i

LAPORAN AKHIR

PENELITIAN PENGEMBANGAN IPTEKS (PPI)

IDENTIFIKASI BAKTERI PADA DAUN SALAM (Eugenia polyantha) dan DAUN SIRSAK

(Annona muricata L.) BERDASARKAN URUTAN BASA NUKLEOTIDA PADA GEN 16S

rRNA

No. SPK : 184/F.3.07/2017 tanggal 24 Februari 2017

Tim Pengusul

Wahyu Hidayati, S.Si., M.Biomed (0308108202)

Fitri Yuniarti, S.Si., M.Si (0318068504)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

LEMBAGA PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

TAHUN 2017

ii

iii

iv

v

DAFTAR ISI

Halaman Pengesahan ....................................................................................... ii

Surat Kontrak .................................................................................................. iii

Daftar Isi ......................................................................................................... v

Ringkasan ........................................................................................................ vi

Bab 1. Pendahuluan ......................................................................................... 1

Latar Belakang

Tujuan Penelitian

Urgensi Penelitian

Bab 2. Kajian Pustaka ...................................................................................... 4

Bab 3. Meodologi Penelitian ........................................................................... 10

Bab 4. Hasil dan Pembahasan ......................................................................... 14

Bab 5. Kesimpulan dan Saran ......................................................................... 18

Daftar Pustaka ................................................................................................. 19

Luaran .............................................................................................................. 22

vi

RINGKASAN

Masyarakat Indonesia sudah mengenal daun Salam (Eugenia polyantha) dan daun Sirsak (Anona muricata) sebagai sumber obat tradisional. Beberapa penelitian juga melaporkan adanya aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen, penurunan kadar kolesterol hingga kanker dari ekstrak kedua tanaman tersebut. Adanya informasi mengenai bakteri endofit pada bagian tanaman, khususnya daun, maka perlu dilakukan penelitian terkat bakteri endofit pada kedua daun tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri endofit dari daun Salam dan Sirsak dan mencari identitas bakteri tersebut dengan menggunakan informasi DNA bakteri endofit. Penelitian ini diawali dengan tahap isolasi bakteri endofit kemudian DNA genom bakteri diekstraksi dan diamplifikasi dengan teknik PCR. Amplikon digunakan sebagai sumber informasi urutan basa nukleotida pada DNA genom bakteri. Informasi tersbut dianalisa dengan melakukan homologi DNA dengan DNA pada GenBank secara online.

Keywords : Eugenia polyantha, Anona muricata, amplifikasi, GenBank, PCR

1

BAB 1. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Dewasa ini, masyarakat mulai sadar bahwa obat modern yang umumnya berupa zat kimia

memiliki kelemahan-kelemahan yang signifikan sementara pada sisi lain terdapat kelebihan obat

herbal (Winarto 2007). Selain itu, maraknya istilah “Back to nature” membuat masyarakat beralih

untuk menggunakan obat dari bahan-bahan kimia ke bahan alam. Selain mudah didapat dan murah

harganya, obat bahan alam memiliki efek samping yang relatif kecil dibandingkan obat-obat

sintetik. Menurut Badan Kesehatan Dunia (WHO), saat ini 80% penduduk dunia melakukan

pengobatan tradisional dengan menggunakan obat yang berasal dari tumbuhan (Radji, 2005).

Berkembangnya pemanfaatan tanaman sebagai alternatif pengobatan penyakit oleh

masyarakat, maka banyak dilakukan penelitian mengenai kandungan senyawa metabolit sekunder

hingga potensi tanaman teresbut untuk pengobatan dan pencegahan suatu penyakit. Ketika

tanaman tersebut terbukti secara ilmiah dapat mencegah bahkan mengobati suatu penyakit maka

akan muncullah komersialisasi ekstrak tanaman tersebut. Hal ini akan berakibat pada peningkatan

kebutuhan akan tanaman tersebut untuk memenuhi kebutuhan pasar. Kebutuhan lahan akan

menjadi kendala besar pada komersialisasi ekstrak tanaman, karena untuk memenuhi kebutuhan

pasar akan obat dari ekstrak tanaman tersebut maka dibutuhkan lahan luas hanya untuk

menumbuhkan tanaman tersebut. Faktor-faktor tersebut menyebabkan munculnya gagasan para

ahli untuk melihat ada tidaknya keterkaitan mikroorganisme dalam biosintesis senyawa metabolit

sekunder pada tanaman.

Menurut Gustani (2012), sebagian senyawa bioaktif yang dikandung oleh tanaman

diketahui berasal dari hasil interaksi antara tanaman dan mikroba yang tumbuh dan hidup dalam

jaringan tanaman tersebut baik daun, batang, bunga, dan buah. Hal ini disebabkan adanya bberapa

faktor yang berbeda pada bagian-bagian tanaman, antara lain suhu, usia jaringan, komposisi

nutrien, lokasi geografis, dan lain sebagainya.i Mikroba tersebut hidup dalam jaringan tanaman

melalui interaksi simbiosis mutualisme di mana mikroba tersebut hidup tanpa memberikan efek

negatif pada tanaman (Bhore dan Sathisha 2010). Mikroorganisme tersebut dikenal dengan istilah

mikroorganisme endofit. Salah satu mikroba yang paling mudah untuk diteliti adalah bakteri.

Beberapa jenis bakteri yang tumbuh dalam jaringan tanaman (bakteri endofit) diketahui mampu

menghasilkan senyawa aktif yang bersifat antibiotik, antimalaria, dan antifungi (Castillo et al

2

2003; Simanjuntak et al. 2004; Beck et al. 2003). Kemampuan bakteri endofit menghasilkan

senyawa aktif tersebut merupakan potensi yang dapat dikembangkan mengingat umumnya

senyawa aktif diperoleh dengan mengekstraksi tanaman, khususnya tanaman obat. Untuk

memperoleh senyawa aktif dari tanaman dibutuhkan waktu dan proses yang lebih rumit

dibandingkan dengan mengekstraksi senyawa dari bakteri.

Tanaman yang sering digunakan oleh masyrakat Indonesia untuk mengobati penyakit

adalah tanaman sirsak (Annona muricata L.) dan salam (Eugenia polyantha). Tanaman sirsak,

khusunya bagian daun, telah diketahui sangat berpotensi untuk pengobatan penyakit, sedangkan

tanaman salam, khususnya daun, bukan hanya digunakan sebagai bumbu masakan namun juga

banyak digunakan untuk pengobatan diare, gastritis, dan gatal-gatal.

Adanya potensi daun sirsak dan daun salam dalam menyembuhkan penyakit, maka perlu

diketahui ada tidaknya mikroorganisme endofit pada kedua daun tersebut. Bakteri endofit yang

berhasil diisolasi dapat diketahui identitasnya dengan menggunakan menggunakan urutan basa

nukleotida yang terdapat di dalam gen 16sRNA. Gen 16S rRNA merupakan gen yang bersifat

spesifik terhadap spesies prokariot (Clarridge 2004). Gen 16S rRNA merupakan bagian dari

ribosomal RNA yang memiliki 1542 komponen nukleotida dan mengandung beberapa daerah

yang urutannya sangat conserved sehingga bermanfaat untuk mendapatkan informasi kemiripan

yang tepat (Gaffar 2004). Gen ini dapat diperoleh dengan melakukan isolasi genom bakteri

terlebih dahulu selanjutnya diamplifikasi menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

untuk mendapatkan gen 16S rRNA secara spesifik.

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui adanya bakteri endofit pada

tanaman obat dan idetifikasi bakteri endofit menggunakan urutan basa nukleotida gen 16srRNA.

Pada tahun 2004, Simanjuntak et al. melakukan isolasi mikroba endofit dari tanaman Artemisia

annua dan melakukan isolasi senyawa artemisinin pada hasil fermentasi mikroba endofit tersebut.

Pada tahun 2014, Bintang et al. melakukan identifikasi molekuler bakteri endofit yang diperoleh

dari tanaman Piper bettle. Penelitian-penelitian tersebut membuktikan adanya mikroba endofit

pada tanaman obat dan gen 16s rRNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri endofit

yang diperoleh.

Perumusan Masalah

3

Daun sirsak dan daun salam sudah diketahui memiliki kemampuan penghambatan terhadap

pertumbuhan bakteri atau yang dikenal dengan istilah antibakteri. Adanya informasi akan bakteri

yang tumbuh dalam jaringan tanaman dan adanya interaksi yang saling menguntungkan maka

perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat bakteri pada daun salam dan daun sirsak dan

dilakukan identifikasi isolat tersebut.

Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan isolat bakteri endofit dari daun sirsak dan daun salam

2. Mendapatkan identitas bakteri endofit dari daun sirsak dan daun salam

Keutamaan Penelitian

1. Mendapatkan isolat bakteri pada daun salam (E. polyantha)

2. Mendapatkan isolat bakteri pada daun sirsak (A. muricata L.)

3. Melakukan identifikasi isolat-isolat bakteri yang terdapat pada daun salam (E. polyantha)

4. Melakukan identifikasi isolat-isolat bakteri yang terdapat pada daun sirsak (A. muricata L.)

URGENSI (KEUTAMAAN) PENELITIAN

1. Bakteri endofit dari daun salam yang diperoleh pada penelitian ini dapat diketahui identitas

spesiesnya

2. Bakteri endofit dari daun sirsak yang diperoleh pada penelitian ini dapat diketahui identitas

spesiesnya

3. Bakteri endofit yang berhasil diperoleh pada penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber

baru penghasil metabolit sekunder untuk penemuan obat baru.

4. Informasi jenis bakteri yang diperoleh pada penelitian ini sangat bermanfaat untuk

penggalian potensi bakteri tersebut untuk menghasilkan protein hingga senyawa aktif baik

untuk industri maupun kesehatan.

5. Semakin berkurangnya lahan tidak menjadi kendala untuk pengembangan obat alamiah

karena bakteri endofit dilaporkan dapat dijadikan sebagai sumber alternatif penghasil

bahan obat alami.

4

BAB 2. KAJIAN PUSTAKA

A. Landasan Teori

1. Deskripsi Tumbuhan Salam (Eugenia polyanthaWight) dan Sirsak (Annona muricata

Linn.)

a. Tumbuhan Salam

Tumbuhan Salam adalah nama pohon penghasil daun rempah yang digunakan dalam masakan

nusantara. Daun salam digunakan terutama sebagai rempah pengharum masakan di sejumlah

negeri di Asia Tenggara, baik untuk masakan daging, ikan, sayur mayur, maupun nasi. Salam

tumbuh liar di hutan dan pegunungan, atau ditanam di pekarangan atau disekitar rumah.Tanaman

ini dapat ditemukan di dataran rendah sampai 1400 m dpl (Tjitrosoepomo, 2002).

Selain sebagai rempah, daun salam juga dapat digunakan untuk pengobatan tradisional.

Eugenia polyanthum diketahui mempunyai banyak khasiat pengobatan, antara lain untuk

mengobati kencing manis, hipertensi, kolesterol tinggi, gastritis, diare, asam urat, eksim, kudis,

dan gatal-gatal (Dalimartha, 1999). Kandungan tanaman salam antara lain adalah saponin,

triterpenoid, flavonoid, polifenol, alkaloid, tanin dan minyak atsiri yang terdiri dari seskuiterpen,

lakton dan fenol (Sudarsono dkk, 2002). Winarto (2004) menyatakan bahwa daun salam

mempunyai kandungan kimia yaitu, flavonoid sebagai antibakteri, minyak atsiri mengandung

sitral dan eugenol yang berfungsi sebagai anastetik dan antiseptik, dan tannin telah terbukti

mempunyai efektifitas antioksidan.

b. Tumbuhan Sirsak

(Annona muricata Linn.) atau yang dikenal dengan nama sirsak merupakan salah satu tanaman

buah yang berasal dari Karibia, Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Di berbagai daerah

Indonesia dikenal sebagai nangka sebrang, nangka landa (Jawa), nangka walanda, sirsak (Sunda),

nangka buris, nangkelan (Madura), srikaya jawa (Bali), boh lôna (Aceh), durio ulondro (Nias),

durian betawi (Minangkabau), serta jambu landa (Lampung), "Nangko Belando" (Palembang).

Penyebutan "belanda" dan variasinya menunjukkan bahwa sirsak (dari bahasa Belanda:zuurzak,

berarti "kantung asam") didatangkan oleh pemerintah kolonial Hindia-Belanda ke Nusantara, yaitu

pada abad ke-19, meskipun bukan berasal dari Eropa.

5

Buah sirsak mengandung banyak karbohidrat, terutama fruktosa. Kandungan gizi lainnya

adalah vitamin C, vitamin B1 dan vitamin B2 yang cukup banyak. Biji bersifat racun dan dapat

digunakan sebagai insektisida alami, seperti juga biji srikaya. Daun sirsak mengandung senyawa

acetogenin, minyak esensial, reticuline, loreximine, coclaurine, annomurine, higenamine. Daun

sirsak bermanfaat menghambat sel kanker dengan menginduksi apoptosis, antidiare, analgetik, anti

disentri, anti asma, antelmintik, dilatasi pembuluh darah, menstimulasi pencernaan, mengurangi

depresi (Mclaughlin 2008).

2. Bakteri Endofit

Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman yang dapat membentuk

koloni tanpa membahayakan inangnya.Bakteri endofit mempunyai potensi yang dapat

dimanfaatkan sebagai penghasil metabolit sekunder seperti yang terkandung di dalam tanaman

inangnya (Yuet al., 2009; Brader et al., 2014). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu

tanaman obat dapat menghasilkan flavonoid atau metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya

atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya

untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan besar memerlukan puluhan tahun untuk dapat

dipanen (Radji 2005). Isolasi bakteri endofit dari tanaman dapat dilakukan dengan cara

menginokulasi sampel tanaman yang telah disterilisasi kemudian ditanamkan ke dalam suatu

medium. Beberapa jenis bakteri endofit diketahui mampu menghasilkan senyawa aktif yang

bersifat antibiotic, antimalaria dan antifungi (Beck et al 2003).

3. Gen 16S rRNA

Ribosomal RNA (rRNA) merupakan RNA yang digunakan untuk menyusun ribosom, yaitu

suatu molekul di dalam sel yang digunakan sebagai tempat sintesis protein. Pada prokariot

terdapat tiga jenis molekul rRNA dengan koefisien sedimentasi 5S, 16S, dan 23S. Analisis sekuen

yang umum digunakan untuk bakteri adalah sekuen dengan gen 16S rRNA. Gen 16S rRNA

merupakan gen yang bersifat spesifik terhadap spesies prokariot (Clarridge 2004). Gen 16S rRNA

merupakan bagian dari ribosomal RNA yang memiliki 1542 komponen nukleotida dan

mengandung beberapa daerah yang urutannya sangat conserved sehingga bermanfaat untuk

mendapatkan alignment tepat (Gaffar 2004).

6

4. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA.Tahapan ini

penting dilakukan dalam melakukan identifikasi karena dibutuhkan DNA murni, yang terbebas

dari bakteri lainnya yang dapat mengganggu dalam analisa molekuler (Yuwono 2005).Tahapan ini

terdiri atas beberapa proses yang meliputi pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi/lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi, penambahan buffer ekstraksi atau buffer

lisis untuk mencegah DNA rusak. Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel

yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan (Sambrook dan Russel2001). Isolasi DNA saat

ini dilakukan dengan menggunakan DNA Purification kit yang telah tersedia komersial umumnya

menggunakan reagen non toksik sehingga meminimalkan bahaya (Promega 2005).Molekul DNA

yang sering digunakan dalam identifikasi molekular adalah DNA plasmid dan DNA genom yang

berasal dari sel bakteri (Radji 2011). Isolasi DNA genom total dari sel bakteri, terdiri dari

beberapa tahap yaitu pemecahan dinding sel, ekstraksi DNA genom, presipitasi DNA, dan

pencucian DNA (Agrawal 2008).

Proses pengeluaran DNA dari sel, dilakukan dengan cara diekstraksi atau dilisiskan

dengan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah kerusakan pada DNA.

Bufferekstraksi mengandung 10 mM Tris-Cl, 0.1 M EDTA, 20 μg/mL Rnase A, 0.5 % SDS.

Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang

tidak diinginkan, DNA perlu ditambahkan Rnase untuk membersihkan DNA dari RNA.

Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain termasuk debris sel, dilakukan dengan cara

sentrifugasi (Fatchiyah dkk. 2011).

5. Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target

tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA

target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu

thermocycler. PCR ditemukan pertama kali oleh Dr. Kary Mullis pada tahun 1985.PCR dibuat

dengan tujuan agar pengujian sampel dengan DNA dalam jumlah sedikit atau dalam keadaan rusak

menjadi mungkin. PCR merupakan proses siklus yang berulang, dan memiliki tiga tahap meliputi

denaturasi, annealing, dan ekstensi oleh enzim DNA polymerase (Joshi danDeshpande 2010).

7

Siklus PCR ada 30-35 siklus, ada tiga tahap penting tersebut yaitu : 1) Tahap denaturasi,

tahap ini merupakan proses pemisahan rantai untaian ganda DNA menjadi rantai tunggal dengan

pemanasan pada suhu tinggi. Suhu pada tahap denaturasi adalah pada kisaran 90- 98oC, selama 60

detik.2) Penempelan primer (Annealing), tahap penempelansuatu primer terhadap DNA template.

Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan

primernya. Amplifikasi akan lebih efisien apabila suhu annealing 37oC- 65oC selama 60 detik. 3)

Tahap pemanjangan Primer (Extention), tahap pemanjangan primer menjadi suattu untai DNA

baru, yang komplementer terhadap masing-masing DNA cetakan untai tunggal oleh enzim DNA

polymerase pada suhu 72oC selama 2-5 menit (Joshi dan Deshpande 2010).

6. Elektroforesis

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul dengan menggunakan medan listrik

yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. DNA yang

bermuatan negatif karena adanya kelebihan gugus fosfat maka ketika dialirkan oleh aliran listrik

maka akan bergerak ke muatan positif. Kecepatan DNA bergerak dipengaruhi oleh beberapa faktor

antara lain ukuran molekul DNA. Semakin berat ukuran DNA maka geraknya akan perlahan

(Yuwono 2005). Elektroforesis dengan gel agarosa atau gel poliakrilamid yang sering digunakan

dalam analisis.Teknik ini dapat digunakan untuk analisis secara kualitatif maupun kuantitatif. Gel

agarosa juga digunakan untuk pemisahan molekul yang besarnya lebih dari 200 base-pairs (bp)

sampai kira-kira 50 kilo base (kb) dan ini sesuai untuk molekul yang tidak terlalu panjang.

Sedangkan gel poliakrilamid untuk molekul yang lebih besar.

7. Sekuensing DNA

Sekuensing DNA merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui urutan basa-

basa nukleotida dalam suatu fragmen DNA.Pada dasarnya ada dua macam metode yang dapat

digunakan untuk menentukan urutan nukleotida suatu DNA, yaitu metode Maxam-Gilbert dan

metode Sanger-Coulson. Metode Maxam-Gilbert didasarkan atas pemotongan basa-basa DNA

secara spesifik dengan menggunakan reagen tertentu, sedangkan metode Sanger-Coulson

didasarkan metode enzimatik menggunakan DNA polimerase (Yuwono 2006). Pada umumnya

Metode yang paling sering digunakan adalah metode sanger karena dinilai lebih aman

dibandingkan dengan metode Maxam-Gilbert karena dalam metode tersebut reagen pemotong

yang dipakai kebanyakan bersifat toksik, senyawa yang memotong molekul DNA dalam tabung

8

percobaan juga dapat memotong DNA dalam tubuh sehingga harus hati-hati dalam

menggunakannya (T.A.Brown 1991).

Hasil sekuensing berupa bentuk elektroferogram yaitu grafik yang menunjukkan basa-basa

yang terekam pada hasil sequensing. Ribuan sekuen DNA organisme telah dikodekan dan

tersimpan pada database. Salah satu perangkat lunak pencari database adalah Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST). BLAST merupakan alat pembanding suatu sekuen yang dicari

dengan sekuen yang telah diketahui dengan cepat, yang dapat menjelaskan apakah sekuen yang

ada memiliki kesamaan cukup signifikan atau tidak.

8. Analisis sequen

Urutan basa nukleotida hasil sekuensing atau yang disebut dengan sekuens dianalisis dengan

membandingkan sekuen bakteri yang diteliti dengan sekuen DNA yang terdapat pada database

GenBank. Hasil perbandingan akan menunjukkan tingkat kemiripan atau homologi dengan

organisme lain.

B. State of The Art

Daun sirsak dan daun salam telah diketahui oleh masyarakat, khususnya masyarakat

Indonesia, sebagi tanaman obat. Beck et al. (2003) memberikan informasi mengenai

mikroorganisme yang tumbuh dalam jaringan tanaman dan memiliki potensi sebagai penghasil

senyawa-senyawa aktif seperti yang dimiliki inangnya menyebabkan perlu dicari kemungkinan

adanya mikroorganisme, dalam hal bakteri, pada jaringan daun sirsak dan daun salam. Penelitian-

penelitian yang dilakukan terhadap daun salam dan daun sirsak masih mengenai potensi kedua

daun tersebut untuk mengobati penyakit baik degenratif maupun infeksi. Penelitian yang diajukan

ini merupakan penelitian awal untuk mengetahui ada tidaknya bakteri yang tumbuh pada daun

sirsak dan daun salam.

Mikroorganisme yang tumbuh pada jaringan tanaman tersebut dapat diketahui spesiesnya

dengan menggunakan teknologi bioteknologi yang memanfaatkan analisa DNA. Penelitian yang

dilakukan oleh Bintang et al., (2014) yang berhasil mengidentifikasi mikroba endofit pada

tanaman Piper bettle memungkinkan untuk dilakukan penelitian identifikasi mikroba endofit pada

9

tanaman lain. Bakteri yang akan diperoleh pada penelitian yang diajukan ini akan diidentifikasi

spesiesnya menggunakan data DNA yang diperoleh melalui proses pembacaan DNA

menggunakan mesin PCR.

C. Road Map Penelitan

Selama lebih dari satu dekade, para peneliti di negara-negara maju sudah memulai penelitian

untuk mencari sumber senyawa aktif yang sama dengan yang dimiliki oleh tanaman. Berdasarkan

penelitian yang telah dilakukan, ditemukan kelompok mikroorganisme yang hidup dalam jaringan

tanaman memiliki peran dalam sintesis senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dimiliki oleh

tanaman. Laporan penelitian tersebut merangsang para peneliti untuk melakukan isolasi

mikroorganisme endofit tersebut, khususnya bakteri, dan mencari potensinya sebagai sumber baru

untuk menghasilkan bahan aktif obat.

Penelitian ini merupakan tahap awal dari serangkaian tahap untuk melakukan eksplorasi

bakteri endofit sebagai penghasil metabolit sekunder yang memiliki aktivitas farmakologi. Adapun

road map pada penelitian ini adalah :

L

10

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

A. Tempat Penelitian

Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi dan Sains,

Jurusan Farmasi, Universitas Muhammadiyah PROF. DR. HAMKA.

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur,

cawan Petri, pipet mikro, Mikrotip, tabung mikrosentrifus, jarum ose, spatel Drugalski, batang

pengaduk, kapas, kain kassa, plastic wrap, bunsen, pemantik api, timbangan analitik, hot plate,

incubator, autoklaf, oven, laminar air flow, waterbath, microsentrifuge, PCR thermo cycler,

elektroforesis, UV transiluminator.

2. Bahan Penelitian

a. Bahan untuk Isolasi Bakteri Endofit : Sampel berupa daun salam (Eugenia polyantha Wight)

dan daun sirsak (Annona muricata L.) yang masih segar dipotong hingga berukuran 1-3

cm, etanol 70%, akuades, NaOCl 5,3%, medium NA (Nutrient Agar), biakan mikroba uji

E.coli, S.aureus, L.bulgaricusdanS.mutan dalam medium Nutrient Broth (NB) untuk

pengkayaan.

b. Bahan Isolasi DNA Genom : Isolat bakteri endofit daun Salam (Eugenia polyantha Wight)

dan daun sirsak (Annona muricata L.), Tris-Cl, EDTA,nitrogen cair, protease K, Tris-

equilibrated Phenol, ammonium asetat, etanol 100%, etanol 70%, Rnase Asolution

c. Bahan Kimia untuk PCR: Forward primer 27F – (5’ AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC

AG 3’) dan reverse primer 1492R – (5’ TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG A 3’).

Deionized demineralized water, dan Maxima Hot Start Green PCR Master Mix dari

Thermo Scientific, yang terdiri dari: Taq DNA polymerase, PCR buffer, dATP, dGTP,

dTTP, dCTP, dan Mg2+.

d. Bahan Kimia untuk Elektroforesis : Gel agarosa, loading dyes, etidium bromida, DNA

ladder, Tris Acetate EDTA (TAE).

11

D. Alur Penelitian

D. Prosedur Penelitian

1. Pengambilan Sampel dan Persiapan Awal

Pengambilan sampel daun Salam (Eugenia polyanthaWight) dan daun sirsak (Annona

muricata L.) dari pekarangan rumah. Daun diambil dari tanaman yang sudah tumbuh selama lebih

dari 5 tahun. Persiapan awal penelitian meliputi persiapan alat dan bahan yang digunakan dalam

penelitian. Alat-alat seperti tip dan mikrotube disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Reagen-

reagen kimia yang digunakan untuk isolasi DNA disterilkan dengan cara filtrasi menggunakan

syringe filter cellulose acetate. Medium NB dan NA yang digunakan disterilisasi dalam autoklaf

suhu 121ºC selama 15 menit. Alat-alat gelas seperti tabung reaksi, cawan Petri, gelas ukur

disterilisasi dengan cara sterilisasi kering dalam oven pada suhu 160ºC selama 2 jam. Sedangkan

sterilisasi dengan etanol 70% digunakan untuk sterilisasi laminar air flow dan lingkungan

disekitar perlakuan, sterilisasi dengan pemanasan menggunakan bunsen digunakan untuk jarum

ose, dan pinset.

2. Isolasi Bakteri Endofit dari Daun Salam Dan Daun Sirsak

Sampel daun salam dan daun sirsak dalam kondisi segar dicuci dengan air mengalir hingga

bersih, lalu dipotong dengan ukuran 1-3cm. Kemudian dilakukan proses sterilisasi permukaan

dengan cara sampel yang sudah dipotong direndam dalam larutan etanol 70% selama 1 menit,

kemudian cairan perendam dibuang diganti dengan Natrium Hipoklorit 5,3% selama 5 menit dan

terakhir cairan perendam dibuang kembali dan sampel dibilas kembali dengan etanol 70%

sebanyak tiga kali (Simarmata dkk. 2007). Proses sterilisasi dilakukan di laminar air flow. Daun

12

salamdan daun Sirsak yang telah steril dikeringkan di atas tisu steril sampai etanolnya menguap.

Daun salamdan daun Sirsak yang telah kering kemudian ditanam dalam media NA (Nutrient Agar)

yang telah ditambahkan nistatin (0.01%b/v). Kemudian diinkubasi di ruang gelap pada suhu kamar

dan diamati hingga terdapat koloni yang tumbuh.Pemurnian dilakukan dengan memindahkan

koloni yang tumbuh ke cawan petri yang berisi NA.setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit

disimpan didalam agar miring NA (modifikasi Desriani et al. 2013).

3. Isolasi DNA Genom

Isolasi DNA genom dilakukan dengan menggunakan perangkat reagen untuk isolasi DNA

genom bakteri (PROMEGA).

4. Analisis DNA Genom dengan Teknik Elektroforesis Agarosa

Analisis DNA genomik bakteri dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Untuk membuat

agarosa dengan konsentrasi 1%, yaitu ditimbang agarosa sebanyak 0,5 gram dalam 50 ml

aquabides steril, dan dididihkan hingga larut. Setelah agak dingin, larutan tersebut dituang

pada cetakan gel kemudian sisir dipasang dan didiamkan hingga membeku. Setelah gel

mengeras sisir diangkat dan nampan dipindahkan ke wadah elektroforesis. Wadah tersebut

terlebih dulu diberi bufferTAE 1X hingga menggenangi permukaan gel agarosa. Sebanyak 0,5 μl

DNA hasil isolasi dicampurkan dengan 2,5 μl loading dye 6x lalu dihomogenkan. Campuran

tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Pada sumur berbeda dimasukkan campuran dari 2 μl

DNA ladder 1 kb, 2 μl loading dye 6x, dan 8 μl ddH2O.

Elektroforesis dinyalakan dan diatur tegangannya sebesar 100 volt. Kemudian, alat dijalankan

hingga xylene cyanol mencapai 1 cm dari tepi bawah gel. Selanjutnya gel agarosa diambil dan

dimasukkan dalam wadah yang sudah mengandung etidium bromida selama 5 menit dalam ruang

gelap, kemudian bilas dengan akuades selama 15 menit. Hasil diamati pada UV transilluminator

pada panjang gelombang 500 nm dan fragmen DNA yang muncul didokumentasikan dengan

difoto. Hasil positif ditandai dengan adanya fragmen DNA yang mucul pada gel agarosa (Agrawal

2008).

5. Amplifikasi Gen 16s rRNA dengan Teknik PCR

Proses amplifikasi genom bakteri terhadap gen 16S rRNA pada penelitian ini menggunakan

primer 27f dan pimer 1492r. Proses amplifikasi dilakukan berdasarkan metode yang dilakukan

oleh Bartlett dan Stiling (2003), adapun tahapan proses PCR terdiri dari sebagai berikut:

13

a. Initial denaturation pada suhu 95ºC selama 5 menit sebanyak 1 siklus

b. Denaturation pada suhu 95°C selama 1 menit sebanyak 30 siklus

c. Annealing pada suhu 56ºC selama 1 menit sebanyak 30 siklus

d. Elongation pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 30 siklus

e. Post elongation pada suhu 72ºC selama 10 menit sebanyak 1 siklus

Amplikon yang diperoleh dianalisis menggunakan gel agarosa seperti tahapan analisa DNA

genom dengan elektroforesis pada poin 6.

6. Sekuensing

Proses sekuensing dilakukan oleh lembaga molekuker Eijkman, Jakarta Indonesia.

7. Analisis Data

Informasi DNA hasil sekuensing dianalisis dengan program GENETIX, kemudian hasil analisa

dibandingkan dengan data DNA mikroba pada situs (www.ncbi.nlm.nih.gov/) untuk diketahui

identitasnya.

8. Teknik Analisis Data

Analisis data hasil deteksi PCR dengan dielektroforesis dianalisis berdasarkan ada tidaknya

potongan pita DNA yang terbentuk, dan data disajikan secara deskriptif dalam bentuk table dan

gambar.

14

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi Bakteri Endofit Daun Salam dan Daun Sirsak

Pada penelitian ini, isolat bakteri endofit diperoleh setelah dilakukan proses sterilisasi

permukaan daun salam dan daun sirsak yang dilanjutkan dengan penanaman langsung daun-

daun yang telah disterilisasi tersebut pada cawan petri yang berbeda. Sterilisasi permukaan

dilakukan untuk membersihkan daun dari kontaminan, baik partikel debu maupun mikroba

yang menempel pada permukaan daun. Hal ini sangat penting untuk dilakukan karena bakteri

yang akan diisolasi hanyalah bakteri yang tumbuh di dalam jaringan tanaman.

Isolat bakteri yang diperoleh pada penelitian ini adalah sebanyak 6 isolat bakteri endofit,

dimana 3 isolat bakteri endofit berasal dari daun sirsak sedangkan 3 isolat bakteri lainnya

berasal dari daun salam (gbr 1dan 2).

Gambar 1. Isolat bakteri endofit daun salam. 1. Isolat WL-SB, 2. Isolat WL-SK, 3. Isolat WL-SM1

Gambar 2. Isolat bakteri endofit daun salam. 1. Isolat WL-SiP, 2. Isolat WL-SiM, 3. Isolat WL-SiK

15

B. Ekstraksi DNA Genom Bakteri Endofit

Molekul DNA genom bakteri endofit baik yang berasal dari daun sirsak maupun daun salam

berhasil diperoleh dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).

Molekul DNA dapat teramati dengan menggunakan suatu senyawa interkalar, salah satunya adalah

Ethidium Bromida, dengan bantuan sinar UV. Adapun pemisahan fragmen DNA dilakukan

dengan menggunakan metode elektroforesis agarosa, yaitu suatu metode pemisahan molekul DNA

dengan menggunakan suatu medan listrik. Hasil isolasi DNA genom bakteri endofit dapat dilihat

pada gaambar 3.

Gambar 3. Hasil elektroforesis DNA genom bakteri endofit dari daun salam dan daun

sirsak. A. Daun Salam. Lajur 1 : DNA Marker 1kb; Lajur 2 : DNA genom isolat WL-SB; Lajur 3: DNA genom WL-SK; Lajur 4: DNA genom WL-SM B.Daun Sirsak. Lajur 1 : DNA Marker 1kb; Lajur 2 : DNA genom isolat WL-SiK; Lajur 3: DNA genom WL-SiM; Lajur 4: DNA genom WL-SiP

16

C. Amplifikasi Gen 16s rRNA dari Genom Bakteri Endofit

Gen 16s rRNA berhasil diamplifikasi dengan menggunakan metode PCR.

Gambar 3. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16s rRNA bakteri endofit dari daun salam dan daun sirsak. A. Daun Salam. Lajur 1 : DNA Marker 1kb; Lajur 2 : DNA genom isolat WL-SB; Lajur 3: DNA genom WL-SK; Lajur 4: DNA genom WL-SM B.Daun Sirsak. Lajur 1 : DNA Marker 1kb; Lajur 2 : DNA genom isolat WL-SiK; Lajur 3: DNA genom WL-SiM; Lajur 4: DNA genom WL-SiP

D. Analisa Hasil Sekuensing gen 16s rRNA isolat bakteri endofit daun salam dan daun

sirsak

Gen 16 s rRNA yang diperoleh dari tahap PCR dijadikan sebagai sumber infoormasi

sekuens DNA pada bakteri endofit daun salam dan daun sirsak. Akan tetapi, karena

keerbatasan dana yang diperoleh, maka hanya satu isolat untuk masing masing sampel

penelitian yang dilakukan proses pembacaan urutan basa nukleotidanya.

Data sekuens yang diperoleh dianalisis dan diperoleh hasil bahwa salah satu isolat bakteri

endofit daun Salam yang diperoleh pada penelitian memiliki kemiripan sebesar 99% terhadap

17

B. subtilis strain IAM 12118 sedangkansalah satu bakteri endofit daun sirsak memiliki

kemiipan terhadap Bacillus licheniformis strain DSM 13.

18

BAB 5. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan :

1. Sebanyak 3 isolat bakteri endofit pada daun sirsak yang diperoleh pada penelitian ini dan

salah satu bakteri endofit memiliki kemiripan urutan basanya dengan B. subtilis strain

IAM 12118

2. Bakteri endofit daun sirsak yang berhasil diisolasi pada penelitian ini adalah sebanyak 3 isolat

dan salah satu bakteri endoofit daun sirsak memiliki persentase kemiripan sebesar 99% terhadap

urutan basa pada gen 16s rRNA bakteri B. lichenifoormis strain DSM 13.

19

DAFTAR PUSTAKA

Agrawal S. 2008. Techniques in Molecular Biology First Edition. International Book Distributing Co. Sadar Lucknow. Hlm. 4-57.

Agung G. 2013. The Inhibitory Power of Soursoup Leaf Juice on Escherichia Coli Bacteria Growth. 2(2): 162-169.

Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Penerbit ITB. Bogor. Hlm. 3-4,34. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. 1997. Inventaris Tanaman Obat Indonesia

Jilid I. Departemen Kesehatan. Hlm 105 Beck HC, Hansen AM, Lauritsen FR. 2003. Novel pyrazine metabolites found in polymyxin

biosynthesis by Paenibacillus polymyxa. FEMS Microbiol Lett 220: 67–73. Bhore SJ, Sathisha G. 2010. Screening of endophytic colonizing bacteria for cytokinin-like

compounds: crude cell-free broth of endophytic colonizing bacteria is unsuitable in cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci. 6 (4): 345-352.

Bintang M, Safira UM, Kusumawati DE, Pasaribu FH, Sidharta T. 2014. Analysis of 16S rRNA Sequence of Endophytic Bacteria Isolate BS1 from Piper betle (L) Stem. International Confrence on Agricultural, Environmental and Biology Sciences(AEBS) April 24-25, Phuket-Thailand : 69-70.

Brader G, Compant S, Mitter B, Trognitz F, Sessitsch A. 2014. Metabolic Potential of Endophytic Bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 27: 30-37.

Brown T.A. 2006. Gene cloning, an introduction. 6th ed. London: Wiley&Blackwell. p.165-171

Bushell C, Burns M. 2012. Feasibility Study Into The Use Of DNA Sequensing for The Identification Of Probiotic Bacteria. Journal of The Association Of Public Analysts 40: 28-38.

Castillo U, et al. 2003. Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp.NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Microbiol. Lett. 224: 180-190.

Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Journal Clinical Microbiology Reviews. 17: 840-862.

Dalimartha, S. 2000. Atlas Tumbuhan Obat, Jilid 2, Trubus Agriwidya, Jakarta: Hlm 126-130 De Guzman, C.C. and J.S. Siemonsma (eds.).1999. Plant Resources of South_East Asia 13:

Spices. PROSEA. Bogor. Desire MH, Bernard F, Forsah MR, Assang CT, Denis ON. (2014). Enzymes and qualitative

phytochemical screening of endophytic fungi isolated from Lantana camara Linn. Leaves. Journal of Applied Biology and Biotechnology. 2(06): 001-006.

Desriani et al. 2013. Potential Endophytic Bacteria for Increasing Paddy Var Rojolele Productivity. IJASEIT 3(1):76-78.

Desriani, P, Safira UM, Bintang M, Rivai A, Lisdiyanti P. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit dari Tanaman Binahong dan Ketepeng China. Jurnal Kesehatan Andalas 3(2): 89-93.

20

Dharmayanti, Sulistyowati E, dkk.2000. Efektifitas Pemberian Propolis Lebah Dan Royal Jelly Pada Abses Yang disebabkan Staphylococcus aerus. Pusat Penelitian Bogor: LIPI.

Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widayanti S, Rahayu R. 2011. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta. Hlm. 22-23, 52-55.

Kusbari R. 2013. Seleksi Bakteri Rizosfir dan Endofit untuk Pengendalian Penyakit Layu Fusarium Pisang (Fusarium Oxysporum F.SP. Cubense RAS 4 Tropika). Skripsi. Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Madigan M, Martiko JM, Stahl DA, Clark DP. 2012. Brock Biology of Microorganisms. 13th Edition. Wageningen Agricultural University. Netherlands. Hlm. 129-130.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika Edisi Kedua. IPB Press. Bogor. Hlm. 61.

Pangastuti A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen Penyandi 16S rRNA dan Gen Penyandi Protein. Jurnal Biodiversitas. 7(3):292-296.

Promega Corporation. 2005. Wizard Genomic DNA Purification Kit. USA Radji, M. 2005. Peranan bioteknologi dan mikroba endofit dalam pengembangan obat herbal.

Majalah Ilmu Kefarmasian. 2(3): 113-126. Resti Z, Habazar T, Putra DP, Nasrun. 2013. Skrining dan Identifikasi Isolat Bakteri Endofit

untuk Mengendalikan Penyakit Hawar Daun Bakteri pada Bawang merah. Jurnal HPT. Tropika 13(2): 167-178

Robinson, T. 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi VI, Hal 191-216, Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, ITB: Bandung.

Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Simanjuntak P, Bustanussalam, Otovina DM, Rahayuningsih M, Said EG. 2004. Isolasi dan identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari tanaman Artemisia annua. [studi mikroba endofitik tanaman Artemisiaspp.]. Majalah Farmasi Indonesia 15 (2) : 68-74.

Simarmata, R., Lekatompessy,S. & Sukiman, H. 2007. Isolasi mikroba endofitik dari tanaman obat Sambung Nyawa (Gynura procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk. Penel. Hayati. 13: 85-90.

Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and TheirNatural Products. Microbiology and Molecular Biology Review 67(4): 492-497.

Sudarsono et al, 2002, Tumbuhan Obat II Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, Pusat Studi Obat Tradisional, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 174-175.

Sumono A, Wulan A. 2009. Kemampuan Air Rebusan Daun Salam (Eugenia polyantha W) Dalam Menurunkan Jumlah Koloni Bakteri Streptococcus sp. Majalah Farmasi Indonesia 20(3), 112 – 117.

Trisno J, Yusniwati. 2012. Identifikasi Rizobakteria asal Tanaman Cabai Berdasarkan Sekuen Gen 16S rRNA. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 8(3):79-83.

Winarto W. P., 2004, Memanfaatkan Bumbu Dapur untuk Mengatasi Aneka Penyakit. Jakarta:Agromedia Pustaka.

21

Yu H, Zhang L, Li L, Zheng C, Guo C, Li W, Sun P, Qin L. 2010. Recent Develoments and Future Prospects of Antimicrobial Metabolites Produced by Endophytes. Microbiology Research. 165: 437-449.

Yuwono T. 2006. Teori Dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andy Publisher, Yogyakarta. Halm 23-278

22

LUARAN PENELITIAN

SCREENING AND IDENTIFICATION ENDOPHYTIC BACTERIA FROM INDONESIAN BAY LEAVES (Eugenia polyantha WIGHT) WITH ANTIBACTERIA

ACTIVITY

Wahyu Hidayati, Fitri Yuniarti , Lulu Shofaya, Sigit Priyo Utomo, Lutfika Munaziah

Faculty of Pharmacy and Sciences, Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka (UHAMKA). Jl. Delima II/IV, Klender, Jakarta Timur 13460 Indonesia

A B S T R A C T - For many years, herbs already utilized as traditional medicine to cure diseases, particularly bacterial infections. One of potential herbs which reported has antibacterial activity is Eugenia polyantha Wight. This herbs is commonly used as spices for food by Indonesian people. Due to the significant increasing of multidrug resistance bacteria globally, the invention of new antibiotics is urgently needed. One of alternative ways finding active compounds to solve the problems is by using microbes inside plants. Unfortunately, no reports about endophytic bacteria from Indonesian Bay Leaves especially its potential as antibacterial. This research aimed to find endophytic bacteria isolates from Indonesian Bay Leaves which has antibacterial activity against Salmonella typhi. First, we isolated the bacteria from fresh E. polyantha leaves on agar medium then cultivated it using NB medium and continued to antibacterial assay by disc diffusion. The 16 sRNA of isolate with inhibition ability was sequenced. We got three endophytic bacteria isolates but only one isolate shown great antibacterial activity. According to the similarity result by BLAST analysis the isolate had similarity to Bacillus sp, thus, we named the isolate with B. subtilis strain WL-SM1.

KEY WORDS: Eugenia polyantha, endophytic bacteria, antibacterial, Bacillus subtilis, BLAST

P E N D A H U L U A N

Indonesia merupakan negara yang berada di kawasan tropis dengan beragam tumbuhan obat yang dimilikinya. Lebih dari 1000 jenis tumbuhan yang tersebar di indonesia dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku obat dikarenakan adanya kandungan senyawa bioaktif di dalamnya (Radji 2005). Senyawa bioaktif pada tanaman diketahui berasal dari hasil interaksi antara tanaman dan mikroba endofit. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar dimuka bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel & Daisy 2004). Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang tanpa merugikan tanaman inangnya. Bakteri endofit mampu memproduksi metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas seperti enzim, zat pengatur tumbuh, antimikroba, antifungi, dan antikanker (Kumala 2014).

Tumbuhan salam (Eugenia polyantha Wight) merupakan tumbuhan yang banyak tumbuh di indonesia. Salam termasuk ke dalam famili myrtaceae dan sering dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai bahan tambahan masakan. Secara empiris, tanaman ini telah digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat untuk mengobati beberapa penyakit infeksi antara lain diare (Hariana, 2006). Trisharyanti & Febriani (2017) melaporkan bahwa ekstrak etanol 96% daun salam memiliki

23

kemampuan menghambat pertumbuhan Salmonella typhi dengan konsentrasi ekstrak sebesar 10%. Penelitian yang dilakukan oleh Malik & Ahmad (2013) memperlihatkan adanya aktivitas antidiare pada ekstrak etanol 70% dengan dosis 30% secara in vivo.

Adanya informasi mengenai kemampuan bakteri endofit menghasilkan senyawa-senyawa dengan bioaktivitas yang beragam seperti antibakteri. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan bakteri endofit daun salam yang memiliki aktivitas antibakteri secara in vitro dikarenakan belum adanya informasi mengenai bakteri endofit daun salam yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Lebih jauh, penelitian ini juga akan melakukan identifikasi bakteri endofit dengan aktivtas antidiare menggunakan gen 16 sRNA.

K A J I A N P U S T A K A

Tanaman Salam

Tumbuhan Salam adalah nama pohon penghasil daun rempah yang digunakan dalam masakan nusantara. Daun salam digunakan terutama sebagai rempah pengharum masakan di sejumlah negeri di Asia Tenggara, baik untuk masakan daging, ikan, sayur mayur, maupun nasi. Salam tumbuh liar di hutan dan pegunungan, atau ditanam di pekarangan atau disekitar rumah. Tanaman ini dapat ditemukan di dataran rendah sampai 1400 m dpl.

Salam merupakan pohon dengan tinggi mencapai 25 m, batang bulat, permukaan licin, ± 25cm, putih kecoklatan. Daun majemuk, menyirip genap, permukaan licin, tepi rata, ujung meruncing, pangkal runcing, panjang 1014cm, lebar 4-8 cm, tangkai panjang ±1 cm, pertulangan menyirip, perukaan atas hijau tua, permukaaan bawah hijau muda. Bunga majemuk, tumbuh diujung batang, kelopak berbentuk piala, diamaeter 4 mm, hijau mahkota panjang 2-3 mm, putih, putik panjang 1-2 mm, hijau keputih-putihan. Buah buni, bulat, diameter ±1-2 cm, masih muda hijau setelah tua coklat kehitaman. Biji bulat, diameter ± 1 cm, coklat. Akar tunggang, coklat muda(Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, 1997).

Antibakteri dan uji potensi antibakteri Produk alam berupa molekul organik yang dibuat oleh mikroorganisme yang pada

konsentrasi rendah aktif untuk melawan mikroorganisme lain disebut sebagai antibakteri. Salah satu sumber antibakteri adalah mikroba endofit. Produk alami yang dihasilkan dari mikroba endofit telah diobservasi dapat menghambat atau membunuh berbagai penyakit berbahaya yang disebabkan oleh phytopatogen, bakteri, jamur, virus dan protozoa yang mempengaruhi manusia dan hewan. Berdasarkan sifat toksisitas selektifnya antibakteri terbagi menjadi tiga yaitu bakteriostatik, bakterisidal dan bakteriolitik. Bakteriostatik adalah zat yang hanya menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan bakterisidal adalah zat yang dapat membunuh sel tetapi tidak terjadi lisis sel atau pecah sel. Sedangkan bakteriolitik menyebabkan sel menjadi lisis atau pecah sel sehingga jumlah sel berkurang atau terjadi kekeruhan setelah penambahan antimikrobia (Madigan et al2000). Berdasarkan spektrumnya, antibakteri terbagi menjadi spektrum luas dan spektrum sempit. Spektrum luas adalah zat yang aktif terhadap bakteri Gram negatif (-) dan Gram positif (+), sedangkan spektrum sempit adalah zat yang aktif terhadap Gram (-) atau Gram (+) saja.

Uji potensi bakteri endofit sebagai antibakteri dapat dilakukan dengan berbagai metode yaitu metode difusi dan metode dilusi. Metode difusi terbagi menjadi tiga yaitu difusi cakram dengan menggunakan kertas cakram yang telah direndam ke dalam zat antibakteri, difusi silinder

24

dengan menggunakan tabung silinder yang diletakkantegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petridan metode lubang atau sumuran dengan membuat lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian, kemudian lubang diinjeksikan dengan ekstrak yang akan diuji. Setelah dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan di sekeliling lubang (Kusmiyati dan Agustini, 2007).

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair dan dilusi padat. Metode dilusi cair dilakukan dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai kadar hambat minimal (KHM). Metode dilusi padat sama dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (Pratiwi 2008).

M E T O D E

Penyiapan Sampel dan Identifikasi Tanaman Sampel tanaman diambil dari wilayah Tangerang sedangkan identifikasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Balitbang Botani, Puslitbang Biologi LIPI, Bogor Isolasi Bakteri Endofit Tahapan isolasi dilakukan dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Kumala (2009) dengan sedikit perubahan. Adapun metode tersebut adalah diawali dengan pencucian sampel daun salam segar dengan air mengalir hingga bersih dan dilanjutkan dengan sterilisasi permukaan. Sterilisasi permukaan dilakukan dengan merendam daun pada larutan etanol 75% selama 1 menit, kemudian sampel dipindahkan pada wadah berisi larutan Natrium Hipoklorit 5,3% dan direndam selama 5 menit dan terakhir daun dibilas kembali dengan etanol 75% selama 30 detik. Daun kemudian dikeringanginkan guna menghilangkan uap etanol. Sebelum diletakkan pada medium NA yang telah ditambahkan nistatin 0,01%, daun dipotong kecil dengan ukuran 1cm. Setelah daun diletakkan pada medium NA tersebut dilanjutkan inkubasi pada suhu kamar terlihat adanya isolat bakteri yang tumbuh disekitar daun (Pratiwi 2015). Karakterisasi Morfologi dan Pewarnaan Gram Karakterisasi morfologi dilakukan dengan dua pengamatan yaitu makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopik dilakukan dengan mengamati warna koloni, bentuk koloni, pinggiran koloni dan permukaan koloni. Pengamatan makroskopis dilakukan secara kasat mata, sedangkan pengamatan mikroskopis dilakukan menggunakan mikroskop binokuler. Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan mengamati bentuk dan wran sel setelah dilakukan pewarnaan Gram.

Pewarnaan gram dilakukan diawali dengan menggoreskan bakteri diatas kaca objek dan difiksasi. Goresan bakteri tersebut kemudian diteteskan kristal violet sebanyak satu tetes dan didiamkan selama 1 menit dilanjutkan dengan pencucian di bawah air mengalir lalu dikeringanginkan. Larutan lugol kemudian diteteskan dan didiamkan selama 1 menit lalu dicuci dan dikeringanginkan. Warna lugol yang menempel kemudian dibersihkan dengan pemberian larutan alkohol 96% kemudian dicuci dan dikeringanginkan. Pemberian safranin sebanyak satu tetes dilakukan setelah uap alkohol menghilang dan dilanjutkan dengan inkubasi selama 45 detik (Madigan 2007). Fermentasi Skala Kecil Isolat yang telah dimurnikan dan diremajakan dikultivasi selama 1 hingga 7 hari pada 5 ml medium NB dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang. Hasil fermentasi dikoleksi setiap 24 jam sejak 24 jam pertama hingga hari ketujuh. Supernatan dipisahkan dari sel bakteri endofit menggunakan teknik sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan

25

disimpan pada suhu 4oC (Kumala dkk. 2007). Skrining isolat bakteri daun Salam dengan aktivitas antibakteri secara in vitro Skrining dilakukan dengan metode disc diffusion terhadap bakteri Salmonella typhii. Tahapan ini diawali dengan penyediaan medium uji. Medium uji dibuat dengan mencampur medium Muller Hinton Agar (MHA) dengan bakteri uji Salmonella typhi yang telah dikultivasi dan mencapai transmittan sebesar 25%. Adapun perbandingan S. typhii dengan medium MHA adalah 1:10. Setelah medium uji memadat, kertas cakram yang telah direndam dalam supernatan hasil fermentasi bakteri endofit selama 5 menit diletakkan pada medium uji tersebut dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari (Simarmata dkk. 2007). Isolasi DNA genom isolat bakteri dengan aktivitas antidiare Isolasi dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA). Metode isolasi dilakukan sesuai dengan protokol yang terdapat pada kit tersebut. Isolat bakteri yang akan digunakan untuk proses isolasi, terlebihdahulu dikultur dalam medium Nutrient Broth(NB)dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Tahap awal yang dilakukan adalah memasukan bakteri endofit yang telah dikultur sebanyak 1ml kedalam mikrotube 1.5ml, kemudian sentrifuse pada kecepatan 15.000 x g selama 2 menit, buang supernatan hingga tersisa peletnya saja. Kemudian campurkan 480µl EDTA 50mM kedalam mikrotube yang berisi pelet, setelah itu tambahkan 120µl lisozim dan lakukan pipeting agar semua bahan dan pelet tercampur, inkubasi sampel pada suhu 370C selama 30-60 menit, setelah diinkubasi sentrifuse sampel 15.000 x g selama 2 menit, setelah terpisah buang supernatan. Tahap selanjutnya tambahkan 600µl nuclei lysis solution kedalam tube yang berisi pelet, lakukan pipeting agar tercampur dengan baik, kemudian inkubasi pada suhu 800C selama 5 menit, dan dinginkan pada suhu ruang. Setelah dingin tambahkan 3µl RNAse Solution, bolak balik tube 2-5 kali untuk mencampurnya. Kemudian inkubasi pada suhu 370C selama 15-60 menit, dinginkan pada suhu ruang. Tahap berikutnya tambahkan 200µl Protein Precipitation Solution, kocok selama 20 detik. Inkubasi sampel didalam es selama 5 menit, sentrifuse dengan kecepatan 15.000 x g selama 3 menit. Tuang supernatan kedalam mikrotube baru yang telah terisi isopropanol 600µl. Tutup mikrotube dan bolak balik secara perlahan, secara kasat mata akan terlihat seperti ada benang putih di dalam mikrotube, kemudian sentrifuse 15.000 x g selama 2 menit. Buang supernatan secara hati-hati, sehingga hanya pelet saja yang tersisa. Cuci pelet dengan menambahkan 600µl etanol 70%, lakukan pengocokan agar pencucian DNA merata, sentrifuse 15.000 x g selama 2 menit. Buang etanol secara hati-hati agar pelet tidak ikut terbuang, keringkan tube dari sisa etanol selama 10-15 menit. Tahap akhir yang dilakukan adalah tambahkan 100µl Rehydration solution ke dalam tube yang telah berisi DNA, kemudian inkubasi selama 1 jam pada suhu 650C, kemudian simpan DNA pada suhu 2-80C. Visualisasi hasil isolasi genom dilakukan pada gel agarosa 0.8% di atas sinar UV setelah proses elektroforesis.

Amplifikasi dan Identifikasi Gen 16sRNA Proses amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan berdasarkan protokol Go Taq® Green Master Mix dengan menggunakan primer forward 27F (5’ AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG 3’) dan primer reverse 1492R (5’ TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG A 3’) (Rosita, 2012). Go Taq Green Master Mix sebanyak 12.5 µl di masukkan ke dalam tube 0.5ml, tambahkan primer 27F 2.5 µl, primer 1492R 2.5µl, dan Nuclease-free water 4.5 µl, lalu dihomogenkan. DNA Template 3 µl, ditambahkan kedalam campuran tersebut, lakukan pipeting agar tercampur sempurna. Amplifikasi dilakukaknsebanyak 30 siklus pada proses denaturasi (94o C, 1 menit), annealing (50o C, 1 menit), dan elongasi (74oC, 2 menit). Sebelum denaturasi dilakukan tahapan pre-denaturasi selama 3 menit pada suhu 94o C dan setelah elongasi dilakukan final

26

extention pada suhu 72o C selama 10 menit. Hasil amplifikasi diamati pada gel agarosa 0.8% pada alat transilluminator sinar UV. Identifikasi gen 16sRNA isolat bakteri endofit WL-SM1 Identifikasi dilakukan dengan menggunakan data urutan DNA gen 16sRNA isolat WL-SM1 yang telah diolah menggunakan software GENEIOUS R11. Data tersebut kemudian dianalisa secara daring pada laman www.ncbi.nlm.nih.gov dengan menggunakan tool blast terhadap gen 16sRNA bakteri.

H A S I L D A N P E M B A H A S A N

Isolasi dan Karakterisasi Makroskopis dan Mikroskopis Di dalam jaringan tanaman, baik akar, batang, dan daun, terdapat bakteri endofit yang hidup

bersimbiosis dengan tanaman dan membentuk koloni di dalamnya (Bacon & White, 2000). Bakteri endofit dapat diperoleh dengan metode tanam langsung maupun pengenceran. Pada penelitian ini, bakteri endofit diisolasi dengan menggunakan metode tanam langsung di mana potongan daun yang telah disterilisasi diletakkan pada permukaan medium agar. Sterilisasi perlu dilakukan untuk menghindari munculnya bakteri epifit daun. Bakteri endofit akan muncul pada bagian tepi daun (gbr 1). Hal ini disebabkan jaringan pada bagian tepi daun mengalami kontak langsung dengan medium agar di mana medium tersebut mengandung nutrisi yang baik bagi pertumbuhan bakteri.

Tabel 1. Karakteristik Makroskopis dan Mikroskopis

Pada penelitian ini diperoleh empat isolat bakteri endofit yang memiliki perbedaan secara

makroskopis dan mikroskopis (table 1). Pengamatan makroskopis dan mikroskopis perlu dilakukan untuk mengetahui karaksteristik isolat bakteri yang diperoleh. Salah satu karakteristik yang penting dan diperlukan pada tahap isolasi DNA adalah ada tidaknya peptidoglikan pada membrane sel bakteri. Karakteristik tersebut dapat diketahui dengan melakukan pewarnaan Gram (Pratiwi, 2008). Berdasarkan data pada tabel 1, diketahui bahwa hanya bakteri WL-SK yang tidak memiliki peptidoglikan yang dicirikan dengan penampakan merah pada sel bakteri jika diilihat di bawah mikroskop.

Kode isolat Bentuk Warna Elevasi Tepian konsistensi Bentuk sel

Warna sel

WL-SB Tak beraturan

Putih Datar Tak beraturan

Berlendir Basil pendek

Ungu

WL-SK Bundar Putih Cembung Tak beraturan

Berlendir Bulat Merah

WL-SM1 Bundar Putih Datar Tak beraturan

Berlendir Basil pendek

Ungu

WL-SM2 Bundar Putih Cembung Tak beraturan

Berlendir Bulat Ungu

27

Gambar 1. Hasil pewarnaan Gram. A. Isolat WL-SM1, B. Isolat WL-SM2,

C. Isolat WL-SB, D.Isolat WL-SK

Skrining Isolat Bakteri Endofit dengan Aktivitas Antidiare Secara in vitro

Mikroorganisme endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder yang tidak hanya bermanfaat bagi tanaman inang namun juga bagi manusia. Telah diketahui, bahwa keberadaan mikroba endofit di dalam tanaman inang memberikan keuntungan bagi tanaman tersebut seperti membantu pertumbuhan tanaman, dan menghasilkan metabolit sekunder yang dapat melindungi tanaman dari hama, serangga, dan pathogen. Beberapa penelitian juga melaporkan bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroba endofit, khususnya bakteri endofit, memiliki kemampuan untuk menghasilkan metabolit sekunder yang serupa dengan inangnya dan memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan sel-sel kanker, menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen, dan memiliki aktivitas antioksidan.

Tabel 2. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri Salmonella typhi Penemuan senyawa medisinal baru sangat penting dilakukan karena penemuan obat-obatan

baru tidak sepesat dengan kemunculan mikroba pathogen yang resisten terhadap antibiotik. Salah satu sumber yang potensial untuk dieksplorasi adalah mikroba endofit. Isolasi mikroba endofit sebagai sumber penghasil senyawa antidiare diawali dengan pemilihan tanaman yang telah digunakan untuk mengobati diare (Tanvir et al., 2016). Sebagaimana telah dipaparkan sebelumnya

Isolat Bakteri Endofit Daun Salam Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap S. typhii

WL-SB -

WL-SK -

WL-SM1 +

WL-SM2 -

28

bahwa secara empiris daun Salam telah digunakan untuk mengobati penyakit diare dan beberapa penelitian juga melaporkan bahwa ekstrak daun Salam memiliki aktivitas antidiare secara in vitro.

Pada penelitian ini digunakan bakteri S. typhii sebagai mikroba pathogen untuk uji aktivitas antidiare secara in vitro. Salmonella typhii merupakan salah satu bakteri pathogen penyebab penyakit typus dan sering digunakan sebagai mikroba uji untuk aktivitas antidiare (WHO ; Tan & Vairappan, 2011; Trisharyanti 7 Febriani, 2017; Arunachalam C & Gayathri, 2010) . Berdasarkan uji aktivitas dengan menggunakan metode disc diffusion terlihat adanya zona bening di sekitar kertas cakram yang telah direndam dalam hasil fermentasi isolat WL-SM1.

Gambar 2. Hasil Elektroforesis Amplikon Isolat Bakteri WL-SM1. 1: DNA Ladder 1kb, 2: Amplikon isolat bakteri endofit WL-SM1

Identifikasi Isolat SM-WL1 berdasarkan gen 16sRNA

Isolat bakteri endofit dapat diidentifikasi dengan menggunakan informasi yang terdapat pada urutan basa DNA. Organisme prokariot memiliki tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Dari ketiga jenis tersebut 16S rRNA yang paling sering digunakan, karena molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang, sehingga menyulitkan analisis.Gen 16S rRNA merupakan gen yang bersifat spesifik terhadap spesies prokariot sehingga gen 16S rRNA dapat digunakan untuk mempelajari hubungan filogenetik dari suatu spesies bakteri (Clarridge, 2004).

Gen 16sRNA dapat diperoleh dengan teknik Polymerase Chain reaction (PCR) menggunakan primer 27F dan 1492R. Kedua primer tersebut akan secara spesifik menempel pada urutan basa nukleotida yang terdapat pada gen 16sRNA . Adapun besaran gen 16sRNA dengan mengggunakan pasangan primer tersebut sekitar 1500 pasang basa (gbr ). Fragmen DNA hasil PCR yang dikenal dengan istilah amplikon akan digunakan sebagai sumber informasi saat proses sekuensing. Sekuensing merupakan suatu teknik untuk membaca urutan basa nukleotida pada satu untai DNA (Brown, 1995; Sambrook et al., 1989). Berdasarkan data yang diperoleh dari proses sekuensing, suatu organisme dapat diketahui identitasnya dengan melakukan perbandingan kemiripan nukleotida terhadap seluruh data DNA yang terdapat pada bank DNA atau gene bank. Proses pencarian identitas dengan menggunakan gene bank dilakukan secara daring pada laman www.ncbi.nlm.nih.gov.

1 2

1500 pb

29

Gambar 3. Hasil analisa filogenetik DNA isolat bakteri WL-SM1 dengan 10 isolat bakteri secara daring pada laman www.ncbi.nlm.nih.gov

Data nukleotida yang diperoleh pada penelitian ini setelah dibandingkan dengan data gen 16sRNA bakteri pada gene bank memiliki kemiripan dengan gen 16sRNA beberapa bakteri Bacillus sp dengan persen kemiripan lebih dari 99%. Analisis lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan pohon filogenetik untuk mengetahui spesies Bacillus yang paling dekat kekerabatannya dengan isolate WL-SM1. Berdasarkan informasi pada pohon filogenetik, isolate WL-SM1 memiliki kekerabatan yang dekat dengan bakteri Bacillus subtilis strain IAM 12118 (NR_112116) dengan persen kemiripan sebesar 99,9%, sehingga isolate bakteri endofit pada penelitian ini dapat diberi nama dengan B. subtilis strain WL-SM1.

SIMPULAN

Penelitian ini memperlihatkan bahwa pada daun Salam terdapat bakteri endofit dan dari empat isolat yang diperoleh hanya satu yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. typhi secara in vitro. Hasil analisa sekuens menunjukan bahwa isolat WL-SM1 memiliki kemiripan dengan Bacillus spp dan berkerabat dekat dengan B. subtilis strain IAM 12118 (NR_112116).

UCAPAN TERIMA KASIH

30

Penelitian ini dibiayai oleh Lembaga Penelitian dan Pengembangan UHAMKA Tahun Anggaran 2016-2017.

D A F T A R R E F E R E N S I

Arunachalam C & Gayathri P. Studies on Bioprospecting of Endophytic Bacteria from The Medicinal Plant of Andrographis paniculata for Their Antimicrobial Activity and Antibiotic Susceptibility Pattern. International Journal of Current Pharmaceutical Research. 2(4):63-68.

Bacon CW & White J. 2000. Microbial endophytes. CRC Press.

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. 1997. Inventaris Tanaman Obat Indonesia Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan . Hlm. 105-106

Brown TA. 1995. Gene Cloning : An Introduction. Stanley Thomas.

Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Journal Clinical Microbiology Reviews. 17: Hlm. 840-860.

Hariana A. 2006. Seri Agrisehat Tumbuhan Obat dan khasiatnya seri 3. Niaga swadaya. Hal 20-22 Kumala, S. 2014. Mikroba Endofit: Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi. PT. ISFI

Penerbitan. Jakarta. Hlm. 15-48

Kusmiyati, & Agustini NWS. 2007. Uji Aktifitas Senyawa Antibakteri dari Mikroalga. Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Hlm. 48-53

Lee TK & Vairappan CS. 2011. Antioxidant, Antibacterial and Cytotoxiic Avtivitites of Essential Oils and Ethanol Extracts of Selected South East Asian herbs. Journal of Medicinal Plants Research. 5(21): 5284-5290.

Madigan M, Martiko JM, Stahl DA, & Clark DP. 2012. Brock Biology of Microorganisms. 13th Edition. Wageningen Agricultural University. Netherlands. Hlm. 129-130.

Malik A & Ahmad AR. 2013. Antidirrheal Activity of Ethanolic Extract of Bay Leaves (Syzigium polyanthum [Wight] Walp.). Int. Res. J. Pharm. 4(4). DOI: 10.7897/2230-8407.04418

Pratiwi, S. T. (2008). Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga. Hlm. 188-192

Promega Corporation. 2012. Go Taq Green Master Mix. USA. Hlm 1-2

Promega Corporation. 2014. Wizard Genomic DNA Purification Kit. USA. Hlm 14-15

Radji, M. (2005). Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2 (3). Hlm. 113-126

Rosita A. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit dari Umbi Tanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) menggunakan Primer PCR-RAPD. Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri, Malang. Hlm. 62-68.

Sambrook J, Fritsch EF, & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1. Cold Harbor Laboratory.

Simarmata R, Lekatompessy S, & Sukiman H. 2007. Isolasi Mikroba Endofitik dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura procumbens) dan Analisis Potensinya sebagai Antimikroba. Jurnal Berkala Penelitian Hayati. 13: 85-90

Strobel G, Daisy B, Castillo U, & Harper J. 2004. Natural Products from Endophytic Microorganisms. J.Nat.Prod.67: 257-268.

31

Strobel GA. 2002. Rainforest Endophytes and Bioactive Products. Critical Revuews in Biotechnology. 22 (4): 315-333.

Sumono A, Wulan A. The Use of Bay Leaf (Eugenia polyantha Wight) in Dentistry. Dental Journal. 41 (3): 147-150.

Tanvir R, Javeed A, & Bajwa AG. 2016. Endophyte Bioprospecting in South Asian Medicinal Plants: An Attractive Resource for Biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-017-8115-x

Trisharyanti I & Febriani R. 2017. Skrining Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Terhadap Salmonella typhii Resisten Kloramfenikol. Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research.02: 66-77.

32

33

34