LAPORAN PRAKTIKUM

ILMU PENYAKIT TANAMAN

Bakteri

Oleh :

Nama : Sarah Lail Zahra

Nim : 125040201111162

Kelompok : Kamis, 13.20

Asisten : Diajeng Nastiti

JURUSAN HAMA PENYAKIT TUMBUHAN

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2015

1. PENDAHULUAN1.1. Latar Belakang

Pentingnya mempelajari ilmu yang berkaitan tentang patogen pada tumbuhan,

dimaksudkan untuk mencegah, dan mengendalikan, serta mengetahui perlakuan

yang tepat saat tanaman budidaya kita suatu saat terserang penyakit. Penyakit

yang menyerang tumbuhan umumnya disebabkan oleh virus, jamur, nematoda dan

bakteri. Bakteri merupakan patogen yang tergolong banyak menyerang tanaman

skala produksi dan bersifat sangat merugikan karena menimbulkan ekspresi busuk

dan bau. Dengan mempelajari dan mengerti bagaimana suatu patogen dapat

menyerang tanaman, khususnya bakteri, diharapkan kita dapat memberikan

perakuan yang tepat pada tanaman budidaya kita, seuai dengan gejala yang

ditimbulkan oleh bakteri, dan kedepannya kita dapat mencegah patogen yang

disebabkan oleh bakteri tersebut agar tidak sampai menginfeksi pada lahan

budidaya kita.

1.2. Tujuan Praktikum

Mengetahui gejala yang ditimbulkan oleh bakteri BDB pada buah pisang, dan

gejala yang ditimbulkan oleh Erwinia carotovora pada tanaman kentang.

1.3. Manfaat PraktikumDengan mempelajari dan mengerti bagaimana suatu patogen dapat menyerang

tanaman, khususnya bakteri, diharapkan kita dapat memberikan perakuan yang

tepat pada tanaman budidaya kita, seuai dengan gejala yang ditimbulkan oleh

bakteri, dan kedepannya kita dapat mencegah patogen yang disebabkan oleh

bakteri tersebut agar tidak sampai menginfeksi pada lahan budidaya kita.

2. TINJAUAN PUSTAKA2.1. Pengertian Bakteri

Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokaryotik (tidak memilki

selubung inti). Bakteri sebagai makhluk hidup tentu memiliki informasi genetik

berupa DNA namun tidak teralokalisasi di tempat khusus (nukleus) dan tidak ada

membran inti. Bentuk DNA bakteri adalah sirkuler, panjang, dan biasa disebut

nukleoid.pada DNA bakteri tidak memiliki intron dan hanya tersusun atas ekson

saja. Bakteri juga memilki DNA ekstrakromosomal yang terbentuk menjadi

plasmid dan berbentuk kecil dan sirkuler. (Baharudin, 1994)

2.2. Teknik Perbanyakan Bakteri>Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan

mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari

organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut

setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal.. Terdapat beberapa cara dalam

metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores kuadrat dan metode agar

cawan tuang. Metode gores kuadart bila metode ini dilakukan dengan baik akan

menghasilkan terisolasinya mikroorganisme dimana setiap koloni baresal dari satu

sel. Metode agar tuang berbeda dengan etode gores kuadrat, cawan tuang

menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50 oC, yang

kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan

yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan/ didalam

cawan.

>Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat

tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur

cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial

pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel

semakin besar.

> Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme

berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium

cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100

kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang

sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

Adapun prinsp dari metode cawan ini adalah jika sel jasad renik yang masih

hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik tersebut akan

berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung

dengan mata tanpa menggunakan alat bantu seperti mikroskop dan sebagainya.

Metode hiting cawan ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan

jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:

1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus

3. Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik kerena koloni

yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai

penampakan yang spesifik (goodman, 1986).

2.3. Proses Inokulasi BDB pada tanamanIsolat BDB yang diperoleh dimurnikan,diperbanyak dan disimpan dalam

akuades steril untuk digunakan dalam pengujian-pengujian berikutnya. Untuk

memastikan isolat tersebut adalah penyakit darah dilakukan uji karakter kultur

pada media TZC

(Baharuddin, 1994), uji hipersensitif pada daun tembakau dan uji patogenisitas

pada tanaman pisang dan jahe.

Jenis cara inokulasi BDB antara lain adalah :

> Injeksi suspense bakteri menggunakan syringe dibagian tengah buah pisang.

> Menusuk di bagian tengah buah pisang menggunakan jarum yang telah dilumuri

suspensi bakteri.

> Mengolesi pangkal buah yang telah dipotong dengan pisau steril (Baharuddin,

1994)

2.4. Proses Inokulasi Erwinia carotovora pada tanamanUntuk inokulasi bakteri dibuat dengan cara penetrasi patogen dengan bantuan

air (Jutono, 1973). Inokulasi dapat dilakukan dengan bantuan suntikan, maupun

olesan (Martorejo, 1997)

2.5. Teknik Patogenisitas BakteriBakteri masuk ke dalam tanaman melalui luka atau lubang alami seperti

stomata sehingga bakteri tidak perlu melakukan penetrasi tetapi harus memiliki

cara untuk kontak (adhere) dengan permukaan tanaman. Kebanyakan bakteri

tidak memiliki mekanisme untuk menempel (adhesion) pada inang kecuali bagi

bakteri yang berpindah melalui xilem dan phloem. Misalnya bakteri

Agrobacterium, membutuhkan reseptor pada permukaan inang untuk melekat

(attachment) agar dapat mentransfer tDNA dan menimbulkan penyakit. Seperti

halnya Agrobacterium, bakteri patogen tumbuhan lainnya memiliki gen penyandi

protein untuk pelekatan dan agregasi. Ralstonia solanacearum, Pseudomonas,

Xanthomonas dan Xylella memiliki 35 gen yang homolog dengan gen penyandi

pili tipe IV. Pada Pseudomonas, Xanthomonas pili type IV ini terlibat dalam

agregasi antar sel dan proteksi terhadap cekaman lingkungan, sedangkan pada

Xylella berperan untuk pemantapan agregasi populasi bakteri. Keempat bakteri ini

juga memiliki gen penyandi adhesin dan hemaglutinin-related yang homolog

dengan gen pada mamalia.

Sistem sekresi merupakan sarana penting dalam patogenisitas bakteri untuk

mentranslokasikan protein bakteri dan molekul lain ke dalam sel tanaman.

berdasarkan protein penyusunnya, terdapat lima sistem sekresi (SS) protein pada

bakteri, yaitu :

Tipe I : terdapat pada hampir semua bakteri patogen; mensekresikan toksin

seperti hemolysins, cyclolysin, and rhizobiocin; terdiri dari protein ATP-binding

cassete (ABC): energi untuk memasukkan dan mengeluarkan senyawa ke dalam

sel bakteri berasal dari hydrolisis ATP.

Tipe II : umumnya terdapat pada bakteri Gram negatif; mensekresikan berbagai

protein, enzim, toksin, dan faktor virulensi melalui dua tahap.

Tipe III : merupakan sistem sekresi yang paling penting untuk bakteri patogen

seperti Ralstonia, Pseudomonas, dan Xanthomonas. Fungsi utamanya adalah

untuk transportasi protein efektor melintasi membran sel bakteri dan

memasukkannya ke dalam sel tanaman. Gen penyandi SS tipe III ini memiliki

kemiripan pada 2/3 asam aminonya sehingga disebut hypersensitive response

conserved (hrc).

Tipe IV : mentransportasi makromolekul dari bakteri ke dalam sel inang,

misalnya transfer tDNA dari Agrobacterium ke dalam sel inang. Proses transfer

protein ini sangat mirip dengan transfer plasmid antar bakteri.

Tipe V : autotransporter, memiliki gen yang menyandikan adhesin permukaan.

Bakteri memiliki enzim pendegradasi dinding sel yang bervariasi. Enzim

tersebut meliputi pectinase, cellulase, protease, dan xylanase. Pectinase

merupakan enzim yang dianggap paling penting dalam patogenesis bakteri

tumbuhan yang menyebabkan peluruhan (maserasi) jaringan akibat degradasi

pektin pada lamela tengah. Terdapat empat tipe enzim pendegradasi pektin, yaitu

pectate lyase (Pel), pectin lyase (Pnl), dan pectin methyl esterase (Pme) yang

optimum pada pH tinggi (~8.0) dan polygalacturonase yang optimum pada pH

sekitar 6. Masing-masing enzim tersebut tersedia dalam berbagai bentuk atau

isozim dan disandikan oleh gen secara terpisah.

Ekspresi gen penyandi pektinase diatur secara global melalui mekanisme

menyerupai quorum sensing yang merupakan pengaturan berdasarkan kepadatan

populasi sel (cell density-dependent regulatory). Enzim diproduksi ketika bakteri

dan induser (homoserine lactone, HSL) mencapai tingkat kritis. Quorum sensing

memungkinkan bakteri dapat berkembang dalam jaringan inang tanpa

menimbulkan respon ketahanan dari inang. Enzim pendegradasi dinding sel

berperan dalam memfasilitasi penetrasi, kolonisasi patogen dan menimbulkan

gejala penyakit.

Bakteri menghasilkan enzim pendegradasi dinding sel dengan jenis yang

beragam. Erwinia penyebab busuk lunak (soft-rot) memiliki enzim pendegradasi

dinding sel tanaman yang paling luas dibadingkan dengan bakteri patogen

tumbuhan lainnya. Erwinia chrysanthemi menghasilkan lima grup utama Pel, tiga

grup minor Pel.

Erwinia carotovora menghasilkan tiga grup utama Pel, Pel intraseluler, dan

beberapa grup minor Pel. Xanthomonas campestris pv. campestris penyebab

busuk hitam pada kubis-kubisan memiliki gen untuk menyandikan dua enzim

pectin esterases, dua enzim polygalacturonases, empat enzim pectate lyases, lima

xylanases, dan sembilan cellulases. X. citri tidak memiliki enzim pectin esterases

sehingga memiliki gejala yang berbeda dengan X. campestris pv. campestris.

Bakteri lain kurang bersifat pektinolitik adalah Agrobacterium tumefaciens yang

hanya memiliki empat gen penyandi pectinase dan Xylella yang memiliki hanya

satu gen penyandi polygalacturonase.

Toksin merupakan faktor patogenisitas yang paling penting bagi bakteri

patogen. Misalnya adalah coronatine dan syringomycin yang dihasilkan oleh

beberapa Pseudomonas dan albicidin yang dihasilkan oleh X. albilineans.

Coronatine berfungsi untuk menekan induksi gen pertahanan inang, sedangkan

albicidin mencegah terjadinya replikasi DNA prokariotik dan perkembangan

plastid sehingga menyebabkan gejala klorosis pada daun muda.

Faktor patogenisitas bakteri lainnya adalah polisakarida ekstraseluler (EPS,

extracellular polysaccharides), misalnya pada Ralstonia solanacearum penyebab

layu, EPS1 merupakan faktor virulensi utama untuk menimbulkan penyakit. EPS

menyumbat pembuluh xylem sehingga menyebabkan layu. Sedikitnya terdapat 12

gen yang terlibat dalam biosintesis EPS1. Komponen utama EPS dari E.

carotovora adalah amilovoran yang biosintesisnya dikendalikan oleh beberapa

cluster gen.

Bakteri mengembangkan sistem pengaturan dan jaringan (regulatory system

and network) untuk menentukan kapan harus mengekspresikan gen patogenisitas

dan virulensi. Sistem ini memantau kondisi lingkungan dan memicu perubahan

drastis pada fisiologinya. Komponen utama dari sistem pengaturan respon ini

adalah sensor transmembran berupa protein kinase. Protein sensor akan

menangkap signal dan menjadi aktif. Sensor ini kemudian akan mengaktifkan

pengatur respon (response regulator) pada sitoplasma yang selanjutnya akan

mengaktifkan gen-gen target.

Gen-gen patogenisitas dan virulensi dari Ralstonia solanacearum dikendalikan

oleh jaringan yang kompleks yang mengandung gen phcA (sebagai response

regulator) dan produk operon phcBRSQ yang mengontrol level PhcA aktif sesuai

dengan kepadatan sel. PhcA pada level tinggi akan mengaktifkan gen-gen

virulensi seperti EPS1 dan beberapa eksoenzim. Ketika PhcA tidak aktif sel akan

mengaktifkan gen-gen untuk memproduksi polygalacturonase, siderofor,

perangkat sekresi Hrp dan swimming motility. Level PhcA di dalam sel

dikendalikan oleh 3-OH palmitic acid methylester (3-OH PAME). Semakin tinggi

3-OH PAME di dalam sel semakin tinggi level PhcA dan sebaliknya.

Bakteri Agrobacterium memiliki sistem pengaturan dua komponen (two-

component regulatory system) untuk mengenali dan bereaksi terhadap tanaman

yang rentan. Komponen tersebut adalah VirA yang merupakan protein sensor di

membran dan VirG yang merupakan protein pengatur respon di sitoplasma. Gen

virA diaktifkan oleh senyawa fenolik seperti lignin, flavonoid, dan acetosyringone

yang dikeluarkan tanaman saat luka. Selanjutnya, VirA (suatu protein produk

virA) akan mengaktifkan gen-gen vir lainnya.

Faktor patogenisitas bakteri yang lain adalah lipopolisakarida (LPS) yang

merupakan komponen dinding sel luar bakteri Gram negatif seperti Erwinia.

Siderofor dari Erwinia yaitu catechol dan hydroxamate merupakan penentu

virulensi. Siderofor ini melindungi bakteri dari H2O2 dan mencegah terbentuknya

reaktif oksigen (ROS). Peptida methionine sulfoxide reductase dapat melindungi

dan memperbaiki protein bakteri yang rusak karena ROS. Gen-gen hrp dan avr

berhubungan dengan ekspresi gen patogenisitas dan spesifisitas inang. Gen hrp

menyandikan protein harpin (pilin) yang digunakan sebagai sistem sekresi Tipe III

untuk mensekresikan protein Avr ke dalam sel tanaman. Protein Avr dan harpin

dapat menginduksi reaksi hipersensitif (HR). Protein Avr berperan dalam

menentukan kompatibilitas interaksi patogen dan inang.

Ambil suspensi bakteri dai media biakan menggunakan ose

Streak ke media PDA yang telah disiapkan

3. METODOLOGI3.1. Alat dan Bahan

Bahan :Biakan bakteri BDB dan Erwinia carotovora : spesimenUmbi kentang 2 buah : spesimenBuah pisang 2 buah : spesimenAquades : media pengencer biakan bakteriSpirtus : bahan bakar bunsenAlat :Suntikan : perantara masuknya inokulum bakteriBunsen : untuk menciptakan kondisi aseptisGelas ukur : untuk mencampurkan biakan bakteri dan aquadesJarum ose : untuk mengambil biakan bakteri dan mengaduk campuran bakteri dan air

3.2. Diagram Kerja Perbanyakan Bakteri

Pada langkah kerja pemurnian bakteri, diperlukan kondisi aseptis yang

mendukung. Maka, sebelum perlakuan dikerjakan, pastikan lingkungan kerja dan

alat-alat telah dalam kondisi steril. Kemudian, nyalakan bunsen, ambil petri berisi

biakan bakteri, ambil sebagian koloni menggunkan jarum ose steril, kemudian

ambil petri berisi media yang baru dan streak bakteri tersebut pada media yang

baru. Tutup petri, kemudian aplikasikan plastik wrap untuk mencegah terjadinya

Wrap petri berisi streak pemurnian bakteri

Amati selama satu minggu

Mencuci umbi kentang dan pisang menggunakan akuades lalu tiriskan

Simpan di dalam nampan dan tutp menggunakan platik wraping kemudian berikan celah sedikit untuk jalannya udara

Amati dalam satu minggu

kontaminasi. Seluruh langkah kerja, pastikan untuk mendekatkan peralatan dan

bahan pada api bunsen untuk menjaga kondisi aspetis.

3.3. Diagram Kerja Uji Patogenisitas

Langkah pertama, ambil sebagian isolat bakteri, encerkan menggunakan

aquades 10 ml dan campurkan secara merata dengan cara diaduk-aduk. Setelah

larutan yang berisi perbanyakan bakteri siap, masukkan pada suntikan untuk

persiapan disuntikkan pada spesimen. Kemudian, ambil umbi kentang dan pisang,

ambil masing-masing 2 buah, untuk perlakuan dan kontrol. Pada kontrol, umbi

kentang dan buah pisang tidak diinokulasi patogen bakteri. Ambil suntikan yang

telah berisi bakteri sebelumnya. Suntik pada beberapa bagian tubuh umbi dan

buah, beri tanda dan amati selama 1 minggu pengamatan dengan tetap melakukan

dokumentasi.

Suntikan masing-masing bakteri menggunakan jarum suntik pada kentang dan pisang

Ambil sebagian kecil biakan koloni bakteri

Taruh di gelas ukur, campurkan dengan aquades 10 ml

Aduk hingga terlarut sempurna

4. PEMBAHASAN4.1. Hasil Purifikasi Bakteri

4.1.1 Erwinia carotovora

Pengamatan dilakukan 2 kali setelah pembiakan bakteri berlangsung.

Diketahui, bahwa pada pengamtan pertama koloni telah menunjukkan tanda-tanda

berkembang dan terus berlanjut hingga pengamatan kedua. Koloni yang muncul

berwarna bening kekuningan dan membentuk koloni-koloni tunggal. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Addy (2007), bahwa koloni bakteri E. carotovora

berwarna bening sampai putih susu, mengkilat, bulat dan bertepi rata.

4.2.2. Bakteri BDB

Hasil pengamatan perbanyakan bakteri selama dua kali pengamatan

menunjukkan bahwa bakteri yang dimurnikan dari biakan bakteri BDB berwarna

kuning terang dan sedikit bertekstur tebal. Hal ini sesuai dengan pernyataan

Supeno (2003) yakni ciri yang dapat dilihat pada patogen BDB ini adalah bentuk

koloninya bulat atau lonjong (berukuran 2 – 5 mm) setelah 4 hari pada suhu 280C,

tidak fluidal, pinggiran koloninya jelas dan bening, dengan bagian tengahnya

sedikit keruh. Ciri lainnya adalah koloninya cenderung lengket pada permukaan

medium sehingga agak sulit kalau diambil dengan jarum ose.

4.2. Hasil Pengamatan Uji patogenitas Umbi Kentang dan Buah PisangUmbi kentang

Di hasil akhir pengamatan, umbi kentang mengalami kebusukan disekeliling

tempat yang disuntik dengna Erwinia carotovora. Warna umbi menjadi coklat dan

terdapat kontaminasi jamur pada tepiannya. Gejala yang nampak ini sama dengan

pernyataan Abadi (2003) bahwa gejala bercak coklat, busuk dan berair yang

tampak pada umbi memiliki perbatasan yang jelas antara umbi yang terserang

dengan umbi yang sehat. Akan tetapi busuk yang ditimbulkan tidak berbau dan

tidak berlendir.

Buah Pisang

Terdapat perbedaan antara buah pisang kontrol dan pisang yang di inokulasi

menggunakan BDB. Buah pisang yang diinokulasi menunjukkan gejala yakni

badan buah mencoklat, berlendir dan beralur sesuai dengan masuknya inokulum

yakni pada jantung buah pisang. Badan buah yang tidak terlalu terkena serangan

juga menunjukkan perubahan warna yakni terlihat basah, sedangkan pada buah

kontrol, pisang tetap berwarna segar tanpa adanya kerusakan baik pada jantung

buah maupun badan buah. Hal ini sesuai dengan pernyataan Goodman (1986)

yang menyatakan bahwa gejala ditandai dengan pembusukan badan buah, bercak

merah kecoklatan atau hitam, berlendir pada jantung buah dan rasa yang pahit.

5. KESIMPULANDAFTAR PUSTAKA

Abadi, A. L. 2003. Ilmu Penyakit Tumbuhan 3. Bayumedia. Malang. p 145 Addy HS. 2007. Pengaruh sumber mineral terhadap penekanan Erwinia carotovora

oleh pseudomonas pendar-fluor secara in vitro. J. Hama dan Penyakit Tumbuhan Troprika 7(2):117-124.

Baharuddin, B. 1994. Pathological, Biochemical, and Serelogical Characterization of the Blood Disease Bacterium Affecting Banana and Plantain (Musa sp.). Molecular Plant Pathology. 84 (6) : 570-575

Goodman, R.N., Z. Kiraly dan K.R. Wood. 1986. The Biochemistry and Physiology of Plant Disease. p 28-29

Jutono. 1973. Dasar-dasar Mikrobiologi untuk Perguruan Tinggi. Fakultas Pertanian UGM. Yogyakarta.

Martoredjo. 1997. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Andi Offset. Yogyakarta.Supeno, B., 2003. Preferensi Beberapa Serangga Vektor Bakteri Penyebab Penyakit

Darah Pisang (Pseudomonas solanacearum) pada beberapa jenis bunga pisang. Jurnal Penelitian UNRAM. 2 (4): 45 – 51.