22

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan menggunakan

metode post test only control group design.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan Desember 2017 hingga Januari

2018 selama kurang lebih 36 hari.

4.3 Populasi dan Sampel

4.3.1 Populasi

Populasi penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar

dewasa.

4.3.2 Sampel

Sampel diambil secara random dari populasi tikus putih (Rattus

novergicus) strain wistar jantan sebagai hewan coba. Sampel terdiri atas

4 kelompok.

4.3.3 Besar Sampel

Estimasi besar replikasi yang digunakan pada penelitian ini adalah

dengan rumus berikut:

(r – 1)(p – 1) ≥ 15

(r – 1)(4 – 1) ≥ 15

23

4r – 3 ≥ 15

r ≥ 4,5 (Supranto, 2007)

Keterangan:

p = perlakuan

r = jumlah replikasi perlakuan

Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 5

ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang

digunakan adalah 20 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 2 ekor

tikus cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati

saat proses adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total

tikus yang digunakan adalah 28 ekor tikus.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan teknik

pengambilan sampel simple random sampling.

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

a. Kriteria Inklusi Tikus Putih

1) Umur 2-3 bulan

2) Berat badan 150 – 250 gram

3) Jantan, strain wistar

4) Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang

tebal berwarna putih serta matanya jernih.

24

b. Kriteria Eksklusi

Tikus yang tidak mau makan, kondisinya menurun atau mati selama

adaptasi

c. Kriteria Drop Out

Tikus yang tidak mau makan, kondisinya menurun atau mati selama

perlakuan.

4.4 Variabel dan Definisi Operasional

4.4.1 Variabel Bebas

Ekstrak Kulit Jeruk Lemon

4.4.2 Variabel Tergantung

Kadar trigliserida pada tikus putih jantan (Rattus novergicus strain

wistar).

4.5 Definisi Operasional

No. Variabel Definisi

Operasional

Alat Ukur Hasil

Ukur

Skala

Ukur

1. Ekstrak

kulit jeruk

lemon

(Citrus

limon)

Ekstrak kulit

jeruk lemon

adalah ekstrak

kulit jeruk lemon

kering yang

dimaserasi

menggunakan

sistem pelarut

etanol 96% dan

aseton dengan

dosis 125

mg/kgBB, 250

Timbangan mg/kgBB Kategorik

25

mg/kgBB dan

500 mg/kgBB

2. Kadar

Trigliserida

Kadar trigliserida

tikus putih

(Rattus

novergicus strain

wistar)

Menggunakan

rumus

mg/dL Numerik

4.6 Bahan dan Instrumen Penelitian

4.6.1 Bahan

a. Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon)

b. Induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gram BB atau sama

dengan 0,3 – 0,4 ml peroral (Sutejo dan Dewi, 2012)

c. Reagen untuk pemeriksaan kadar trigliserida

d. Diet pakan tikus BR-1

e. Kloroform

4.6.2 Instrumen

a. Alat Pemeliharaan Tikus

1) Kandang tikus

2) Penutup kandang dari anyaman kawat

3) Botol air

4) Timbangan

5) Tempat makan tikus

b. Alat Pembedahan Tikus

1) Gunting

2) Pinset

26

3) Botol sediaan

4) Handscoon

5) Pengait jaringan

6) Pisau bedah

c. Alat lain

1) Sonde

2) Kamera digital

3) Spuit injeksi 3 ml

4) Label

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Pembagian Kelompok Tikus

Tikus yang digunakan dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan

5 ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang

digunakan adalah 20 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 2 ekor

tikus cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati

saat proses adaptasi atau penelitian, sehingga dalam penelitian ini total

tikus yang digunakan adalah 28 ekor tikus.

a. Kontrol positif: diberikan induksi minyak goreng deep frying selama

14 hari tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk lemon, kemudian diberi

pakan standar pada 15 hari berikutnya.

b. Kelompok 1: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gr

BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon

sebanyak 25 mg/ekor/hari selama 15 hari

27

c. Kelompok 2: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gr

BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon

sebanyak 50 mg/ekor/hari selama 15 hari

d. Kelompok 3: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1ml/100gr

BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon

sebanyak 100 mg/ekor/hari selama 15 hari

4.7.2 Adaptasi

Proses adaptasi hewan coba dalam kandang dilakukan selama 7 hari

dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang

baru.

4.7.3 Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Jeruk Lemon

Dosis yang dipakai menurut Muhtadi dalam National Journal of

Physiology, Pharmacy and Pharmacology (2015) adalah 125 mg/kgBB,

250 mg/kgBB dan 500 mg/kgBB. Berat tikus adalah sekitar 150 - 200 gr

sehingga ekstrak kulit jeruk lemon yang diberikan yaitu:

Dosis I = 125 mg/kgBB x (0,15 - 0,2) = 18, 75 - 25 mg/ekor/hari

Dosis II = 250 mg/kgBB x (0,15 - 0,2) = 37,5 - 50 mg/ekor/hari

Dosis III = 500 mg/kgBB x (0,15 - 0,2) = 75 -100 mg/ekor/hari

4.7.4 Pemberian Minyak Goreng Deep Frying

Pembuatan minyak goreng deep frying menggunakan minyak curah yang

dipanaskan berulang sebanyak lima kali untuk menggoreng gorengan

selama 10 menit. Minyak goreng deep frying didapatkan dari membeli

minyak goreng di pasar Mergan dan diberikan kepada penjual gorengan

di sebelah Kampus 2 Universitas Muhammadiyah Malang untuk

28

digunakan sebanyak lima kali penggorengan. Minyak yang digunakan

adalah minyak yang sama (tidak diganti dan tidak dilakukan penambahan

volume minyak segar). (Budinastiti et al., 2016). Pemberian minyak

goreng deep frying pada tikus diberikan 1 kali dalam sehari 1ml/100gr

BB tikus atau setara dengan 0,3 – 0,4 ml peroral. Dalam penelitian

sebelumnya menunjukkan pemberian minyak goreng deep frying dapat

meningkatkan kadar trigliserida pada tikus selama 15 hari (150-250 g)

(Sutejo dan Dewi, 2012)

4.7.5 Pembuatan Ekstrak Kulit Lemon (Citrus limon)

a. Pembuatan serbuk kulit lemon

Jeruk Lemon didapatkan dari UPT Materia Medica Batu. Kulit jeruk

lemon yang dikumpulkan, dibersihkan dan dipotong – potong kecil,

dikeringkan, dan diblender menjadi bubuk. Bubuk kering ditimbang

dan siap untuk diekstrak.

b. Proses ekstraksi

Ekstrak kulit jeruk lemon disiapkan dengan maserasi atau perendaman

menggunakan sistem pelarut etanol 96% dan aseton dengan rasio 4:1

yang dijauhkan dari sinar matahari dan diaduk selama 3 hari. Maserasi

lalu difilter dengan corong Buchner. Ampas yang tersisa dimaserasi

kembali dua kali lagi. Filtrasi dari ekstrak digabungkan dan

dipekatkan menggunakan evaporator untuk mendapatkan ekstrak

kering.

Ekstrak kulit jeruk lemon yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah

sebagai berikut:

29

Dosis 1 (untuk 7 tikus selama 15 hari) :

18,75 - 25 x 7 x 15 = 1968,75 - 2625 mg

Dosis 2 (untuk 7 tikus selama 15 hari) :

37,5 - 50 x 7 x 15 = 3937,5 - 5250 mg

Dosis 3 (untuk 7 tikus selama 15 hari) :

75 - 100 x 7 x 15 = 7875 - 10500 mg

Jadi, total kebutuhan ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 13.781,25 mg –

18.375 mg.

4.7.6 Proses Pengambilan Darah, Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba

a. Proses Anastesi

Proses anastesi dilakukan satu persatu terhadap hewan coba yaitu

dengan cara memasukkan hewan coba ke dalam toples kaca yang

berisi kapas yang sudah dicampur dengan kloroform karena bahan ini

mudah didapat. Anastesi dilakukan secara inhalasi pada hewan coba

dengan dosis kloroform 10 ml per 10 hewan coba, anastesi dilakukan

sampai tikus pingsan, kemudian dihitung selama 20 detik, kemudian

langsung diangkat dari toples pembiusan untuk dilakukan

pembedahan

b. Proses Pembedahan

Setelah hewan coba teranastesi dengan baik (keadaan pingsan), hewan

coba diletakkan pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba

difiksasi terhadap meja lilin dengan menggunakan jarum pentul.

Dengan menggunakan gunting bedah, dilakukan pembedahan pada

30

abdomen hingga setinggi leher. Dengan menggunakan spuit 3 ml,

darah hewan coba diambil dari ventrikel kiri sebanyak ± 3 ml.

4.7.7 Penguburan Tikus Percobaan

Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba tidak

mengalami recovery. Sebelum dilakukan penguburan hewan coba,

dipastikan bahwa denyut nadi sudah berhenti. Jika hewan coba

mengalami recovery maka harus dilakukan prosedur euthanasia, salah

satunya dengan prosedur Cervical Dislocation, yaitu dengan cara

memisahkan tengkorak dan vertebrae (Alexandru, 2011). Setelah

dibedah, hewan coba akan dikuburkan dengan cara (SEPA,2009) :

1. Tikus dibungkus dengan polibag

2. Tikus dimasukkan ke dalam lubang pada tanah yang kering dengan

kedalaman 1 meter dan jarak minimal 250 meter dari sumber air

3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus

4.7.8 Pemeriksaan Kadar Trigliserida

Pemeriksaan kadar trigliserida dilakukan dengan metode glycerol-3-

phosphate oxidase – phenol aminophenazone (GPO – PAP). Sebanyak

10 µL serum direaksikan dengan reagen trigliserida sebanyak 1000 µL

lalu diinkubasi pada suhu 25oC selama 20 menit atau pada suhu 37oC

selama 10 menit. Serapan larutan dibaca pada panjang gelombang 500

nm dengan menggunakan alat spektrofotometer. Pengukuran dilakukan

terhadap reagen yang digunakan sebagai blanko (Baron, 2007).

Trigliserida (mg/dL) =

Absorban Sampel

Absorbansi Standarx konsentrasi standar trigliserida

31

4.8 Alur Penelitian

4.9 Analisis Data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji

normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji Bonferroni, uji regresi linier yang

Adaptasi hewan coba selama 7 hari

Kontrol positif

Minyak

goreng deep

frying

1ml/100gram

BB tikus

selama 14 hari

tanpa

dilanjutkan

pemberian

ekstrak kulit

lemon

Kelompok 1

Minyak goreng

deep frying

1ml/100gramB

B tikus selama

14 hari

dilanjutkan

pemberian

ekstrak kulit

lemon 125

mg/kgBB/hari

selama 15 hari

Kelompok 2

Minyak goreng

deep frying

1ml/100gramB

B tikus selama

14 hari

dilanjutkan

pemberian

ekstrak kulit

lemon 250

mg/kgBB/hari

selama 15 hari

Kelompok 3

Minyak goreng

deep frying

1ml/100gramB

B tikus selama

14 hari

dilanjutkan

pemberian

ekstrak kulit

lemon 500

mg/kgBB/hari

selama 15 hari

Pemeriksaan kadar trigliserida

Tikus yang telah dipastikan mati dikubur

Pembedahan dan pengambilan darah pada jantung tikus menggunakan

spuit 3 cc

Analisa data

32

diolah menggunakan program SPSS 23 (Statistical Product and Service

Solution versi 23).

a. Uji normalitas dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang

digunakan ≤ 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05. Jika hasil p <

0,05 maka data dapat ditransformasi.

b. Uji homogenitas dengan uji Levene digunakan untuk menentukan varian

data sama atau tidak. Apabila distribusi data normal dan homogen

dilanjutkan dengan uji one way ANOVA.

c. Uji one way ANOVA membuktikan adanya perbedaan yang bermakna

antara kontrol dengan perlakuan dengan perubahan kadar trigliserida. Hasil

uji ANOVA dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika signifikansi (sig)

< 0.05

d. Uji Bonferroni digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna

antara masing-masing kelompok perlakuan dalam penelitian.

e. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa besar pengaruh antara dosis

ekstrak kulit jeruk lemon terhadap kadar trigliserida.

4.10 Jadwal Penelitian

Tabel 4.1 Jadwal Penelitian

No Jenis Kegiatan Bulan

1 2 3

1 Pengurusan Izin x

2 Persiapan buah

lemon dan hewan

coba

x

3 Proses adaptasi

hewan coba

x

4 Pembuatan

ekstrak buah

lemon

x x

5 Pemberian

induksi minyak

x x

33

goreng deep

frying

6 Pemberian

ekstrak buah

lemon

x x

7 Dilakukan

pemeriksaan

kadar trigliserida

x

8 Analisa data

x x

9 Konsultasi dan

revisi akhir

x x x x