BAB I

PENDAHULAN

1.1. Latar Belakang

Saat ini, perkembangan bioteknologi telah mencapai tingkat yang cukup tinggi. Hasil metabolisme dari bakteri banyak digunakan sebagai sumber penemuan obat, salah satunya yang sedang banyak diteliti yaitu bakteri tanah Agrobacterium sp.

Agrobacterium sp merupakan jenis bakteri gram negatif bersifat aerobik, dalam metabolismenya dapat menghasilkan senyawa polisakarida ekstraseluler yaitu β-glukan dengan ikatan β-1,3- dan β-1,2-glikosidik. Senyawa ini bermanfaat di bidang industri makanan maupun bidang kesehatan. Beta glukan memiliki bobot molekul tinggi tergolong senyawa homopolisakarida, yaitu polisakarida yang tersusun dari satu jenis gula. Monomer β-glukan yakni D-glukosa.

Struktur dinding sel Agrobacterium sp pada dasarnya sama dengan bakteri Gram negatif lainnya terdiri dari senyawa peptidoglikan yang terdapat pada lapisan sebelah dalam dan jumlahnya sekitar 10 % dari bobot kering sel. Senyawa ini juga sebagai cadangan makanan bagi bakteri. Selain itu dinding sel juga terdiri dari lipopolisakarida (lapisan antara), dan lipoprotein (lapisan luar). β -Glukan selain sebagai bahan tambahan makanan (penstabil makanan, penambah rasa, peningkat tekstur makanan), juga digunakan sebagai pengikat dalam makanan. Dalam dunia farmasi, jenis glukan yang banyak digunakan adalah β-1,2-glukan dan β-1,3-glukan. Perbedaan keduanya terletak pada ikatan antara monomer satu dengan monomer lainnya. Monomer pada β-1,2-glukan terikat pada C1 dan C2 monomer lainnya secara siklik, sedangkan monomer pada β-1,3-glukan terikat pada C1 dan C3 monomer lainnya dengan rantai lurus.

Beta glukan telah mendapat rekomendasi aman dari Food and Drug Administration (FDA) untuk dikonsumsi manusia. Berbagai penelitian mengungkapkan bahwa β-glukan yang dikonsumsi dapat memberikan efek pengobatan antara lain sebagai antioksidan, antikolesterol, perlindungan terhadap radiasi, antipenuaan dan juga sebagai antitumor.

Beta glukan merupakan suatu homopolisakarida yang dapat disintesis oleh jamur, alga, khamir maupun bakteri. Senyawa ini dapat diekstraksi dan dipisahkan dari hasil fermentasi biakan murni bakteri Agrobacterium sp. Optimalisasi produksi β-glukan dapat dilakukan dengan berbagai cara antara lain melalui peningkatan kemampuan galur potensial secara mutagenesis (genetik). Selain itu juga melalui modifikasi media fermentasi dengan mengkombinasikan bahan media yang digunakan.

1.2. Tujuan Penelitian

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Beta Glukan

Beta Glukan adalah turunan polisakarida alami yang tersusun dari monomer glukosa dengan ikatan β glikosida. Beta glukan banyak ditemukan di gandum ,alga, khamir, dan bakteri. Penelitian mengenai beta glukan sudah cukup banyak dilakukan dalam rangka melakukan isolasi dan menguji aktivitasnya untuk mengatasi berbagai masalah kesehatan manusia. Diawali pada tahun 1940an, penelitian mengenai Zymosan-obat yang beredar di Eropa- sebuah imunostimulator yang diekstrak dari dinding sel khamir yang mengandung lipid, protein dan polisakarida, ternyata mengandung efek negatif bagi kesehatan namun memiliki respon yang baik terhadap penyerangan mikroorganisme patogen seperti virus, bakteri, fungi, parasit dan sel tumor.

Menurut Cheeseman dan Malcom (2000), sifat fisika dan kimia yang dimiliki senyawa β-glukan yaitu:

Di alam, berupa senyawa berwarna putih berupa gumpalan besar dan tidak berbentuk kristal

Tidak mempunyai rasa manis Tidak larut dalam air, netral dan dapat dipisahkan dengan mudah dalam larutan alkali Bila bercampur dengan air maka akan membentuk larutan koloid Berbentuk gel pada suhu 540C

Dua kegunaan β-glukan utama yaitu untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh dan menurunkan kadar kolesterol. Beta glukan diketahui mampu melakukan stimulasi makrofag atu leukosit yang berperan penting sebagai pertahanan awal sistem kekebalan tubuh. Beta glukan membantu makrofag menjadi lebih siap untuk menyerang benda asing yang masuk ke dalam tubuh. Makrofag terdapat pada seluruh jaringan, organ, darah, dan urat yang digolongkan sebagai pagosit yang membinasakan, menghancurkan, dan menyingkirkan partikel asing dalam sel imun.

Beberapa sifat beta glukan menguntungkan bagi kesehatan karena merupakan bahan alami, tidak beracun, tidak memiliki efek samping yang merugikan, membantu regenerasi dan memperbaiki jaringan, mengaktivasi dan memperkuat sistem kekebalan, serta mempertinggi keefektifan obat antibiotik dan antiviral. Dalam industri farmasi, beta glukan dapat berfungsi sebagai untuk nati infeksi, mengobati luka bakar, anti tumor, anti oksidan, dan menurunkan kadar gula darah karena meningkatkan produksi insulin.

Polimer glukan ini merupakan serat yang tidak dapat dicerna, karena manusia tidak memiliki enzim yang dapat menghidrolisis ikatan β- glikosidik. Serat-serat yang tidak larut ini tidak dapat dimetabolisme pada saluran cerna sehingga bermanfaat dalam diet yang berfungsi mengurangi kegemukan.

Jenis beta glukan yang banyak digunakan di industri farmasi adalah β-1,2-glukan (siklosporan), β-1,3-glukan (curdlan) dan β-1,6-glukan. Β 1,2- glukan memiliki sifat yang berbeda dengan β 1,3-glukan. β-1,2-glukan dikenal juga dengan siklik glukan karena polimernya berbentuk siklik. Perbedaan letak ikatan monomer satu dengan yang lainnya menyebabkan perbedaan kelarutan antara keduanya. β-1,2-glukan bersifat larut dalam air. Struktur bagian luarnya bersifat hidrofilik sedangkan bagian dalamnya bersifat hidrofobik sehingga dapat digunakan sebagai carrier bahan-bahan yang sukar larut dalam air. Agrobacterium sp dalam metabolismenya menghasilkan glukan jenis β-1,2-glukan dan β-1,3-glukan.

Rumus kimia untuk beta glukan yaitu (C6H10O5)n dengan strukrur kimia sebagai berikut :

Struktur kimia β-1,3-glukan

2.1.1. Proses Produksi

Untuk memproduksi beta glukan dari mikroba, perlu diperhatikan beberapa hal yang dapat mempengaruhi produk yang dihasilkan. Hal-hal yang harus diperhatikan diantaranya, yaitu pemilihan galur mikroba, nutrisi, dan proses nutrisi.

a. Galur mikroba

Mikroorganisme adalah kunci keberhasilan dari suatu fermentasi. Mikroorganisme harus memiliki beberapa keunggulan yang diperlukan untuk berhasilnya suatu proses biologis. Ciri-ciri yang perlu dimiliki oleh mikrooragisme yang unggul adalah:

Galur tersebut berupa kultur yang murni dan bebas dari mikroorganisme lainnya

Secara genetik harus stabil Galur tersebut harus mampu tubuh dengan cepat, sesaat setelah diinokulasi

pada tangki pembibitan atau wadah lain yang dijadikan reaktor Galur tersebut dapat menghasilkan produk yang diinginkan dalam jangka

waktu yang pendek Jika memunginkan, galur mikroba tersebut hendaknya mampu melindungi

dirinya sendiri dari kontaminasi dengan cara menyesuaikan diri dengan lingkungan.

Galur tersebut mampu memproduksi produk yang diinginkan tanpa menghasilkan produk lain yang bersifat racun.

b. Nutrisi

Semua makhluk hidup mempunyai persyaratan yang sama dalam hal pemenuhan nutrisi yang diperlukan unruk pertumbuhan dan perkembangan. Semua makhluk hidup membutuhkan sumber energi, sumber karbon, nitrogen, unsur logam, vitamin dan air. Komposisi nutrisi mempengaruhi hasil metabolisme dari mikroorganisme. Pemilihan media yang baik sama pentinganya dengan pemilihan mikroorganisme yang digunakan untuk menghasilkan produk yang dikehendaki. Beberapa faktor yang mempengaruhi pemilihan media adalah tersedia dan mudah didapat, sifat proses bilologi dan faktor harga.

2.1.2. Faktor- faktor penentu produksi

Berhasilnya suatu fermentasi tergantung pada kondisi lingkungan yang ditentukan untuk pertumbuhan sel dan pembentukan produk. Suhu, pH, tingkat agitasi, konsentrasi oksigen terlarut dan faktor-faktor lainnya harus dipertahankan konstan selama fermentasi berlangsung. Pengamatan selama proses fermentasi langsung memberikan beberapa inforamsi penting antara lain waktu yang tepat untuk pemanenan hasil dan apakah fermentasi berlangsung secara tidak normal yang merupakan petunjuk adanya kontaminasi dan degenerasi galur. Parameter fermentasi dapat digolongkan ke dalam dua kelompok yaitu parameter yang berhubungan dengan lingkungan fisik dan kimia. Parameter lingkungan fisik meliputi suhu, tekanan, buih, laju aliran gas dan cairan, viskositas, kekeruhan dan parameter yang berhubungan dengan lingkungan kimia seperti pH, potensial redoks, O2 dan CO2 terlarut, O2 dan CO2 yang keluar, serta konsentrasi komponen-komponen dalam medium.

2.2.. Agrobacterium sp

Klasifikasi Ilmiah

Kerajaan : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Alpha Proteobacteria

Ordo : Rhizobiales

Famili : Rhizobiaceae

Genus : Agrobacterium

Species

Agrobacterium radiobacter

Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rubi

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium sp digolongkan ke dalam famili Rhizobiaceae yang merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang. Bakteri ini berukuran (0,6-1) x (1,5-3) μm, selnya dapat tunggal atau berpasangan. Selnya tidak membentuk spora dan dapat bergerak (motil) dengan 1 sampai 6 falgela (peritrik).

Bakteri ini bersifat aerob, dengan tipe metabolisme respirasinya menggunakan oksigen sebagai aseptor electron terminal. Suhu optimum pertumbuhan antara 25-28oC. Koloni umumnya berbentuk cembung, sirkular, halus, tidak berpigmen sampai berwarna putih kekuningan.

Struktur dinding sel Agrobacterium sp pada dasarnya sama dengan bakteri Gram negatif lainnya terdiri dari senyawa peptidoglikan yang terdapat pada lapisan seelah dalam dan jumlahnya sekitar 10% dari bobot kering sel. Senyawa ini juga sebagai cadangan makanan bagi bakteri. Selain itu dinding sel juga terdiri dari lipopolisakarida (lapisan antara) dan lipoprotein ( lapisan luar)

BAB III

PEMBAHASAN

3.1. Bahan dan Metode

Mikroorganisme

Bakteri yang digunakan adalah Agrobacterium sp, yaitu Agrobacterium radiobacter A1-5. Isolat diremajakan di dalam medium Luria agar ( LA) dalam tabung reaksi.

Media

Media pertumbuhan bakteri yang digunakan yaitu medium PY dengan komposisi sebagai berikut: Ekstrak ragi 0,5%, kaldu pepton 1%, dan NaCl 0,5%. Bahan-bahan tersebut ditimbang dan dilarutkan dengan akuades di dalam erlenmeyer. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC , tekanan 1 atmosfer selama 15 menit

Media Fermentasi yang digunakan dengan komposisi sebagai berikut : 4 g glukosa, 500 mg CaCO3, 150 mg (NH4)2HPO4, 100 mg KH2PO4, 50 mg MgSO4.7H2O, 100 mg ekstrak ragi, 0,1 ml Larutan mineral A, 0,1 ml larutan mineral B dan 100 ml akuades.

Prakultur Bakteri

Sebanyak satu ose Agrobacterium radiobacter segar hasil peremajaan dalam medium LA miring, diinokulasikan ke dalam medium PY cair untuk prakultur. Biakan diinkubasikan pada shaker dengan putaran 150 rpm selama 1 hari pada suhu ruangan

Produksi Beta Glukan

Sebanyak 2 % prakultur bakteri yang diuji diinokulasikan ke dalam media fermentasi. Kultur diinkubasi pada shaker dengan putaran 150 rpm selama 6 hari pada suhu ruangan untuk memproduksi beta glukan.

Ekstraksi Beta Glukan

Kultur yang tumbuh pada media fermentasi disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 25oC. Endapan yang terbentuk merupakan biomassa sel sedangkan supernatan dipisahkan untuk mendapatkan beta 1,2- glukan.

Endapan ditambahkan dengan HCl dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan NaOH 1 N dan disentrifugasi kembali pada kondisi yang sama. Endapan yang terbentuk dipisahkan dan dikeringkan sebagai berat sel kering (gram). Supernatan ditambah HCl 5 N hingga mencapai pH netral, keudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Endapan yang dihasilkan ditambah H2O dan etanol kemudian secara berurutan disentrifugasi pada kecepatan 5.000 selama 15 menit pada suhu ruang. Hasil ekstraksi β-1,3-glukan dikeringan dan ditimbang (gram)

Bagian supernatan yan dipisahkan dari endapan sel pada sentrifus kultur bakteri, ditambah etanol sebanyak dua kali volume larutan dan disentrifugasi pada kecepatan 6.000 selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan dievaporasi hingga ± 1 ml. Hasil evaporasi kemudian ditambah etanol sebanyak 10 kali volume larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6.000 selama 15 menit. Endapan yang terbentuk kemudian dikeringkan dan ditimbang sebagai β 1,2-glukan (gram).