis beberapa eluen. Eluen memberikan hasil pemisahan

terbaik digunakan sebagai eluen dalam kromatografi kolom.

c. Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan salah satu kromatografi yang sampelnya

diuapkan dan diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi. Sebelum memasuki

kolom sampel cair terlebih dahulu diubah menjadi fase gas dengan

pemanasan. Elusi terjadi karena aliran fasa gerak berupa gas inert. Berbeda

dengan kromatografi lainya, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul-

molekul analit, fasa gerak hanya mengangkut analit melewati kolom (Skoog

et al, 1998).

27

d. Kromatografi Cair Kinerja tinggi

Kromatografi cair menggunakan fase gerak cair. Kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) banyak digunakan dalam teknik pemisahan analitik,

karena metode ini sangat sensitive sehingga sangat baik untuk tujuan alalisis

kuantitaif, baik untuk untuk senyawa- senyawa tidak mudah menguap

(nonvolatile) dan senyawa yang sensitive terhadap panas. Senyawa yang

biasa dipisahkan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi meliputi

asam- asam amino, protein, asam- asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat,

obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotika, steroid, organologam, dan

berbagai senyawa anorganik (Skoog et al, 1998).

Dua keuntungan menggunakan KCKT adalah penggunaan pompa untuk

mengalirkan fase gerak pada tekanan tinggi dan volume yang terkontrol yang

melewati sebuah kolom. Penggunaan kromatografi ini dapat memperpendek

waktu pemisahan dibandingkan dengan cara pemisahan dan pemurnian yang

lain. Dengan menggunakan tekanan tinggi, adsorben yang digunakan jauh

lebih sedikit dengan volume kolom yang lebih kecil. Kedua kelebihan ini

akan memberikan resolusi yang lebih baik untuk senyawa- senyawa yang

melewati kolom karena adanya peningkatan kontak antara senyawa dengan

adsorben (Gritter et al, 1991).

2.4 Metode Pemurnian

2.4.1 Kristalisasi

Kristalisasi adalah metode pemurnian zat padat berdasarkan pada perbedaan

kelarutan dari masing-masing komponen yang tercampur dalam pelarut. Pelarut

yang digunakan bersifat tidak beraksi dengan sampel, dapat melarutkan sampel

dengan sempurna pada suhu panas dan tidak dapat melarutkan sampel pada suhu

kamar, titik didih pelarut harus lebih rendah dibandingkan dengan titik leleh

sampel. Kristal yang terbentuk akan dipisahkan dari filtrate dengan penyaringan.

Kemudian Kristal akan dicuci dengan pelarut yang dapat melarutkan pengotor

(Gritter et al, 1991).

28

2.4.2 Uji titik leleh

Titik leleh kristal padat adalah suhu dimana padatan kristal tersebut mulai

berubah menjadi cair di bawah tekanan 1 a tmosfer. Adanya pengotor dalam

sampel dapat memperlebar trayek titik lebur yang menyebabkan penurunan atau

peningkatan titik leleh daripada titik leleh sebenarnya. Kristal murni memiliki titik

leleh yang bernilai tetap walaupun temperatur naik secara perlahan-lahan selama

penentuan, hal ini menunjukkan bahwa semua sampel meleleh dalam selang

temperatur yang rendah. Dengan kata lain, suhu zat murni pada saat meleleh akan

konstan, sedangkan suhu campuran pada waktu meleleh akan berubah secara

bertahap (Singh et al, 1990).

2.5 Penentuan Struktur

2.5.1 Spektrofotometri Ultra Violet

Spektrofotometri Ultra violet merupakan suatu metode analisis senyawa

yang didasarkan atas serapan molekul dengan menggunakan radiasi ultraviolet

dan sinar tampak, dengan panjang gelombang antara 160 – 780 nm. Metode ini

banyak digunakan dalam pengukuran kuantitatif berbagai senyawa anorganik dan

organik. Sinar ultraviolet memiliki panjang gelombang antara 160 - 400nm dan

sinar tampak yang biasa kita lihat memiliki rentang panjang gelombang antara 400

– 800 nm. Energi radiasi ultraviolet dan tampak dengan panjang gelombang antara

160 – 780 nm berhubungan dengan transisi elektron yang terlibat dalam ikatan

pada suatu molekul. Untuk molekul organik umumnya absorbansi energi radiasi

pada daerah ultraviolet-tampak menyebabkan transisi elektron yang terlibat dalam

ikatan pi (π) terutama elektron pi yang terlibat dalam system konjugasi (Skoog et

al, 1998). Transisi elektron pada senyawa organik didasarkan pada transisi n - π*

atau π - π*. Transisi ini terjadi pada daerah panjang gelombang 200 nm hingga

700 nm (Underwood et al, 1986).

2.5.2 Spektrofotometri Inframerah

Spektrofotometer inframerah merupakan alat yang digunakan untuk

mengidentifikasi suatu gugus fungsioanal serta jenis ikatan dalam suatu molekul

29

(Underwood et al, 1986). Sinar inframerah yang diserap oleh suatu molekul akan

diubah menjadi energi getar molekul yang mengakibatkan terjadinya perubahan

tingkat energi vibrasi molekul tersebut. Setiap ikatan yang berbeda pada suatu

molekul memiliki frekuensi yang berbeda pula. Dengan demikian setiap ikatan

dalam suatu molekul akan memiliki pita-pita serapan yang spesifik dalam

spektrum inframerah. Letak pita pada spektra inframerah ditunjukkan dengan nilai

bilangan gelombang dengan satuan per sentimeter (cm-1) (Silverstein et al, 1998).

Pita serapan dari gugus-gugus fungsional muncul daerah 1400-4000 cm-1. Puncak

serapan gugus karbonil muncul di daerah antara 1700-1750 cm-1 N-H pada 3000-

3500 cm-1. dan O-H pada daerah 3000-3700 cm-1 (Fesenden dan Fesenden., 1986)

2.5.3 Spektrofotometri Resonansi Magnet Inti

Spektroskopi resonansi magnet inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)

merupakan metode analisis yang didasarkan atas pengukuran serapan radiasi

elektromagnetik pada daerah frekwensi radio antara 4 sampai 900 MHz. Berbeda

dengan serapan ultraviolet, tampak, dan inframerah, inti atom terlibat dalam

proses absorpsi pada daerah frekwensi radio. Agar inti dapat menyerap energi

radiasi elektromagnetik tersebut, analit harus ditempatkan dalam medan magnet

(Skoog et al, 1998). Penyerapan gelombang radio oleh inti atom menyebabkan

terjadinya resonansi. Inti yang digunakan pada spektroskopi resonansi magnetik

inti adalah inti yang memiliki spin, yaitu spin +1/2 dan -1/2. Absorpsi radiasi

elektromagnetik dapat terjadi apabila kedua spin memiliki energi yang berbeda.

Inti yang umum digunakan untuk identifikasi senyawa organik adalah 1H (proton)

dan 13C (karbon). 1H-NMR memberikan informasi mengenai jumlah dan

lingkungan setiap proton yang terdapat pada molekul, sedangkan 13C-NMR

memberikan informasi mengenai jumlah dan lingkungan karbon yang terdapat

pada molek (Silverstein et al, 1998).

Proton dan karbon dengan jenis dan lingkungan yang berbeda akan

memberikan sinyal pada medan magnet yang berbeda. Ketergantungan posisi

resonansi inti yang dihasilkan dari lingkungan molekul disebut pergeseran kimia

(ppm). Pergeseran kimia suatu senyawa diukur dengan menggunakan senyawa

30

standar, menggunakan tetrametilsilen (CH3)4Si atau sering dikenal dengan TMS.

TMS dipilih sebagai standar karena bersifat inert, simetri, bersifat volatil, mudah

larut dalam pelarut organik, dan protonnya sangat terlindungi jika dibandingkan

dengan sebagian besar senyawa organik lainnya. Sinyal dari suatu sampel organik

akan muncul pada daerah yang lebih rendah dari pada standar TMS. Inti atom

yang lebih terlindungi akan menyerap radiasi pada daerah medan magnet tinggi

atau berada pada keadaan upfield, sedangkan inti atom yang kurang terlindungi

akan menyerap radiasi pada daerah medan magnet rendah atau berada pada

keadaan downfield. Proton dan karbon dalam lingkungan yang berbeda akan

memiliki efek shielding dan pergeseran kimia yang berbeda, penurunan

eleltronegativitas akan meningkatkan efek shielding. Hibridisasi karbon juga

mempengaruhi efek shieding dari karbon. Nilai pergeseran kimia 1H-NMR

biasanya lebih kecil dibandingkan dengan 13C-NMR (Silverstein et al, 1998).

Nilai pergeseran kimia dapat dilihat pada Tabel 2.1 dan Tabel 2.2.

Tabel 2.1Pergeseran Kimia 13C-NMR

Tipe Proton Struktur Pergeseran Kimia (ppm)

Alkil primer RCH3 8 – 35

Alkil sekunder R2CH2 15 – 55

Alkil tersier R3CH 20 – 60

Alkil kuartener R4C 30 – 40

Alkuna RC≡CH 2,5 – 2,7

Alkena R2C=CR2 100 – 150

Alkil iodida RCH2I 2,0 – 4,0

Alkil bromida RCH2Br 2,5 – 4,0

Alkil klorida RCH2Cl 3,0 – 4,0

Nitril RC≡N 110 – 125

Eter C−O 40 – 80

Karbonil C=O 170 – 210

Sumber : McMurry, 1992

31

Tabel 2.2 Pergeseran Kimia 1H-NMR

Tipe Proton Struktur Pergeseran Kimia (ppm)

Alkil primer RCH3 0,7 – 1,3

Alkil sekunder R2CH2 1,2 – 1,4

Alkil tersier R3CH 1,4 – 1,7

Alilik primer R2C=CRCH3 1,6 – 1,9

Metil keton RCOCH3 2,1 – 2,4

Aromatik metil ArCH3 2,5 – 2,7

Alkuna RC≡CH 2,5 – 2,7

Alkil iodida RCH2I 2,0 – 4,0

Alkil bromida RCH2Br 2,5 – 4,0

Alkil klorida RCH2Cl 3,0 – 4,0

Eter ROCH2R 3,3 – 4,0

Amina RNH2 1,0 – 5,0

Alkohol R3COH 2,5 – 5,0

Vinil R2C=CH2 5,0 – 6,5

Aromatik ArH 6,5 – 8,0

Aldehida RCHO 9,7 – 10,0

Asam karboksilat

RCOOH 11,0 – 12,0

Sumber : McMurry, 1992

32

“halaman ini sengaja dikosongkan”

33

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain peralatan gelas,

neraca analitik CP 224S Sartorius, hotplate stirrer Cimarec, pengaduk magnetik,

pengaduk, erlenmeyer, kaca arloji, pipet tetes, pipa kapiler, gelas ukur, botol vial,

pinset, chamber, kertas saring, tabung steril, pipet mikro CAPP Autoclavable

(10,0- 100,0 μL), pipet mikro CAPP Autoclavable (100-1000 μL), seperangkat

alat destilasi, termometer, plat KLT silika gel 60 F 254 (Merck, 1.05554), l ampu

ultraviolet dengan λ 254 dan 366 nm, corong pisah, statif, rotary evaporator

Buchi R-11, desikator, alat uji titik leleh Fischer John, satu set alat kromatografi

cair vacuum (KCV), satu set alat kromatografi kolom grafitasi (KKG),

spektrometer FT-IR Shimadzu 8400S, spectrometer NMR Agilent 500 MHz.

3.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun Pare (Momordica

charantia L). Pelarut organik yang digunakan yaitu n-heksana, diklorometana, etil

asetat, metanol, larutan penampak noda 1,5 % serium sulfat dalam H2SO4, H2SO4

akuades, serta pelarut pro analitik antara lain metanol dan kloroform (CHCl3).

Bahan untuk KCV silika gel 60, plat KLT silika gel GF254, kertas saring Whatman

42. Pelarut yang digunakan untuk uji NMR yaitu kloroform (CDCl3) dan metanol

(CD3OD). Bahan untuk uji bioaktivitas antioksidan yaitu 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil (DPPH), 2.2-azino-bis(asam 3-etilbenzotiazolin-6sulfonat) ABTS

potassium persulfat (K2S2O8), dimetilsulfoksida (DMSO), etanol 99,5% dan asam

galat.

34

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Persiapan Uji Pendahuluan Skrining Antioksidan

Tigabelas macam tanaman obat tradisional Bali dipotong menjadi kecil dan

angina-anginkan. Masing-masing sampel disiapkan 25 gram untuk diekstraksi. Uji

pendahuluan digunakan untuk pemilihan tanaman yang akan dilanjutkan ketahap

isolasi. Setiap sampel diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol selama 1

x 24 j asm. Masing- masing ekstrak diuapkan dengan rotary evaporator untuk

mendapatkan ekstrak pekat. Ekstrak pekat yang didapatkan dari ketigabelas

tanaman tersebut kemudian di uji antioksidanya dengan metode DPPH (24) dan

ABTS (26).

3.2.2 Uji Aktivitas Antioksidan

3.2.2.1 Metode DPPH

Larutan sampel dibuat dengan cara melarutkan 10 mg ampel uji dilarutkan

ke dalam 1 mL MeOH. Larutan sampel sebanyak 33 µL ditambah dengan 1 mL

larutan DPPH (319 ppm). Campuran divortex mixer dan diinkubasi pada suhu

37ºC selama 20 menit. Aktivitas antioksidan bisa diamati dengan adanya

perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning dan dapat diukur

absorbansinya pada λ 515 nm. Larutan blanko dibuat dengan melarutkan 1 mL

DPPH ke dalam 33 µL MeOH. Perhitungan persen penghambatan dihitung

berdasarkan persamaan berikut:

Inhibisi (%) = 𝐴𝑏−𝐴𝑠𝐴𝑏

× 100%

Ab = Absorbansi blanko

As = Absorbansi sampel

3.2.2.2 Metode ABTS

Larutan sampel dibuat dengan cara melarutkan 10 mg sampel uji

dilarutkan ke dalam 1 mL DMSO. Larutan sampel sebanyak 10 µL ditambah

dengan 1 mL larutan ABTS (99 ppm). Campuran divortex mixer dan diinkubasi

pada suhu 30ºC selama 4 menit. Aktivitas antioksidan diamati dengan cara

35

mengukur adanya perubahan warna larutan dari hijau menjadi kuning dan

absorbansi larutan diukur pada λ 734 nm. Larutan Blanko dibuat dengan

melarutkan 1 mL ABTS ke dalam 10 µ L DMSO. Perhitungan persen

penghambatan dihitung berdasarkan persamaan berikut :

Inhibisi (%) = 𝐴𝑏−𝐴𝑠𝐴𝑏

× 100%

Ab = Absorbansi blanko

As = Absorbansi sampel

3.2.3 Ektraksi dan Isolasi

3.2.3.1 Ekstraksi Daun Pare

Serbuk kering dari daun pare sebanyak 900 g dimaserasi dengan

menggunakan 10 L metanol selama 3x24 jam. Hasil maserasi dipekatkan dengan

menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol

sebanyak 97,494 g . Ekstrak pekat metanol tersebut dimonitoring KLT untuk

pemilihan eluen pada proses fraksinasi.

3.2.3.2 Fraksinasi Ekstrak Metanol Daun Pare

Ekstrak metanol sebanyak 50 g difraksinasi dengan metode kromatografi

cair vakum (KCV) dengan tinggi 10 cm dan lebar 11 cm. Eluen yang digunakan

adalah diklorometana 100%, etil asetat 100% dan metanol 100%. Sistem eluen ini

menggunakan prinsip increasing polarity atau kepolaran meningkat. Fraksi- fraksi

yang dihasilkan dimonitoring dengan menggunakan kromatografi lapis tipis

(KLT) menggunakan eluen etil asetat: n-heksana 80%. Fraksi- fraksi dengan nilai

Rf yang re latif sama digabungkan menjadi satu fraksi. Penggabungan fraksi ini

menghasilkan fraksi gabungan sebanyak 5 fraksi yaitu fraksi P sampai fraksi T.

3.2.3.3 Fraksinasi Fraksi R dan Isolasi Senyawa R6

Fraksi R (9,386 g ) difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan metode

KCV dengan tinggi 3,5 cm dan diameter kolom 8,7 cm. Eluen yang digunakan etil

asetat: n-heksana (5:95 40:60), etil asetat 100% da n metanol 100%. P roses

36

fraksinasi ini menghasilkan 58 fraksi. Fraksi- fraksi hasil fraksinasi dimonitoring

KLT dengan menggunakan eluen etil asetat: n-heksana 50%. Fraksi- fraksi yang

memiliki nilai Rf yang sama digabungkan sehingga didapatkan 6 fraksi gabungan

diantaranya yaitu fraksi R1-R6.

Subfraksi R6 (4,754 g ) difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan

metode kromatografi cair vakum (KCV) dengan tinggi silika 6,3 cm dan lebar

kolom 4 cm. Eluen yang digunakan etil asetat: n-heksana (0:100 30:70), etil

asetat 100% dan metanol 100%. P roses fraksinasi ini menghasilkan 58 fra ksi.

Fraksi- fraksi hasil proses fraksinasi dimonitoring KLT dengan menggunakan etil

asetat: diklorometana 60%. Fraksi yang memiliki nilai Rf yang hampir sama

digabung sehingga diperoleh 3 fraksi gabungan diantaranya fraksi R6a-R6b.

Fraksi R6b dicuci dengan menggunakan pelarut n-heksana dan dihasilkan

serbuk putih. Serbuk putih yang didapatkan dimonitoring dengan KLT

menggunakan eluen etil asetat: n-heksana 60%. Re kristalisasi dilakukan dengan

menggunakan pelarut diklorometana panas kemudian ditambahkan dengan n-

heksana dingin. Uji kemurnian senyawa menggunakan KLT sistem tiga eluen

dengan kepolaran yang berbeda dan KLT 2D. Serbuk putih ini selanjutnya disebut

dengan Senyawa R6b, dielusidasi struktur dengan menggunakan IR, 1H-NMR dan 13C-NMR.

3.2.3.4 Fraksinasi Fraksi R5 dan Isolasi Senyawa R5d

Fraksi R5 (0,825 g) difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan metode

kromatografi cair vacum (KCV) dengan tinggi 3,5 cm dan diameter kolom 4 cm.

Eluen yang digunakan terdiri dai etil asetat: n-heksana (0:100 100:0), dan

metanol 100%. Proses fraksinasi ini menghasilkan 48 fraksi. Fraksi- fraksi yang

dihasilkan dimonitoring dengan KLT menggunakan eluen etil asetat: n-heksana

50%. Fraksi dengan nilai Rf yang hampir sama digabung sehingga didapatkan 6

fraksi gabungan yaitu R5a-R5e.

Subfraksi R5d di murnikan lebih lanjut dengan menggunakan metode

kolom kromatografi grafitasi (KKG) dengan tinggi 10 cm dan lebar 0,7 cm. Eluen

yang digunakan diantarannya etil asetat: n-heksana (0:100 60:40), etil asetat

100% dan metanol 100%. P roses fraksinasi ini menghasilkan 60 fr aksi. Fraksi-

37

fraksi yang dihasilkan dimonitoring KLT dengan eluen etil asetat: n-heksana 60%.

Fraksi dengan nilai Rf yang hampir sama digabung. Fraksi dari vial 36-56

digabung dan diuapkan sehingga mendapatkan serbuk putih kehijauan. Serbuk

putih tersebut direkristalisasi dengan menggunakan diklorometana panas dan n-

heksana dingin disimpan dalam suhu ruang. Kristal yang terbentuk berwarna putih

sebanyak 40 mg. Uji kemurnian senyawa menggunakan KLT tiga eluen dan KLT

2D. Kristal putih kehijauan ini kemudian disebut dengan senyawa R5d. Struktur

senyawa R5d dielusidasi dengan menggunakan IR, 1H-NMR dan 13C-NMR.

38

“halaman ini sengaja dikosongkan”

39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Skrining Antioksidan

Skrining antioksidan bertujuan untuk mengetahui jenis tanaman obat

tradisional Bali yang memiliki aktivitas antioksidan. Tanaman yang memiliki

persen inhibisi yang tinggi akan menjadi target sampel pada penelitian ini.

Skrining ini dilakukan terhadap tiga belas tanaman obat. Sebanyak 20 g dari

masing- masing sampel dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama

1 x 24 jam. Pelarut metanol diharapkan mampu mengekstrak semua senyawa

polar, semi polar dan nonpolar. Tiga belas ekstrak cair dipekatkan dengan

menggunakan alat rotatory evaporator sehingga dihasilkan ekstrak pekat. Uji

aktivitas antioksidan dilakukan dengan dua metode yaitu DPPH (24) dan ABTS

(26). Persen inhibisi dari 13 ekstrak tanaman dapat dilihat pada Gambar 4.1.

Keterangan: PR (Pare)

TL (Tulasi)

PK (Patikan kebo)

KS (Ksimbukan)

BR (Barococo)

DD (Daun dewa)

SH (Sirih)

BT (Bambu tali)

SN (Sambung nyawa)

PG (Pegagan)

CP (Ciplukan)

BL (Bluntas)

SM (Sirih merah)

Gambar 4.1 Hasil Skrining Antioksidan 13 Daun Obat Tradisional Bali

15,592

80,139

3,833

83,188

0,697

13,153

37,021

32,491

8,624

1,220

77,352

39,024

24,390

61,354

73,95 51,434

89,939 52,233

55,665 56,276

75,882

48,801

34,838

97,649

84,062

78,796

0 20 40 60 80 100

SM BL CP PG SN BT SH DD BR KS PK TL PR

ABTS

DPPH

40

Hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode ABTS (26) menunjukkan

bahwa terdapat 11 ekstrak tanaman yang memiliki persen inhibisi diatas 50%

diantaranya ekstrak patikan kebo (97,6%), ekstrak tulasi (84,0%), ekstrak pegagan

(89,9%), ekstrak pare (78,7%), e kstrak daun dewa (75,8%), e kstrak bluntas

(73,9%), ekstrak sereh merah (61,3%), ekstrak sirih merah (56,2%), ekstrak

bambu tali (55,6%), ekstrak sambung nyawa (52,2%) da n ekstrak ciplukan

(51,4%). Hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (24) menunjukkan

bahwa hanya terdapat 3 ekstrak tanaman yang memiliki persen inhibisi di atas

50%, diantaranya ekstrak pegagan (83,1%), ekstrak bluntas (80,1%) dan ekstrak

patikan kebo (77,3%). Hasil perbandingan kedua metode ini menjadi dasar dalam

penyeleksian sampel yang akan digunakan selanjutnya. Terdapat lima dari

tigabelas tumbuhan yang terpilih dan dilakukan penelusuran literatur selanjutnya.

Penelusuran literatur dari kelima tumbuhan dapat dilihat pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Perbandingan Aktivitas Antioksidan Dari 5 Tumbuhan

Tumbuhan Bagian Tumbuhan/ ekstrak

Uji Antioksidan Refferensi ABTS (26) DPPH (24)

Patikan Kebo

Daun/ Metanol Bunga/ Metanol Akar/ Metanol Batang/ Metanol

* * * *

72,96±0,78% 52,45±0,66% 48,59±0,97% 44,42±0,94%

(Basma et al., 2011)

Pegagan Daun/ Metanol Daun/ Metanol

*

1,18±0,89 μg/mL

IC50 0,07 μg/mL

*

(Anand et al, 2010) (Andarwulan et al, 2010)

Tulasi Daun/ Etanol:Air * 73% (Deo et al., 2013)

Pare Buah/ Air Batang/ Air Daun/ Air

* * *

IC50 11,0 IC50 17,8 IC50 9,72

(Kubola et al, 2008)

Beluntas Daun/ Etanol:Air 3,75±0,16 μmol/ g fw

96,4±15,2 μmol/ g fw

(Andarwulan et al, 2010)

*) belum dilakukan

Penelusuran literatur dari kelima tanaman tersebut (Tabel 4.1) menunjukkan

bahwa kelima tanaman tersebut sudah dilakukan uji antioksidan dengan metode

DPPH (24). Sedangkan untuk metode ABTS (26) hanya terdapat dua tanaman

yang belum dilakukan uji yaitu pegagan dan beluntas. Ketiga tanaman yaitu pare,

41

patikan kebo dan tulasi belum dilakukan. Ketiga tanaman tersebut menunjukkan

aktivitas antioksidan yang cukup tinggi untuk metode DPPH (24). Tanaman pare

menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan kedua tanaman

lainya. Hal ini memberikan peluang untuk melakukan uji aktivitas dengan metode

ABTS (26) dan mengisolasi senyawa- senyawa yang aktif sebagai antioksidan.

Hasil skrining aktivitas antioksidan dan penelusuran literatur menunjukkan bahwa

daun pare dapat dijadikan target dalam penelitian ini.

4.2 Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Daun Pare

Aktivitas antioksidan dari masing-masing ekstrak diuji sebagai dasar

pemilihan pelarut untuk proses ekstraksi. Aktivitas antioksidan keempat ekstrak

diuji dengan dua metode yaitu metode DPPH (24) dan ABTS (26). Metode DPPH

(24) dan ABTS (26) ini merupakan metode yang paling efektif digunakan dalam

penentuan aktivitas antioksidan pada sampel tanaman (Krishnaiah et al, 2011).

Mekanisme penghambatan radikal dari kedua metode tersebut sangat mirip

dengan antioksidan alami yang diproduksi oleh tubuh manusia. Radikal DPPH

(24) dan ABTS (26) bereaksi dengan senyawa antioksidan dengan cara

melepaskan hidrogen radikal. Reaksi antara radikal kation DPPH (24) dan ABTS

(26) dengan senyawa antioksidan dapat dilihat pada Gambar 4.3 dan Gambar 4.4.

Kontrol positif pada uji antioksidan adalah asam galat (asam 3,4,5-trihidroksi

benzoat).

Uji aktivitas antioksidan daun pare dilakukan terhadap empat ekstrak.

Daun Pare diekstrak dengan 4 pe larut dengan kepolaran berbeda diantaranya n-

heksana, diklorometana, etil asetat dan metanol. Proses ekstraksi ini menghasilkan

empat jenis ekstrak. Keempat ekstrak tersebut dimonitoring dengan menggunakan

kromatografi lapis tipis (KLT) dengan eluen kloroform 100%. Hasil monitoring

KLT (Gambar 4.2) m enunjukkan perbedaan distribusi senyawa yang terbanyak

terdapat pada pelarut metanol. Pelarut metanol mampu mengekstrak lebih banyak

senyawa dibandingkan dengan pelarut lain.

42

Keterangan

Me : metanol

Ea : etil asetat

Mc : metilen klorida

Hx : n-heksana

Eluen: kloroform 100%

Gambar 4.2 Kromatogram empat ekstrak daun pare

NN

N NO

O

O

O

+

OH

O

H

NO O

NN

N NO

O

O

O

NO O

H

+

OH

O

HO

OH

O

HO

Asam GalatDPPH

HOOH

O

OH

O

OH

O

Gambar 4.3 Reaksi antara Radikal Kation DPPH (24) dan Asam Galat

43

OH

O

HO

+

O

S

N

HO3S

NN

N

S SO3H

NH

HO3S

NN

N

S SO3H

+

H

N

HO3S

NHN

N

S SO3H

O

OH

HOO

OH

O

OH

OH

HO

O

OH

ABTS

Asam Galat

Gambar 4.4 Reaksi antara Radikal Kation ABTS (26) dan Asam Galat

4.2.1 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pare dengan Metode DPPH

Uji aktivitas antioksidan metode DPPH (24) dilakukan dengan penambahan

1 mL larutan DPPH ke dalam sampel ekstrak. Larutan diinkubasi pada suhu 37°C

selama 20 menit. Adanya reaksi antara DPPH (24) dan senyawa antioksidan

diindikasikan dengan perubahan warna larutan ungu menjadi kuning. Perubahan

warna terjadi karena adanya donor ra dikal hidrogen dari senyawa antioksidan

terhadap radikal DPPH (24). Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang

515 nm dengan menggunakan alat UV-Vis.

Ekstrak etil asetat menunjukkan persen inhibisi tertinggi, yaitu

65,65±0,02% pada konsentrasi 319 µg/mL dibandingkan dengan ketiga ekstrak

yang lain, diantaranya ekstrak metanol 40,57±0,06%, metilen klorida

44

39,48±0,05% dan n-heksana 25,07±0,1% (Lampiran 7). Penentuan IC50 dilakukan

terhadap ekstrak yang memiliki nilai penghambatan diatas 50% yaitu ekstrak etil

asetat. Nilai IC50 adalah konsentrasi minimum sampel yang dapat menghambat

radikal DPPH (24) sebanyak 50%. Nilai IC50 dilakukan dengan cara mengukur

penghambatan diatas 50% hingga nilai penghambatan dibawah 50% dengan

variasi konsentrasi. Selanjutnya, dibuat kurva hubungan antara konsentrasi dengan

persentase penghambatan. Berdasarkan kurva interpolasi (Lampiran 8) antara

konsentrasi dengan persentase penghambatan, maka diperoleh nilai IC50 ekstrak

etil asetat sebesar 211 µg/mL.

4.2.2 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pare dengan Metode ABTS

ABTS (26) merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan berdasarkan

pada peredaman radikal kation ABTS (26). Radikal kation ABTS (26) dibuat

dengan mereaksikan garam ABTS dengan K2S2O8. Larutan berwarna biru tersebut

disimpan pada ruang gelap selama 12-16 jam. Larutan ABTS diencerkan dengan

menggunakan etanol hingga mencapai absorbansi 0,7±0,02 pada panjang

gelombang 734 nm . Delokalisasi elektron yang terjadi akibat adanya donor

elektron dari senyawa antioksidan terhadap radikal kation ABTS (26)

menyebabkan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi tidak berwarna

selama reaksi berlangsung.

Gambar 4.5 Penghambatan radikal kation ABTS (26) oleh ekstrak daun M. charantia

0 10 20 30 40 50 60 70 80

MeOH EA MC Hx

Peng

ham

bata

n (%

)

Penghambatan ABTS

45

Gambar 4.6 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS (26) Ekstrak etil asetat

Gambar 4.7 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS (26) Ekstrak Metanol Daun M. charantia

Ekstrak etil asetat (Tabel 4.5) menunjukkan aktivitas penghambatan

tertinggi pada konsentrasi 319 µg/ml dengan nilai penghambatan 70,30±0,02%

dibandingkan dengan ketiga ekstrak yang lain diantaranya metanol 67,15±0,03%,

metilen klorida 37,22±0,03% dan n-heksana 33,11±0,03%. Selanjutnya dilakukan

penentuan nilai IC50 dari ekstrak yang memiliki nilai penghambatan lebih dari

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsentrasi μg/mL

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsentrasi μg/mL

46

50% yaitu ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Berdasarkan kurva interpolasi

antara konsentrasi dengan persentase penghambatan diperoleh nilai IC50 ekstrak

metanol 27,58 µg/mL (Gambar 4.6) dan ekstrak etil asetat 115,54 µg/mL

(Gambar 4.7). Ekstrak metanol memiliki nilai IC50 yang jauh lebih tinggi jika

dibandingkan dengan ekstrak etil asetat.

Uji aktivitas antioksidan DPPH (24) dan ABTS (26) pada keempat ekstrak

daun pare menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas yang paling

tinggi dibandingkan ekstrak lainya termasuk ekstrak metanol, namun pada

perhitungan nilai IC50, ekstrak metanol memiliki nilai IC50 yang jauh lebih tinggi

dari ekstrak etil asetat. Tingginya aktivitas antioksidan ekstrak metanol dapat

dihubungkan dengan kandungan senyawa metabolit sekunder yang aktif sebagai

antioksidan. Berdasarkan hasil uji pendahuluan dan aktivitas antioksidan dari

keempat ekstrak tersebut, maka dapat disimpulkan bahwa pelarut metanol dapat

mengekstrak senyawa- senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan, sehingga

pelarut metanol dipilih sebagai pelarut dalam proses ekstraksi.

4.3 Isolasi Senyawa Ekstrak Metanol dari Daun Pare

4.3.1 Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu teknik pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan

suatu senyawa dalam pelarut tertentu. Proses ekstraksi dilakukan dengan metode

ekstraksi padat-cair pada suhu kamar yang disebut dengan maserasi. Metode

maserasi dipilih karena sampel yang digunakan dalam jumlah yang banyak dan

tidak menyebabkan dekomposisi pada senyawa isolate. Sampel kering daun M.

charantia (900 g) dihaluskan kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut

metanol selama 3 x 24 jam. Pengambilan ekstrak dilakukan setiap 1x 24 j am

selama tiga hari. Ekstrak cair dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga

didapatkan ekstrak pekat sebanyak 97,494 g dengan rendemen 10,8 %.

4.3.2 Fraksinasi Ekstrak Metanol Daun Pare

Fraksinasi dilakukan dengan metode kromatografi cair vacum (KCV).

Metode ini dipilih karena proses pemisahanya relatif lebih cepat dengan jumlah

47

sampel yang lebih banyak dan menghasilkan fraksi- fraksi dengan kandungan

senyawa yang lebih sederhana. Fase diam yang digunakan adalah silika gel.

Kolom dibuat dalam kondisi vakum dengan tinggi 5 cm dan diameter 8,7 cm.

Proses fraksinasi pada penelitian ini menggunakan sistem eluen “increasing

polarity”, dimana senyawa yang lebih non polar akan terelusi terlebih dahulu

menggunakan pelarut non pol ar, selanjutnya diikuti senyawa semi polar dan

terakhir senyawa polar. Eluen yang digunakan terdiri dari diklorometana 100%,

etil asetat 100% da n metnaol 100%. Proses elusi dilakukan sebanyak dua kali

pada sampel A (25 gram) dan B (25 gram). Pembagian sampel ini bertujuan untuk

memperbanyak massa fraksi dan menggurangi massa silika kolom yang

digunakan, sehingga pekerjaan lebih efisien. Hasil fraksinasi ditampung dalam

botol vial 300 m L. Fraksinasi ini mengghasilkan 14 fra ksi yang dimonitoring

dengan plat KLT (Gambar 4.8).

Gambar 4.8 Kromatogram Monitoring KLT hasil KCV ke-1 etil asetat:n-heksana

80%

Proses monitoring bertujuan untuk menggabungkan fraksi- fraksi yang

memiliki nilai Rf yang sama. Fraksi yang memiliki kemiripan Rf dapat

disimpulkan bahwa fraksi- fraksi tersebut memiliki kandungan senyawa yang

sama pula. Hasil monitoring menunjukkan adanya beberapa noda beragam pada

plat KLT. Fraksi 1-14 dimonitoring dengan menggunakan eluen etil asetat: n-

heksana 80%.

Penggabungan (Gambar 4.9) menghasilkan 5 fraksi gabungan yaitu fraksi

P hingga fraksi Q. Fraksi gabungan ini dipekatkan dengan menggunakan rotary

48

evaporator, sehingga didapatkan besar rendemen (Tabel 4.2). Fraksi gabungan P

(3,169 g) merupakan hasil penggabungan frakasi 1-3 dengan nilai Rf 0,90 c m.

Fraksi gabungan Q (1,774 g) merupakan hasil penggabungan fraksi 4-6 dengan

nilai Rf 0,85. Fraksi gabungan R (9,386) merupakan hasil penggabungan fraksi 7-

9 dengan nilai Rf 0,66 c m. Fraksi gabungan S (1,925 g) merupakan ha sil

penggabungan fraksi 10-12 dengan nilai Rf 0,59. Fraksi gabungan T (17,937)

merupakan hasil penggabungan fraksi 13-14 dengan nilai Rf 0,11 cm.

Tabel 4.2 Pengelompokan Fraksi Hasil Pemisahan KCV ke-1

Fraksi Gabungan

No Vial Massa (gram)

P 1-3 3,169 Q 4-6 1,774 R 7-9 9,386 S 10-12 1,925 T 13-14 17,937

Jumlah 34,191

Keterangan:

a) Ea:Hx 80%

b) Ea:Hx 50%

c) Ea:Mc 95%

Gambar 4.9 Kromatogram Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-1

Kromatogram fraksi gabungan R menunjukkan profil noda yang beragam

dan berwarna ungu, sehingga dapat diperkirakan terdapat senyawa terpenoid yang

cukup banyak pada fraksi tersebut. Jumlah fraksi R yang cukup banyak 9,386 g

juga memungkinkan dilakukan fraksinasi lebih lanjut.

(b) (a) (c)

49

4.3.3 Fraksinasi Fraksi R dan Isolasi Senyawa R6

Fraksi R (9,386 g) difraksinasi lebih lanjut dengan metode kromatografi cair

vakum (KCV) dengan menggunakan beberapa eluen. Eluen yang digunakan

adalah campuran pelarut etil asetat dan n-heksana dengan perbandingan (5:95

40:60), etil asetat 100% dan metanol 100%. Fase diam yang digunakan adalah

silika gel. Kolom dibuat dalam keadaan vakum dengan tinggi 3,5 cm dan diameter

8,7 cm. Hasil fraksinasi ditampung dalam botol vial 100 mL. Fraksinasi ini

mengghasilkan 58 fraksi dan dimonitoring KLT menggunakan eluen etil asetat: n-

heksana 50%. K romatogram KLT hasil KCV ke-2 ditunjukkkan pada Gambar

4.10.

Gambar 4.10 Kromatogram Monitoring KLT hasil KCV ke-2 dengan eluen etil asetat: n-heksana 50%

Tabel 4.3 Penggabungan Fraksi Hasil Fraksinasi KCV ke-2

Fraksi Gabungan

No Vial Massa (gram)

R1 1-12 0,485 R2 13-24 1,779 R3 25-32 0,339 R4 33-50 0,623 R5 51-55 0,825 R6 56-58 4,754

Jumlah 8,805

Proses monitoring ini bertujuan untuk menggabungkan fraksi- fraksi yang

memiliki nilai Rf yang sama. Fraksi- fraksi dengan nilai Rf yang hampir sama

dapat disimpulkan mengandung senyawa sama, sehingga fraksi tersebut dapat

50

digabung. Penggabungan menghasilkan 6 fraksi gabungan yaitu fraksi R1-R6.

Fraksi gabungan dipekatkan dengan menggunakan rotatory evaporator. Sehingga

didapatkan fraksi pekat (Tabel 4.3).

Fraksi gabungan R1 (0,485 g ) merupakan hasil penggabungan dari fraksi

1-12 dengan nilai Rf 0,90 c m. Fraksi gabungan R2 (1,779) m erupakan hasil

penggabungan dari fraksi 13-24 dengan nilai Rf 0,85 c m. Fraksi gabungan R3

(0,339 g) merupakan hasil penggabungan dari fraksi 25-32 dengan nilai Rf 0,71

cm. Fraksi R4 (0,623 g) merupakan hasil penggabungan dari fraksi 33-50 dengan

nilai Rf 0,59 cm. Fraksi R5 (0,825 g) merupakan hasil penggabungan dari fraksi

51-55 dengan nilai Rf 0,47 c m. Fraksi R6 (4,754 g ) merupakan hasil

penggabungan dari fraksi 56-58 dengan nilai Rf 0,23 cm. Kromatogram dari enam

fraksi gabungan tersebut ditunjukkan pada Gambar 4.11.

Keterangan:

Eluen Ea:Hx

R1 (10%)

R2 (20%)

R3 (30%)

R456 (50%)

R1 R2 R3 (R4) (R5) (R6)

Gambar 4.11 Kromatogram KLT Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-2

Fraksi R6 (4,754 g) adalah fraksi dengan jumlah terbanyak. Profil KLT

menunjukkan terdapat noda yang memungkinkan untuk dipisahkan lebih lanjut.

Fraksi R6 difraksinasi lebih lanjut dengan metode KCV. Metode KCV dipilih

pada pemisahan fraksi R6 karena selain jumlah yang banyak kemungkinan masih

terdapat banyak senyawa yang terdistribusi pada fraksi tersebut.

51

Fraksi R6 (4,754 gram) difraksinasi lebih lanjut dengan metode

kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan sistem eluen “increasing polarity”.

Eluen yang digunakan terdiri dari etil asetat: n-heksana (0:100 30:70), etil

asetat 100% da n metanol 100%. Fase diam yang digunakan adalah silika gel

dengan tinggi kolom 4 cm dan diameter 6,3 cm. Fraksinasi ini menghasilkan 58

fraksi, dan dimonitoring KLT menggunakan eluen etil asetat:metilen klorida 60%.

Kromatogram KLT hasil KCV ke-3 ditunjukkan pada Gambar 4.12.

Tabel 4.4 Pengelompokan Fraksi Hasil KCV ke-3

Subfraksi Gabungan

No Vial Massa (mg)

R6a 1-28 185 R6b 29-49 638

R6c 50-58 56 Jumlah 879

Subfraksi gabungan (Tabel 4.4) R6a (185 m g) merupakan hasil

penggabungan dari fraksi 1-28 dengan nilai Rf 0,83 cm. Subfraksi gabungan R6b

(638 mg) merupakan hasil penggabungan dari fraksi 29-49 dengan nilai Rf 0,32

cm. Subfraksi R6c (56 m g) merupakan hasil penggabungan antara fraksi 50-58

dengan nilai Rf 0,25 cm.

Keterangan:

- Eluen Hx:Ea

40:60

Gambar 4.12 Kromatogram Hasil KCV ke-3(a) dan Kromatogram KLT fraksi Gabungan fraksi 41-53 (b)

52

Subfraksi R6b (638 m g) berwarna putih kekuningan dengan berat 638 mg.

Subfraksi ini dimonitoring KLT dengan eluen etil asetat: n-heksana 40% (Gambar

4.12). Endapan kemudian dicuci dengan n-heksana yang bertujuan memisahkan

endapan dari pengotor yang mungkin masih tersisa. Pencucian ini menghasilkan

serbuk putih yang larut pada diklorometana panas. Rekristalisasi dilakukan

dengan menggunakan diklorometana panas dan n-heksana. Serbuk putih

dilarutkan kedalam diklorometana panas dan menambahkan n-heksana dingin,

larutan tersebut disimpan di dalam lemari es selama 1 x 24 jam. Endapan putih

yang terbentuk disaring menggunakan saring vakum. Endapan senyawa dicuci

menggunakan n-heksana dingin. Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan

KLT tiga eluen dengan kepolaran yang berbeda, yaitu etil asetat: n-heksana 95%,

etil asetat: metilen klorida 60% dan metanol: n-heksana 5%. Hasil elusi ketiga

eluen ini menghasilkan Rf yang berbeda yaitu 0,74, 0,52 dan 0,30. Hasil

monitoring KLT (Gambar 4.13a) menunjukkan adanya noda tunggal disetiap

eluen. Hasil KLT 2D juga memperlihatkan adanya noda tunggal (Gambar 4.13b).

Keterangan:

a. Ea:Hx 95%

Ea:MC 60%

Me:Hx 5%

b. Ea:Hx 60%

Ea:Mc 50%

(a) (b)

Gambar 4.13 Kromatogram KLT Tiga Eluen (a) dan Kromatogram KLT 2D (b) Senyawa R6b

Berdasarkan hasil monitoring KLT dapat disimpulkan bahwa serbuk putih

tersebut merupakan senyawa tunggal dan selanjutnya disebut dengan senyawa

R6b. Struktur senyawa ini dielusidasi de ngan menggunakan IR, 1H-NMR dan 13C-NMR.

53

4.3.4 Fraksinasi Fraksi R5 dan Isolasi Senyawa R5d

Fraksi R5 (0,825 g) difraksinasi lanjut dengan metode kromatografi cair

vakum (KCV) dengan menggunakan sistem peningkat kepolaran eluen. Eluen

yang digunakan terdiri dari etil asetat: n-heksana (100:0 sampai 0:100) dan

metanol 100%. Fase diam yang digunakan adalah silika gel. Kolom dibuat dalam

keadaan vakum dengan tinggi 4 cm dan diameter 4 cm. Fraksinasi ini

menghasilkan 48 fra ksi dan dimonitoring dengan KLT dengan menggunakan

eluen etil asetat: n-heksana 50%.

Kromatogram KLT hasil KCV ke-3 dapat dilihat pada Gambar 4.14. Proses

monitoring bertujuan untuk menggabungkan fraksi- fraksi yang memiliki nilai Rf

yang sama. Hasil monitoring KLT terlihat adanya beberapa noda pada plat KLT

dengan Rf yang beragam. Hasil fraksi gabungan mengghasilkan 5 fraksi gabungan

yaitu fraksi R5a-R5b. Fraksi gabungan R5a-R5e dipekatkan dengan menggunakan

rotary evaporator. Rendemen yang didapat ditimbang. Penggabungan hasil

fraksinasi KCV ini dapat dilihat pada Tabel 4.5.

Gambar 4.14 Kromatogram Monitoring KLT Hasil KCV ke-3 dengan eluen etil asetat: n-heksana 50%

Fraksi gabungan R5a (208,6 m g) merupakan hasil penggabungan dari

fraksi 1-17 dengan nilai Rf 0,90 cm. Fraksi gabungan R5b (151,2 mg) merupakan

hasil penggabungan dari fraksi 18-26 dengan nilai Rf 0,76 c m. Fraksi gabungan

R5c (109) merupakan hasil penggabungan dari fraksi 27-32 dengan nilai Rf 0,59

cm. Fraksi gabungan R5d (450,2 m g) merupakan hasil penggabungan dari fraksi

33-44 dengan nilai Rf 0,40 cm. Fraksi gabungan R5e merupakan hasil

54

penggabungan dari fraksi antara 45-48 dengan nilai Rf 0,28 c m. Kromatogram

dari enam fraksi gabungan ini ditunjukkan pada Gambar 4.15.

Tabel 4.5 Penggabungan Fraksi Hasil Fraksinasi KCV ke-3

Fraksi Gabungan

No Vial Massa (mg)

R5a 1-17 208,6 R5b 18-26 151,2

R5c 27-32 109 R5d 33-44 450,2 R5e 45-48 201,3

Jumlah 1120,3

Gambar 4.15 Kromatogram KLT Fraksi Gabungan Hasil KCV ke-4

Subfraksi R5d be rupa kristal hijau pekat dengan massa 450,2 mg.

Subfraksi R5d di fraksinasi lebih lanjut dengan kolom kromatografi gravitasi

(KKG). Metode KKG dipilih untuk jumlah sampel yang lebih sedikit dan nilai Rf

yang sangat dekat. Eluen yang digunakan terdiri dari n-heksana: etil asetat (100:0

60:40), etil asetat 100% dan metanol 100%. Fase diam yang digunakan adalah

silika gel. Kolom dibuat dalam keadaan basah dengan tinggi 10 cm dan diameter 2

cm. Fraksinasi ini menghasilkan 68 fraksi dan dimonitoring dengan KLT

menggunakan eluen etil asetat: n-heksana 60%. K romatogram KLT hasil KKG

ditunjukkan pada Gambar 4.16.

Keterangan

Eluen etil asetat: n-heksana

R5a 30%

R5b 40%

R5c 55%

R5de 60%

R5a R5b R5c R5d R5e

55

Gambar 4.16 Kromatogram KLT Hasil KKG Senyawa R5d dengan eluen etil asetat: n-heksana 60%

Fraksi 36-56 digabung menjadi satu fraksi dengan nilai Rf 0,35 c m,

diuapkan dan dimonitoring menggunakan KLT dengan eluen etil asetat: n-heksana

60%. Serbuk kuning kekuningan dicuci dengan menggunakan n-heksana yang

bertujuan untuk memisahkan pengotor. Pencucian ini tersebut menghasilkan

serbuk putih dan larutan berwarna kuning. Rekristalisasi dilakukan dengan cara

melarutkan serbuk putih pada diklorometana panas dan menambahkan n-heksana

pada suhu ruang. Kristal jarum yang terbentuk dan disaring sehingga didapatkan

kristal 40 mg.

Keterangan:

a. Me:Mc 5%

Ea:Mc 50%

Ea: Hx 95%

b. Hx:Ea 30%

Hx:Mc 40%

(a) (b)

Gambar 4.17 Kromatogram KLT Tiga Eluen (a) dan Kromatogram KLT 2D (b) Senyawa R5d

Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan sistem uji 3 eluen dengan

kepolaran yang berbeda dan KLT 2D. Tiga eluen yang digunakan yaitu

56

metanol:diklorometana(5%), et il asetat:diklorometana (50%) dan etil asetat: n-

heksana (40%). Ketiga eluen (Gambar 4.17a) menunjukkan nilai Rf yang berbeda

yaitu 0,80, 0,54 da n 0,3. H asil monitoring KLT menunjukkan adanya noda

tunggal pada ketiga eluen tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa kristal putih

tersebut terdiri dari satu senyawa atau senyawa tersebut sudah murni, didukung

juga dengan hasil KLT 2D yang memperlihatkan adanya noda tunggal seperti

pada Gambar 4.17b. Berdasarkan hasil uji monitoring KLT dapat disimpulkan

bahwa kristal tersebut merupakan senyawa tunggal, selanjutnya disebut dengan

dengan senyawa R5d. E lusidasi struktur senyawa R5d uj i dengan menggunakan

IR, 1H-NMR dan 13C-NMR.

4.4 Penentuan Struktur

4.4.1 Penentuan Struktur Senyawa R6b

Gambar 4. 18 Spektrum Inframerah (IR) Senyawa R6b

Senyawa R6b berupa padatan putih dengan berat 489 mg dengan titik leleh

sebesar 128-129°C. Senyawa ini diperoleh dari subfraksi R6b. Analisis spektra IR

denga plat KBr pada serapan bilangan 500- 4000 cm-1. Spektrum IR senyawa R6b

(Gambar 4.18) menunjukkan beberapa serapan pada νmaks 3412,1; 2949,2; 2877,8;

1707,0; 1641,4; 1465,9; 1381,0; 1300,0; 1274,9; 1249,9; 1182,4; 1122,6; 1085,9;

57

1016,5; 995,3; 968,3; 813,9; 692,4; 663,5 dan 601,8. D ata spektrum IR

memberikan serapan- serapan yang khas untuk beberapa gugus fungsi. Spektrum

IR memperlihatkan serapan melebar yang khas untuk gugus fungsi OH pada

panjang gelombang 3412 c m-1. Hal tersebut diperkuat dengan serapan pada

bilangan gelombang 1381 c m-1 yang menunjukkan adanya ikatan C-O. Gugus

C=O bebas ditunjukkan oleh serapan pada bilangan gelombang 1707 c m-1.

Serapan pada bilangan gelombang 2877 cm-1 dan 2949 cm-1 merupakan serapan

dari gugus C-H alifatik (sp3) yang diperkuat dengan adanya serapan pada 1465

cm-1. Adanya serapan pada bilangan gelombang 1641 cm-1 menunjukkan adanya

ikatan karbon rangkap dua (C=C sp2). Analisa spektrum IR memberikan informasi

bahwa senyawa R6b m emiliki gugus hidroksi, ikatan rangkap (C=C), gugus

karbonil (C=O) dan gugus alifatik (C-H sp3), ikatan (C=C sp2) bukan gugus

aromatic karena tidak ada serapan yang khas pada 3100 cm-1. Penentuan struktur

dilanjutkan dengan menggunakan 1H-NMR dan 13C-NMR.

Pengukuran NMR menggunakan frekuensi 500 M Hz dengan pelarut

metanol (CD3OD). Spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR yang berupa informasi

tentang lingkungan, jumlah dan jenis proton maupun karbon. Spektrum 1H-NMR

senyawa R6b m enunjukkan adannya 50 s ignal proton. Signal yang paling khas

terlihat pada pergeseran (δH) 9,88 (1 H, s) adalah signal khas dari gugus aldehid

(CHO). Tiga signal khas lainya yaitu pada pergesesran (δH) 3,55 (1H, brs), 4,00

(1H, d) da n 4.42 (1 H, dt) yang menunjukkan pergeseran dari alkohol. Proton

alifatik muncul pada pergeseran kimia (δH) 5,91 (1H, d, J= 5 Hz) dan 5,16 (1H, d,

J= 10 Hz).

Spektrum 13C-NMR menunjukkan adanya 30 s ignyal atom karbon pada

pergeseran kimia δC (ppm) 15,31 ; 18,13 ; 18,78 ; 19,26 ; 22,20 ; 23,30 ; 25,93 ;

26,01 ; 27,79 ; 28,66 ; 29,84 ; 30,28 ; 33,73 ; 35,60 ; 37,63 ; 42,27 ; 45,58 ; 46,74 ;

49,00 ; 50,83 ; 51,28 ; 52,05 ; 66,53 ; 66,89 ; 77,05 ; 123,95 ; 130,40 ; 133,41 ;

147,32 ; 209,72. Karbon pada pergeresan (δC) 209,72 ppm menunjukkan adanya

gugus aldehid (CHO), pergeseran 147,32 ; 133,4 ; 130.4 ; 123,95 menunjukkan

hibridisasi sp2 sedangkan pada pergeseran 66,53 ; 66,89 ; 77,05 m enunjukkan

adanya gugus hidroksi (OH).

58

Berdasarkan hasil IR dan NMR dapat diketahui bahwa kemungkinan

senyawa R6b yang memiliki jumlah karbon 30 memiliki gugus aldehid dan gugus

hidroksi yang telah ditunjukkan pada C-NMR dan spektrum IR. Penelusuran

literatur diketahui bahwa tanaman pare (M. charantia) telah banyak dilaporkan

mengandung senyawa- senyawa triterpenoid. Senyawa R6b juga memiliki ikatan

rangkap namun bukan merupakan gugus aromatik karena pada IR tidak

menunjukkan serapan yang khas pada gugus aromatik.

Tabel 4.6 Perbandingan Data 1H-NMR dan 13C-NMR Senyawa R6 (C DCl3) dengan Momordicine I (3,7,23-trihidroksi-kukurbita-5,24-dien-19-al)

Posisi Senyawa R6 Momordicine I δH (ppm) δC

(ppm) δH (ppm) δC

(ppm) 1. 22,2 22,2 2. 30,2 30,3 3. 3,55 (1H, brs) 77,0 3,55 (1H, brs) 77,1 4. 42,2 42,3 5. 147,3 147,3 6. 5,91 (1H, d, J= 5Hz) 123,9 5,91(1H, d, J=4 Hz) 124,0 7. 4,00 (1H, d, J= 5Hz) 66,8 4,00 (1H, d, J= 5,2 Hz) 66,9 8. 2,40 (1H, m) 50,8 2,40 (1H, m) 50,8 9. 52,0 52,1 10. 2,58 (1H, d, J= 10 Hz) 37,7 2,58 (1H, m) 37,7 11. 23,3 23,3 12. 29,8 29,8 13. 46,7 46,8 14. 49,0 49,0 15. 35,6 35,6 16. 28,6 28,6 17. 51,2 51,3 18. 15,3 15,3 19. 9,88 (1H, s) 209,7 9,88 (1H, s) 209,7 20. 1,96 (1H, m) 33,7 1,98 (1H, m) 33,7 21. 1,00 (3H, d, J= 5 Hz) 19,2 1,00 (3H, d, J= 6,4 Hz) 19,3 22. 45,5 45,6 23. 4,42 (1H, dt, J= 10 Hz) 66,5 4,41 (1H, dt, J=8,8 Hz) 66,6 24. 5,16 (1H, d, J= 10 Hz) 133,4 5,16 (1H, d, J=8,8 Hz) 133,4 25. 130,4 130,5 26. 1,70 (s) 18,7 1,70 (3H, s) 18,8 27. 1,67 (s) 26,0 1,68 (3H, s) 26,0 28. 25,9 25,9 29. 27,7 27,8 30. 18,1 18,1

59

Hasil analisis senyawa R6b memiliki kesamaan dengan senyawa 3,7,23-

trihisdroksi-kukurbita-5,24-dien-19-al (Momordicine I). Hal ini dapat ditunjukkan

dengan perbandingan pergeseran 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa R6b de ngan

senyawa momordicine I seperti terlihat pada Tabel 4.6. Kemiripan 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa R6b dengan senyawa Momordicine I sehingga dapat

disarankan senyawa R6b hasil isolasi dari ekstrak daun M. charantia adalah

senyawa Momordicine I. Struktur senyawa Momordicine I dapat dilihat pada

Gambar 4.19.

HOH

OH

OH

OHC1

2

34 5

6

7

8910

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

22

23

24

25

21 27

26

28 29

30

Gambar 4.19 Struktur 3,7,23-trihidroksi-kukurbita-5,24-dien-19-al dengan nama

lain Momordicine I

4.4.2 Penentuan Struktur Senyawa R5d

Senyawa R5d berupa kristal jarum putih dengan berat 40 mg senyawa ini

diperoleh dari fraksi R5d. T itik leleh senyawa R5d a dalah sebesar 160-161°C.

Analisis spektra inframerah (IR) dengan menggunakan plat KBr pada serapan

500-4000 cm-1. Spektrum IR senyawa R6b pa da Gambar 4.17 menunjukkan

beberapa serapan pada νmaks 3574,2; 3381,3; 2974,3; 2937,6; 2820,02; 1705,13;

1618,3; 1535,3; 1462,0; 1307,7; 1170,8; 1076,3; 1033,8; 1012,6; 991,4; 939,3;

752,2; 696,3; dan 422,4.

Spektrum IR (Gambar 4.20) memperlihatkan serapan yang khas dari

beberapa gugus fungsi diantaranya serapan pada bilangan gelombang 1705 cm-1

(1)

60

menunjukkan adanya gugus karbonil (C=O). Nilai serapan karbonil ini mengalami

pergeseran pada bilangan gelombang yang lebih kecil, dibandingkan dengan

serapan karbonil bebas. Serapan gugus hidroksi (OH) ditunjukkan pada bilangan

gelombang 3381 c m-1. Adanya gugus C-H sp3 ditunjukkan pada bilangan

gelombang 2887 cm-1 dan 2937 cm-1. Data spektrum IR ini memberikan informasi

bahwa senyawa R5d m emiliki gugus hidroksi, karbonil dan gugus alkil.

Penentuan struktur dilanjutkan dengan dengan menggunakan 1H-NMR dan13 C-

NMR.

Gambar 4.20 Spektrum Inframerah (IR) senyawa R5d

Hasil 1H-NMR menunjukkan pergeseran kimia sebanyak 50 proton. Proton

hidroksi muncul sebagai singlet pada pergeseran kimia (δH) 3,55 (s) dan 2,51 (bs).

Pergeseran khas metoksi muncul pada (δH) 3,13 (2H, s). Proton khas dari gugus

aldehid (CHO) muncul pada pergeseran kimia (δH) 9,74 (1 H, s). proton alifatik

juga muncul pada (δH) 5,89 (1H, d), 5,49 (1H, d) dan 5,38 (1H, d). Spektrum 13C

NMR menunjukkan adanya 30 signyal atom karbon pada pergeseran kimia δC

(ppm) 15,02 ; 18,04 ; 18,90 ; 21,33 ; 23,57 ; 25,53 ; 25,93 ; 26,24 ; 27,19 ; 27,57 ;

28,58 ; 29,12 ; 34,81 ; 36,22 ; 36,72 ; 39,49 ; 41,51 ; 45,44 ; 47,66 ; 47,94 ; 50,03 ;

50,39 ; 66,28 ; 75,01 ; 76,29 ; 123,98 ; 128,46 ; 136,98 ; 145,58 ; 208,08. Karbon

61

pada pergeresan (δC) 208,08 ppm menunjukkan adanya gugus aldehid (CHO).

Karbon pada pergeseran 145,58; 136,98; 128,46; 123,98 menunjukkan adanya

signal karbon dengan hibridisasi (C=C) sp2. Pergeseran 66,28; 76,29

menunjukkan adanya gugus alkohol (OH). Pada pergeseran 50,0 m enunjukkan

adanya gugus metoksi (OCH3) yang diperkuat oleh data 1H-NMR dengan

pergeseran sebesar δC 3,13. Dua puluh dua signal karbon yang lain yang terletak

diantara 15,02- 50,39 menunjukkan signal karbon dengan hibridisasi sp3.

Spektrum 13C-NMR senyawa R5d memiliki kemiripan dengan senyawa R6b yang

dapat dilihat pada Tabel 4 .7. Hasil uji C-NMR dari kedua senyawa yang telah

diisolasi (R6b dan R5d) menunjukkan adanya kemiripan pada pergeseran gugus

aldehid, hidroksi dan ikatan rangkap. Berikut adalah hasil perbandingan data C-

NMR dari senyawa R5d dan R6b (Tabel 4.7).

Tabel 4.7 Perbandingan data senyawa R5d (2) dengan senyawa R6b (1) 13C-NMR

No Senyawa R6b (1)

Senyawa R5d (2)

1. 22,2 21,3 2. 30,2 28,5 3. 77,0 76,2 4. 40,2 41,5 5. 147,3 145,5 6. 124,0 123,9 7. 66,8 66,2 8. 50,8 50,0 9. 52,0 50,3 10. 37,7 36,7 11. 23,3 23,4 12. 29,8 29,1 13. 46,7 45,4 14. 49,0 47,6 15. 35,5 34,8 16. 28,6 27,2 17. 51,2 47,9 18. 15,3 15,0 19. 209,7 208,0

62

OH

OHHO

OHC12

3 4 56

7

8910

1112

1314

15

16

17

18

19

20

21 2223

2425 26

27

28 29

30

OHHO

OHC12

3 4 56

7

8910

1112

1314

15

16

17

18

19

Senyawa R6b (Momordicine I)

Senyawa R5d

Gambar 4.21 Perbandingan struktur senyawa R6b dengan senyawa R5d

Kemiripan data 13C-NMR (Tabel 4.8) menunjukkan bahwa senyawa R5d

kemungkinan memiliki struktur dasar yang sama dengan senyawa R6b berupa

senyawa triterpenoid pada Gambar 4.22. Penelusuran literatur menunjukkan

jumlah dan jenis karbon senyawa R5d memiliki kemiripan dengan senyawa

3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al (Tabel 4.8). Berdasarkan

data 1H-NMR dan 13C-NMR jumlah karbon dan proton pada ssenyawa R5d

memiliki kemiripan data dengan senyawa 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-

5-23-dien-19-al (2) (Fatope et al, 1990).

HOH

OH

OHC

OCH3

1

2

34

5

6

78

910

11

12

1314

15

16

17

18

19

20

21 22

23

2425

26

27

28 29

30

Gambar 4.22 Struktur senyawa 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al

(2)

63

Tabel 4.8 Perbandingan 13C-NMR Senyawa R5d de ngan Senyawa 3β,7β-

dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al

13C-NMR Posisi

C Senyawa R5d Senyawa 3β,7β-dihidroksi-25-

metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al 1. 21,3 21,7 2. 28,5 29,9 3. 76,2 75,6 4. 41,5 41,7 5. 145,5 145,7 6. 123,9 124,2 7. 66,2 65,7 8. 50,0 50,5 9. 50,3 50,6 10. 36,7 36,8 11. 23,4 22,7 12. 29,1 29,4 13. 45,4 45,7 14. 47,6 48,2 15. 34,8 34,9 16. 27,2 27,7 17. 47,9 50,1 18. 15,0 15,0 19. 208,0 207,7 20. 36,2 36,3 21. 18,9 18,9 22. 39,4 39,7 23. 136,9 137,6 24. 128,4 128,4 25. 75 74,8 26. 26,2 26,4 27. 25,5 26,0 28. 25,9 26,2 29. 27,1 27,3 30. 18,0 18,1

OCH3 50,0 50,2

Kemiripan data struktur juga didukung oleh hasil NMR 2D yaitu

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) dan Homonuclear Multiple

Quantum Correlation (HMQC). Korelasi HMBC dapat memberikan informasi

korelasi jarak jauh antara proton dengan karbon tetangga, sehingga dapat

memberikan keputusan posisi atom hidrogen dan karbon yang lebih presisi

64

(Silverstain et al, 2005). P engukuran HMQC digunakan untuk mengetahui

korelasi karbon dengan proton yang dapat terikat langsung oleh karbon tersebut.

Korelasai antara data HMQC dan HMBC senyawa R5d dapat dilihat pada Tabel

4.9.

Tabel 4.9 Data C-NMR, HMQC dan HMBC senyawa R5d

Posisi C C-NMR HMQC HMBC 3 76,2 3,55 21,3 (C-1) , 145,5 (C-5) 7 66,2 2,51 50,0 (C-8),21,33 (C-1),

123,9 (C-6), 145,5 (C-5) 25 75,0 - 6 123,9 5,89 36,7 (C-10), 41,5 (C-4),

47,6 (C-17), 66,2 (C-7) 23 128,4 5,47 136,9 (C-24), 39,49 (C-

22), 75,0 (C-25) 24 136,9 5,39 ; 5,36 128,4 (C-23), 25,5 (C-

26), 39,4 (C-22), 75,0 (C-25)

5 145,5 - 8 50,0 1,47 45,4 (C-13) ,18,04(C-

30) 27,5 (C-16) 9 50,3 - 10 36,7 2,51 50,0 (C-8), 21,3(C-1),

123,9 (C-6), 145,5(C-5) 14 47,9 2,06 34,8(C-20), 45,4(C-13),

47,6(C-17) 17 47,6 - 13 45,4 - 4 41,5 - 22 39,4 2,16 ; 1,76 36,2 (C-15) ,18,9(C-21)

,136,9(C-24) 15 36,2 1,55 20 34,8 1,47 ; 1,50 45,5 (C-13) , 47,6 (C-

17) 27,5(C-16) 12 29,1 1,67 ; 1,66 15,0(C-18), 23,5(C-11) 2 28,5 1,60 ; 1,63 16 27,5 1,36 ; 1,34 45,4(C-13), 47,6 (C-

17), 50,0 (C-8) 29 27,1 1,04 41,5(C-4), 145,5(C-5),

76,2(C-3) 27 26,2 1,23 - 28 25,9 1,23 41,5(C-13) 26 25,5 1,22 26,2(C-27)

65

Lanjutan Tabel 4.9 Data 13C-NMR, HMQC dan HMBC senyawa R5d

Posisi C C-NMR HMQC HMBC 11 23,5 1,55 ; 2,25 29,1(C-12) 21 18,9 0,89 36,2(C-15), 39,4(C-22) 30 18,0 0,72 45,4 (C-13) 47,6 (C-17)

34,8(C-20) 18 15,0 0,87 47,6(C-17), 45,4(C-13),

50,0(C-8) 19 208,0 9,74

OCH3 50,0 3,13 75,0 (C-25)

Berdasarkan hasil uji HMQC dapat diketahui bahwa karbon pada

pergeseran 50,0 memiliki 2 proton pada pergeseran 1,47 dan 3,13 hal tersebut juga

telah dikonfirmasi melalui korelasi pada uji HMBC. Data korelasi HMBC proton

pada δH(ppm) 3,55 menunjukkan adanya korelasi pada pergeseran δC(ppm) 21,3

dan 145,5 sedangkan proton pada pergeseran δH(ppm) 2,51 j uga menunjukkan

adanya korelasi pada pergeseran δC(ppm) 21,3; 145,5; 50,0; 123,9. Berdasarkan

data tersebut dapat diketahui bahwa karbon pada pergeseran 145,5 dan 123,9

bertetangga dengan 36,7 dan 76,2. Berdasarkan HMQC menunjukkan bahwa pada

pergeseran δH(ppm) 3,55 menunjukkan korelasi dengan karbon δC(ppm) 76,2 yang

tersubstitusi gugus hidroksi sedangkan pada δH(ppm) 2,51 menunjukkan korelasi

dengan karbon metin δC(ppm) 50,3. Berdasarkan analisa korelasi tersebut, maka

korelasi partial 1 untuk senyawa R5d ditunjukkan pada Gambar 4.23.

OHHO

H

H

145,5

21,3

123,9

3,55 50,0

2,51

Gambar 4.23 Korelasi Parsial 1 Senyawa R5d

Proton δH(ppm) 5,89 be rdasarkan hasil HMQC menunjukkan korelasi

dengan karbon metin δC(ppm) 123,9 yang merupakan karbon C=C. Hasil HMBC

proton δH(ppm) 5,89 memiliki korelasi dengan 41,5; 36,7; 66,2 . Proton δH(ppm)

2.51 berdasarkan HMQC menunjukkan korelasi dengan karbon yang tersubstitusi

66

gugus hidroksi dengan δC(ppm) 66,2. Korelasi parsial 2 dapat dilihat pada

Gambar 4.24.

OHHO

H

HH

5,892,51

41,5

36,7

66,2145,5

50,0

Gambar 4.24 Korelasi Parsial 2 Senyawa R5d

Hasil HMBC proton δH(ppm) 2.51 memiliki korelasi dengan 145,5; 123,9;

50,0; 47,6. B erdasarkan analisa korelasi tersebut, maka korelasi partial 2 unt uk

senyawa R5d ditunjukkan pada Gambar 4.24. Proton pada δH(ppm) 5,39 dan 5,47

adalah proton khas untuk ikatan C=C dibuktikan dengan hasil korelasi HMQC

pada δC(ppm) 128,4 dan 136,9. Proton δH(ppm) 5,39 dan 5,47 m enunjukkan

adanya saling korelasi seperti pada Gambar, sehingga dapat membuktikan bahwa

karbon tersebut memang bertetangga. Berdasarkan HMBC δH(ppm) 5,39 dan 5,47

juga menunjukkan adanya korelasi dengan ka rbon yang tersubstitusi gugus

metoksi. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan hasil HMQC menunjukkan

δC(ppm) 75,0 berkorelasi dengan δH(ppm) 3,13. Proton δH(ppm) 3,13 a dalah

proton khas untuk gugus metoksi. Berdasarkan analisa korelasi tersebut, maka

korelasi parsial 3 untuk senyawa R5d ditunjukkan pada Gambar 4.25.

OCH3H

H

3,135,36

5,47

128,4

136,9

75,0

39,4

Gambar 4.25 Korelasi Parsial 3 Senyawa R5d

Berdasarkan data hasil korelasi HMQC dan HMBC yang diperoleh maka

senyawa R5d diberi nama 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al

dengan struktur pada Gambar 4.26. Senyawa 3β,7β-dihidroksi-25-metoksi-

67

kukurbita-5-23-dien-19-al (C31H50O4) adalah senyawa telah diisolasi dari daun M.

charantia (Fatope et al, 1990). Mulholland et al (1997) juga telah mengisolasi

senyawa yang sama dari daun M. foetida.

OCH3

HO

H

O

H

H

HH

OH

H

H

Gambar 4.26 Korelasi HMBC senyawa R5d (2)

Perbedaan kedua senyawa ini terletak pada posisi ikatan rangkap pada C-

22 dan C-25. Senyawa R6b (1) memiliki ikatan rangkap pada C-24 dan C-25,

sedangkan pada senyawa R5d (2) terletak pada C-23 dan C-24. Senyawa R6b (1)

mengandung tiga gugus hidroksi sedangkan senyawa R5d (2) mengandung dua

gugus hidroksi dan satu gugus metoksi pada C-25. Kedua senyawa tersebut

merupakan turunan triterpenoid dan merupakan senyawa khas dari tanaman M.

charantia. Kedua senyawa ini memiliki kepolaran yang sedikit berbeda hal

tersebut dikarenakan oleh perbedaan gugus fungsi yaitu antara gugus alkohol dan

metoksi. Senyawa hasil isolasi tersebut selanjutnya akan diuji aktivitas

antioksidan.

4.5 Aktivitas Biologis Senyawa yang telah diisolasi

4.5.1 Aktivitas Antioksidan

Metode ABTS (26) dan DPPH (24) digunakan untuk menentukan aktivitas

antioksidan terhadap senyawa yang telah diisolasi. Kedua metode ini memiliki

reaksi penghambatan radikal dengan adanya donor H+ atau elektron dari senyawa

(2)

68

antioksidan. Kemampuan senyawa untuk mereduksi radikal DPPH (24) dapat

dilihat melalui perubahan warna larutan DPPH (24) yang berwarna ungu menjai

kuning. Sedangkan metode ABTS (26) memiliki sensitivitas yang lebih tinggi jika

dibandingkan dengan DPPH (24). Perbedaan kedua metode tersebut yaitu uji

DPPH (24) berdasarkan kemampuan antioksidan mendonorkan hidrogen namun

pada uji ABTS (26) berdasarkan kemampuan senyawa antioksidan untuk

mendonorkan radikal proton (Chu et al., 2000).

Persentase penghambatan radikal DPPH dari fraksi dan senyawa

momordicine I (1) dapat dilihat pada Gambar 4.27. Fraksi R m enunjukkan

aktivitas penghambatan yang lebih tinggi sebesar 21,12±0,02% dibandingkan

dengan senyawa momordicin I (1) menunjukkan aktivitas penghambatan sebesar

5,51±0,02% pada konsentrasi 319 µg/mL.

Gambar 4. 27 Aktivitas Penghambatan Radikal DPPH dari Senyawa Momordicine I (R6b), Fraksi R dan Asam galat (kontrol positif).

Persentase penghambatan radikal kation ABTS dari fraksi dan senyawa

momordicine I (1) dapat dilihat pada Gambar 4.28. Fraksi R m enunjukkan

aktivitas penghambatan yang lebih tinggi sebesar 40,28±0.04% dibandingkan

dengan senyawa momordicine I (1) menunjukkan aktivitas penghambatan sebesar

36,76±0,03% pada konsentrasi 319 µg/mL (Gambar 4.28).

0

20

40

60

80

100

Fraksi R Momordicine I (R6b)

Asam Galat

Peng

ham

bata

n (%

)

69

Senyawa R5d (2) tidak dapat diuji antioksidan karena jumlahnya yang

sangat terbatas, namun apabila dilihat dari hasil uji pada fraksi dapat disimpulkan

bahwa senyawa R5d juga tidak aktif sebagai antioksidan. Fraksi dan kedua

senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat rendah jika

dibandingkan dengan kontrol positif. Kontrol positif yang digunakan yaitu asam

galat dengan nilai IC50 DPPH (24) 2,24 µg/mL dan ABTS (26) 1,36 µg/mL.

Gambar 4.28 Aktivitas Penghambatan Radikal Kation ABTS dari Senyawa Momordicine I (R6b), Fraksi R dan Asam galat (Kontrol positif)

0

20

40

60

80

100

Fraksi R Momordicine I (R6b)

Asam Galat

Peng

ham

bata

n (%

)

70

“halaman ini sengaja dikosongkan”

81

LAMPIRAN A: SKEMA KERJA

A. Skrining

Serbuk kering Tanaman*

(10 mg)

- Pelarutnya diuapkan dengan rotary evaporator.

- Dimaserasi dengan metanol 40 mL 1 x 24 jam

Ekstrak Tanaman*

Ekstrak pekat Tanaman*

Uji aktivitas antioksidan

Data

% Penghambatan

Uji DPPH Uji ABTS

82

B. Isolasi dan penentuan Struktur

- dimaserasi dengan 10 L metanol 3 x 24 jam

- diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator

Serbuk kering daun Pare (970 gram)

Ekstrak cair Residu

Ekstrak MeOH pekat (50 gram)

- difraksinasi dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan diklorometana (100%), etil asetat (100%) dan metanol.(100%).

- dimonitoring dengan KLT - digabungkan berdasarkan kesamaan Rf pada noda KLT

Fraksi P

(3,169 gr)

Fraksi Q

(1,774 gr)

Fraksi R

(9,386 gr)

Fraksi S

(1,925 gr)

Fraksi T

(17,937 gr)

Difraksinasi lebih lanjut dengan metode

KCV dengan menggunakan n-heksana:etil

asetat( 5%-40%), etil asetat 100%.

58 Fraksi

14 Fraksi

83

C. Fraksinasi fraksi R5 dan Isolasi Senyawa R5d

Fr R2

(1,779 gr)

Fr R4

(0,623 gr)

58 Fraksi

Dimonitoring KLT menggunakan eluen etil

asetat: n-heksana 50%

Fr R1

(0,485 gr)

Fr R3

(0,339 gr) Fr R6

(4,754 gr)

Fr R5

(0,825 gr)

Fr R5

(0,825 gr)

Difraksinasi lebih lanjut (KCV) dengan

menggunakan eluen n-heksana:etil asetat

(100:0 0:100)

48 Fraksi

R5a

(208,6 mg) R5e

(201,3 mg) R5c

(109 mg)

R5d

(450,2 mg)

R5b

(151,2 mg)

Dimonitoring KLT menggunakan eluen

etil asetat: n-heksana 50%,

84

(3β,7β-dihidroksi-25metoksi-kukurbita-5-23-dien-19-al)

R5d

(450,2 mg)

Dimurnikan dengan KKG (tinggi dan diameter

kolom, 10 cm, 0,7 cm) menggunakan eluen etil

asetat: n-heksana (0:100 60:40), etil asetat

100%.

Kristal putih

kehijauan

Diuji kemurnian dengan KLT

3 eluen dan 2D

Dilakukan penentuan struktur

dengan IR, H-NMR, C-NMR,

Direkristalisasi dengan menggunakan

diklorometanan dan n-heksana.

Kristal putih

kehijauan (40 mg)

HOH

OH

OHC

OCH3

85

D. Fraksinasi fraksi R6 dan Isolasi Senyawa R6b

3,7,23-trihidroksi-kukurbita-5-24-dien-19-al (Momordicine I)

Persen Penghambatan: DPPH (5,51±0,02%) dan ABTS (36,76±0,03%)

Fr R6

(4,754 gr)

Difraksinasi lebih lanjut dengan metode

KCV dengan menggunakan eluen n-

heksana: etil asetat (100:0 30:70)

58 Fraksi

Dimonitoring KLT menggunakan eluen n-

heksana: etil asetat (60%) , fraksi dengan

Rf yang sama digabung.

Fr R6a Fr R6b

(638 mg) Fr R6c

Dievaporasi dan di monitoring

KLT

Serbuk putih

Direkristalisasi dengan menggunakan

n-heksana dan diklorometana.

Serbuk putih (400 mg)

- Diuji kemurnian dengan

KLT 3 eluen dan 2D

- Dilakukan penentuan

struktur dengan IR, H-NMR,

C-NMR,

Uji antioksidan HO

HOH

OH

OHC12

34 5

6

7

8910

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

22

23

24

25

21 27

26

28 29

30

86

E. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH

F. Uji Aktivitas Antioksidan Metode ABTS

- dilarutkan dalam 1 mL DMSO

Larutan blanko : 1 mL DPPH + 33 µL MeOH Kontrol positif : Asam galat

- dilarutkan dalam 1 mL MeOH Larutan Sampel

10 mg Sampel

- diambil sebanyak 33 µL - ditambah 1 mL larutan DPPH (319 ppm) - divortex mixer - diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 meni - diukur absorbansinya pada λ 515 nm

Data Absorbansi

% Penghambatan

- dihitung persen penghambatannya

Larutan blanko : 1 mL ABTS (25) + 10 µL DMSO

Larutan Sampel

10 mg Sampel

- diambil sebanyak 10 µL - ditambah 1 mL larutan ABT (99 ppm) - divortex mixer - diinkubasi pada suhu 30ºC selama 4 menit - diukur absorbansinya pada λ 734 nm

Data Absorbansi

% Penghambatan

- dihitung persen penghambatannya

87

LAMPIRAN B: SPEKTRA NMR

1. Spektra H-NMR Senyawa (2)

2. Spektra C-NMR Senyawa (2)

88

3. Spektra H-NMR Senyawa Momordicine I (1)

4. Spektra C-NMR Senyawa Momordicine I (1)

89

5. Data HMQC Senyawa (2)

6. Data HMBC Senyawa (2)

90

7. Data Penghambatan DPPH dari Ekstrak Daun M. charantia

8. Aktivitas Penghambatan Radikal DPPH dari Ekstrak Etil asetat

0 10 20 30 40 50 60 70 80

MeOH EA MC Hx

Peng

ham

bata

n (%

) Penghambatan DPPH

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsentrasi µg/mL

91

9. Data Antioksidan

A. Uji ABTS 4 ekstrak daun pare

EKSTRAK DAUN PARE Blangko MeOH EA MC Hx Abs 1 0.721 0.238 0.216 0.456 0.485 Abs 2 0.726 0.239 0.212 0.452 0.481 Abs 3 0.718 0.234 0.215 0.451 0.482 Rata2 0.722 0.237 0.214 0.453 0.483 Inhibisi (%) 67.159 70.300 37.229 33.118 SD 0.004 0.003 0.002 0.003 0.002

• Perhitungan IC50 ekstrak metanol daun pare

EKSTRAK METANOL DAUN PARE

Blangko Konsentrasi 319.46 159.73 78.86 39.93 19.97 9.98

0.721 0.238 0.265 0.305 0.331 0.383 0.418 0.726 0.239 0.262 0.301 0.333 0.382 0.419 0.718 0.234 0.275 0.303 0.329 0.378 0.421 0.722 0.237 0.267 0.303 0.331 0.381 0.419

Inhibisi (%) 67.159 62.956 58.014 54.134 47.206 41.894 SD 0.002 0.006 0.002 0.002 0.002 0.001

y = 7.3177(x) + 25.725 R² = 0.9985

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsemtrasi μg/mL

92

Perhitungan IC50 Ekstrak metanol daun pare:

y = 7,3177 ln(x) + 25,725

50 = 7,3177 ln(x) + 25,725

x = 27,58 (IC50)

• Perhitungan IC50 ekstrak etil asetat daun pare

LIAN EA

Blangko Konsentrasi 319.46 159.73 78.86 39.93

0.721 0.216 0.318 0.425 0.496 0.726 0.212 0.307 0.428 0.492 0.718 0.215 0.319 0.421 0.498 0.722 0.214 0.315 0.425 0.495

Inhibisi (%) 70.300 56.397 41.155 31.363 SD 0.002 0.007 0.004 0.003

Perhitungan IC50:

y = 19,443lnx – 42,192

50 = 19,443lnx – 42,192

x = 114,54 (IC50)

y = 19,443lnx -42,192 R² = 0.9883

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsentrasi μg/mL

93

B. Uji DPPH 4 ekstrak daun pare

EKSTRAK DAUN PARE Blangko MeOH EA MC Hx Abs 1 0.430 0.248 0.152 0.273 0.332 Abs 2 0.426 0.257 0.143 0.253 0.316 Abs 3 0.428 0.258 0.146 0.251 0.314 Rata2 0.428 0.254 0.147 0.259 0.321 Inhibisi (%) 40.576 65.654 39.486 25.078 SD 0.002 0.006 0.005 0.012 0.010

EKSTRAK EA DAUN PARE

Blangko Konsentrasi 319.46 159.73 78.86 39.93 19.97 9.98

0.614 0.231 0.361 0.468 0.522 0.562 0.583 0.614 0.229 0.373 0.47 0.525 0.563 0.583 0.621 0.225 0.362 0.468 0.524 0.565 0.577 0.616 0.228 0.365 0.469 0.524 0.563 0.581

Inhibisi (%) 62.953 40.725 23.959 15.035 8.599 5.733 SD 0.007 0.001 0.002 0.002 0.003

Perhitungan IC50

y = -0,0004x2 + 0,3139x +1,2959

50 = -0,0004x2 + 0,3139x + 1,2959

X = 211 (IC50)

y = -0,0004x2 + 0,3139x + 1,2959 R² = 0,9974

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350

Peng

ham

bata

n (%

)

Konsentrasi µg/mL

94

C. Persen Inhibisi Senyawa 1 dan Fraksi

UJI ABTS Blangko MeOH Fraksi R S1 Abs 1 0.721 0.238 0.419 0.458 Abs 2 0.726 0.239 0.417 0.453 Abs 3 0.718 0.234 0.457 0.458 Rata2 0.722 0.237 0.431 0.456 Inhibisi (%) 67.159 40.277 36.767 SD 0.004 0.003 0.003 0.003

71

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil skrining dan uji pendahuluan daun pare (M. charantia)

dipilih untuk isolasi senyawa. Ekstrak metanol daun pare (M. charantia) memiliki

aktivitas penghambatan radikal kation ABTS (26) dengan nilai IC50 sebesar 27,58

µg/mL. Isolasi senyawa dari ekstrak metanol daun pare menghasilkan dua

senyawa yaitu 3,7,23-trihidroksikukurbita-5,24-dien-19-al atau momordicine I

(29) dan 3β,7β-dihidroksi-25metoksi-kukurbita-5,23-dien-19-al (30) yang

diisolasi dari fraksi R. Uji aktivitas antioksidan fraksi R menunjukkan

penghambatan pada DPPH (23) sebesar 21,12±0,02% dan pada radikal kation

ABTS (25) sebesar 40,28±0,04%. Senyawa 3,7,23-trihidroksikukurbita-5,24-dien-

19-al (30) menunjukkan penghambatan pada DPPH (23) 5,51%±0,02% dan pada

ABTS (25) 36,76±0,03%. Nilai tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan asam

galat sebagai kontrol positif dengan nilai IC50 2,24 µg/mL untuk radikal DPPH

(23). Berdasarkan uraian diatas maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak metanol

daun pare berpotensi sebagai sumber senyawa bahan alam yang memiliki aktivitas

sebagai antioksidan tetapi tidak ditemukan senyawa baru pada tahap isolasi

senyawa.

5.2 Saran

Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan untuk mengisolasi senyawa- senyawa

yang aktif sebagai antioksidan.

72

“halaman ini sengaja dikosongkan”

73

DAFTAR PUSTAKA

Abena, A.A., Gbenou, J.D., Yayi, E., Moudachirou, M., Ongoka, R.P., Quamba, J.M., Silou, T. (2007), "Comparative Chemical and Analgesic Properties of Essensial Oil of Cymbopogon nardus Redle of B enin and Congo", Journal of Altern, 4, 267-272.

Akowuah, G.A., Sadikun, A., Mariam, A. (2002), "Flavonoid Identification and Hypoglycaemic Studies of the Butanol Fraction from Gynura procumbens", Journal of Pharmaceutical Biology, 40(6), 405-410.

Alfarabi, M., Bintang, M., Muhamad., Suryani., Safitri, M., (2010), "The Comperative Ability of Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation and Free Radical Scavenging" Journal of hayati, 17, 201-204.

Ali, M. dan Mahalwal, V.S . (2003), "Volatile Constituents of Cymbopogon nardus (Linn.)" Journal of flavour and fragrance, 18, 73-76.

Anand, T., Naika, M., Kumar, P., Khanum, F. (2010), "Antioxidant and DNA Damage Preventive Properties of Centella asiatica" Journal of Pharmocology 2, 53-58.

Andarwulan, N., Batari, R., S andrasari, D.A., Bolling, B., Wijaya, H. (2010), "Flavonoid Content and Antioxidant Activity of V egetables from Indonesia" Journal of Food and Chemistry, 121, 1231-1235.

Arawbewela, L., Arawwawala, M., Rajapaksa, D. (2006), "Piper betle: a Potential Natural Antioxidant" International Journal of Food Science and Technology, 41, 10-14.

Ariffin, F., Chew, S.H., Bhupinder, K., Karim, A.A., Huda, N. (2011), "Antioxidant Capacity and Phenolic Composition of Fermented Centella asiatica Herbal Teas" Journal of society and chemical industry, 91, 2731-2739.

Ashraf, A., Adilsarfraz, R., Ra shid, M.A., Shahid, M. (2014), "Antioxidant, Antimicrobial, Antitumor, and Cytotoxic Activities of An Important Medicinal Plant (Euphorbia royleana) from Pakistan" Journal of food and drug analysis, 25, 1-7.

74

Bazma, A.A., Zakaria, Z., Latha, L.Y., Sasidharan, S. (2011), "Antioxidant Activity and Phytochemical Screening of the Methanol Extract of Euphorbia hirta" Journal of Asian Fasific Tropical Medicine, 4, 386-390.

Bing, L., Guo-cai, W., Ji, Y., Mao-xin, Z., Guang-wen, L. (2008), "Antifeedant Activity and Active Ingredient Againts Plutella xylostella from Momordica charantia Leaves." Journal of Aglicultural Science, 7(12), 1466-1473.

Cao, J.Q., Zhang, Y., Cusi, J.M., Zhao, Y.Q. (2011) . "Two New Cucurbitane Triterpenoids from Momordica charantia L." Journal of Chinese Chemical Letters, 22, 283-286.

Cos, P., Hermans, N., Calomme, M.,(2003), "Comparative study of eight well

known polyphenolic antioxidant", Journal of Pharm Pharmacol, 55, 1291-

1297

Chu, Y.H., Chang, C.L., Hsu, H.F., (2000) "Flavonoid Content of S everal

Vegetables and Thier Antioxidant Activity." Journal of the science of food Agliculture, 6, 561-566.

Deo, B., Nath, M., Nayak, P.K., Dhal, Y., (2013). "Evaluation of Antioxidant Activity of Ocimum tenuiflorum an Important Medicinal Herb." International Journal of Plant, Animal and Environmental, 3, 150-154.

Emrizal., Fernando, A., Yuliandari, R., Rullah, K., Indrayani, N.R., Susanty, A., Yerti, R., A hmad, F., Sirat, H,M., dan Arbian, D., (2014), "Cytotoxic Activities of Fractions and Two Isolated Compounds from Sirih merah (Indonesian Red betle), Piper crocatum," Journal of Procedia Chemistry, 13, 79-84.

Fatope, M.O., Takeda, Y., Yamashita, H., Okabe, H., Yamauchi, T., (1990) . "New Cucurbitane Triterpenoids from Momordica charantia." Journal of Natural Product, 53(6), 1491-1497.

Fesenden, R.J., dan Fesenden, J.S., (1992), Kimia Organik, Edisi ketiga Jilid 1. Erlangga, Jakarta

Gritter, R.J., Bobbit, J.M., dan Schwarting, A.E., (1991), Pengantar Kromatografi, Edisi kedua. ITB, Bandung

75

Harbone J.B., (1987) Metode fitokimia: Penentuan cara moderen menganalisis tumbuhan, terbitan kedua terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwan Soediro, ITB Press, Bandung

He, QP., Ma, L., Lou, JY., He, FY., Lou, LG. dan Hu, LH. (2007),"Cytotoxic Withanolides from Physalis angulata L." Journal of Biochemistry and Biodiversity, 4, 443-449.

Hseu, YC., Wu, CR., Chang, HW., Kumar, K.J.S., Lin, MK., Chen, CS., Cho, HJ., Huang, CY., Lee, HZ., Hsieh, WT., Chung, JC., Wang, HM., Yang, HL., (2011),"Inhibitory Effects of Physalis angulata on Tumor Metastasis and Angiogenesis", Journal of Ethnopharmacology, 135, 762-711.

Kaewseejan, N., Sutthikhum, V., dan Siriamornpun, S., (2015),"Potential of Gynura procumbens Leaves as Source of Flavonoid-enriched Fractions with Enhanced Antioxidant Capacity" Journal of functional food, 12, 120-128.

King F.D.(1994), Medicinal Chemistr: principle and practice . Cambridge: The royal of society of chemistry

Kpoviessi, S., Bero, J., Agbani, P., Gbaguidi, F., Kpoviessi B.K., Sinsin, Brice., Accrombessi, G., Frederich, M., Moudachirou, M., dan Joelle, QL., (2013),"Chemical Composition, Cytotoxicity and In vitro Antitrypanosomal and Anti Plasmodial Activity of the Essential Oils of four Cymbopogon Species from Benin" Journal of Ethnopharmacology, 151, 652-659.

Krishnaiah, D., Sabatyl, R., N ithyanandam, R., (2011) "A Review of the Antioxidant Potential of Medicinal Plant Species" Journal of Food and Bioproduct Processing , 89, 217-233.

Kubola, J,. dan Siriamornpun, S., (2008),"Phenolic Contents and Antioxidant Activities of Bitter Gourd (Momordica charantia) Leaf, Stem, and Fruit Fraction Extract In Vitro" Journal of food and chemitry,110, 881-890.

Kumar, V., Anwar, F., Ahmed, D., Verma, A., Ahmed, A., Damanhouri, Z.A., Mishra, V., Ramteke, P.W., Bhatt, P.C., dan Mujeeb, M,. (2014), "Paederia foetida Linn. Leaf Extract: an Antihyperlipidemic, Antihyperglycemic, and Antioxidant", Journal of Complementary and Alternative Medicine, 14:76, 1-16.

76

Liu, C.H., Yen, M.H., Tsang, S.F., Gan, K.H., Hsu, H.Y., (2010) "Antioxidant Triterpenoid From the Stems of Momordica charantia." Journal of Food Chemistry, 118, 751-756.

Mahomoodally, M.F., Fakim, A.G., Subratty, A.H., (2007), "Effect of exogenous ATP on Momordica charantia Linn. (Cucurbitaceae) Induced Inhibition of D-glucose, L-tyrosine and Fluid Transport Across Rat Everted Intestinal Sacs In Vitro", Journal of Ethnopharmacology, 110, 257-263.

Matsuda, H., Morikawa, T., Ueda, H., dan Yishikawa, M., (2001), "Inhibitors of Aldose Reductase and New Triterpen and its Oliglycoside, Centellasapogenol A and Centella asiatica (Gotu Kola)", Journal of Heterocycles, 55(8), 257-263.

Matsuur, H., Asakawa, C., Kurimoto, M., dan Mizutani, (2002), "Alpha-glucosidase Inhibitor from the Seeds of Balsam Pear (Momordica charantia) and the Bodies of Grifola frondasa", Journal of Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 17(3), 1576-1578.

Molyneux, P., (2004), "The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity" Journal of Science and Tekhnology, 26(2), 212-219.

Mulyono, N., Lay, B.W., Ocktreya, L., dan Rahayu, S., (2013), "Antidiarrheal Activity of Apus Bamboo (Gigantochoa apus) Leaf Extract and its Bioactive Compounds", American Journal of Microbiology, 4, 1-13.

Munim, O., Negishi, O., Ozawa, T., (2003) "Antioxidative compound from Crotolaria sessiliflora Biosci ." Journal of Biotech Biochem 67, 410-414.

Newman, D.J., Cragg, G.M., Snader, K.M., (2000) "The influence of n atural product ." Journal Of Natural Product, 17, 215-234.

Ohtsuki, T., Yokosawa, E., Koyano, T., Preeprame, S., Kowithayakorn, T., Sakai, S., Toida, T., dan Ishibashi, M., (2008), "Quinic Acid Esters from Pluchea indica with Collagenas, MMP-2 dan MMP-9 Inhibitory Activities", Journal of Phytoteraphy Resesearch, 22, 264-266.

Padmaja, K., Aswar, U., Bodhankar, S., Sinnathambi, A., Mohan, V., dan Thakurdesai, P., (2012), "Antidepresant Effect of Standardized Extract of Centela asiatica in Olfactory Bulbectomy Model", Journal of Biomedicine and Aging Pathology, 2, 48-53.

77

Pan, Y., Abd-Rashid, B.A., Ismail, Z., Ismail, R., Mak, J.W., Pook, P.CK., Er, H.M., Ong, C.E., (2011),"In Vitro Modulatory Effects of A ndrographis paniculata, Centella asiatica and Orthsiphon stamineus on Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19)", Journal of Ethnopharmacology, 133, 81-887.

Pavia, D.L., dan Kniz, J.R., (1990). Introduction to Organic Laboratory Teqniques a Contempory Approach edisi kedua. Saunders College Publising, New York.

Peng, L., Jian-Feng, L., Li-Ping, K., He-Shui, Y., Li-Juan, Z., Xin-Bo, S., Bai-Ping, M., (2012) "A New C30 Sterol Glycoside from the Fresh Fruits of Momordica charantia." Journal of Chinese Natural Medicines, 16(2), 0088-0091.

Perumal, S., Mahmud, R., P illai, S., Lee, W.C., dan Ramanathan, S., (2012), "Antimicrobial Activity and Cytotoxicity Evaluation of Euphorbia hirta extracts from Malaysia" Journal of APCBEE Procedia, 2, 80-85.

Ragasa, C.Y., dan Cornelio, K.B., (2013), "Triterpenes from Euphorbia hirta and their cytotoxicity." Journal of Chinese Natural Medicines,11, 528-533.

Rub, R.A., Patil, M.J., Ghorpade, P., dan Siddiqui, A., (2013), "Evaluation of Antioxidant Potential of Celosia argentea Extracts." Journal of Pharmacognosy ,3, 140-141.

Seow, LY., Beh, HK., Masjid, A.M.S.A., dan Murugaiyah, V., (2011), "Anti-angiogenic Activity of Gynura segetum Leaf Extracts and its Fractions" ,Journal of Ethnopharmacology, 134, 221-227.

Seow LY., Beh, HK., Umar, M.I., Sadikun, A., dan Asmawi, M.Z. (2014),"Anti-inflammatory and Antioxidant Activities of the Methanol Extract of Gynura segetum" Journal of International Immunopharmacology, 23, 186-191

Silverstein, R.M., Basser, G.C., dan Moril, T.C., (1998), " Spectrometric Identification of Organic Compounds", fiftth edition Jhon Willey and Son Inc, Canada

Singh, P.R., Gupta, D.S., dan Bajpaj, K.S., (1990), "Experimental Organic Chemistry", Mac Graw Hill, New Delhi

78

Singh, A., Singh, S.P., dan Bamezai, R., (1998), "Momordica charantia (Bitter Gourd) Peel, Pulp, Seed and Whole Fruit Extract Inhibits Mouse Skin Papillomagenesis" Journal of Toxicology Letters, 94, 37-46.

Skoog, D.A., Holler, F.J., dan Nieman, T.A., (1998), Principle of Instrument analysis, Thomson Learning Inc, Singapore

Susetyarini E., (2011), Khasiat beluntas sebagai anti fertilitas (Uji pre-klinis) [Pluchea indica as anti-fertility (pre-clinical test)]. UM Press, Malang

Svehla G., (1990), "Buku teks Analisis Anorganik kualitatif makro dan mikro, edisi kelima", Kalman Media Pustaka, Jakarta

Tapan, E., (2005), "Kanker, Antioksidan dan Terapi Komplemente", PT Elex Media Komputindo, Jakarta

Tengah, I.G.P., (1995), "Studi tentang Inventarisasi, Determinasi dan Cara penggunaan Tanaman Obat ". Puslitbang Farmasi, Balitbang Kesehatan RI, Jakarta

Unchiyama, T., Miyase, T., Ueno, A., dan Usmanghani, K., (1989), "Terpenic Glycoside from Pluchea indica", Journal of Phytochemistry, 28, 3369-3372.

Underwood, A.R., Day, J.R., dan R.A., (1986), Analisa Kimia Kuantitatif edisi kelima. Erlangga, Jakarta

Upadhyaya S., (2013), "Screening of phytochemicals, nutritional status, antioxidant and antimicrobacterial activity of Paederia foetida L from different location", Journal of pharmacology research, 7,139-141.

Wu, Q.B., Wang, Y., Liang, L., Jiang, Q., Guo, M.L., dan Zhang, J.J., (2013) "Novel Triterpenoid Saponins from the Seeds of Celosia argenta" Journal of Natural Product, 27(15) 1353-1360.

Yi, W., Wei, Q., Di, G., Jiang-Yu, L., dan Yang-Li, L., (2012), "Phenols and Flavonoids from the Aerial Part of Euphorbia hirta" Journal of Chinese Natural Medicines, 10, 40-42.

Yuniarti T., (2008), "Ensiklopedia tanaman obat tradisional". Med Press, Yogyakarta

79

Zainol, M.K., Abd-Hamid, A., Yusof, S., dan Muse, R., (2002), "Antioxidative Activity and Total Phenolic Compound of Leaf, Root, and Petiole of Four Accessions of Centella asiatica " Journal of Food and Chemistry, 81, 575-581.

Zhu, BR., Pu, SB., Wang, K.D.G., Xu, DR., dan Zhou, HH., (2013), "Chemical Constituents of the Aerial Part of Gynura segetum", Journal of Biochemical Systematics and Ecology, 46, 4-6.

Zurowska, D.M., dan Wenta, W., (2012), "A Comparation of ABTS and DPPH Methods for Acessing the Total Antioxidant Capasity of Human Milk" Journal of Technol Aliment,11(1), 83-89.

80

“halaman ini sengaja dikosongkan”

95

BIODATA PENULIS

Penulis dilahirkan di Singaraja 18 Maret 1991,

merupakan anak pertama dari 3 be rsaudara. Penulis

adalah lulusan SMAN 2 Singaraja (2006-2009). Penulis

melanjutkan kuliah S1 (2009-2013) di Jurusan

Pendidikan Kimia Universitas Pendidikan Ganesha Bali

dan melanjutkan kuliah S2 (2014-2016) di Jurusan

Kimia, Institut Teknologi Sepuluh November Surabaya.

Penulis mengambil bidang studi Kimia Organik Bahan

Alam dibawah bimbingan Sri Fatmawati M.Sc., Ph.D.

dan Prof. Dr. Taslim Ersam.