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Informe del Comit Cientco de la Agencia Espaola de SeguridadAlimentaria y Nutricin (AESAN) sobre contaminacin vrica de losalimentos, con especial nfasis en moluscos bivalvos, y mtodos decontrol

Miembros del Comit CientcoRosaura Farr Rovira, Francisco Martn Bermudo, Ana Mara CamenFernndez, Alberto Cepeda Sez, Mariano Domingo lvarez, AntonioHerrera Marteache, Flix Lorente Toledano, M Rosario Martn de Santos,Emilio Martnez de Victoria Muoz, M Rosa Martnez Larraaga, AntonioMartnez Lpez, Cristina Nern de la Puerta, Teresa Ortega Hernndez-Agero, Perfecto Paseiro Losada, Catalina Pic Segura, Rosa Mara PintSol, Antonio Pla Martnez, Daniel Ramn Vidal, Jordi Salas-Salvad, MCarmen Vidal Carou.

SecretarioVicente Caldern Pascual

Nmero de referencia: AESAN-2011-005Documento aprobado por el Comit Cientco en

su sesin plenaria de 18 de mayo de 2011

Grupo de Trabajo

Rosa M. Pint Sol (Coordinadora)

M Rosario Martn de Santos

Albert Bosch Navarro (Consultor externo)

ResumenLos principales virus asociados con enfermedades de transmisin alimentaria son los Norovirushumanos (NoV), causantes de gastroenteritis, y el virus de la hepatitis A (HAV) que origina hepatitisaguda. Estos virus no se multiplicanin vitro , o lo hacen con muchas dicultades, por lo cual su deteccin

en alimentos se basa en tcnicas moleculares. Los principales alimentos involucrados en infeccionesvricas transmitidas por alimentos son los moluscos bivalvos, las verduras que se consumen crudas y lasfrutas tipo baya. La estandarizacin de los mtodos moleculares es requisito indispensable para que sepuedan adoptar en marcos reguladores e implementar de forma rutinaria en el anlisis de alimentos.Un grupo de trabajo del Comit Europeo de estandarizacin (CEN/TC 275/WG6/TAG4-viruses in foods)ha desarrollado y validado mtodos de referencia para la deteccin de virus en matrices alimentarias. Ladeterminacin cuantitativa de virus en alimentos permitira la prediccin del riesgo sanitario asociadoa su consumo, puesto que a mayor nmero de copias genmicas vricas mayor riesgo de infeccin.

Palabras claveNorovirus humanos, virus de la hepatitis A, RNA,Real-time -RT-PCR, estandarizacin, copias genmicas.

Report of the Scientific Committee of the Spanish Agency for Food Safetyand Nutrition (AESAN) in relation to the viral contamination of foodstuffs,with special emphasis on bivalve molluscs and control methods.

Abstract

The viruses primarily associated with food-borne illness are human Norovirus (NoV), causinggastroenteritis, and Hepatitis A virus (HAV) causing acute hepatitis. These viruses do not grow, or grow


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with many difculties,in vitro and thus their detection in food matrices relies on molecular techniques.The major foodstuffs involved in food-borne viral infections are bivalve molluscs, salad vegetables anberries. Standardization of molecular methods is necessary before their adoption within regulatoryframeworks and their routinely implementation in food analysis. A European standardization working

group (CEN/TC 275/WG6/TAG4-viruses in foods) has developed standard methods for virus detectionfoodstuffs. Quantitative determination of viruses in food would allow the assessment of the associatedhealth risk after consumption of bivalves with a given number of virus genome copies since highernumber of genome copies correlate with higher risk of infection.

Key wordsHuman Noroviruses, Hepatitis A virus, RNA, Real-time-RT-PCR, Standardization, Genome copies.


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IntroduccinLos virus entricos son aquellos transmitidos por la va fecal-oral y por ende aquellos que potencialmentepueden estar presentes en alimentos que hayan sufrido contaminacin con materia fecal.

Entre los virus entricos humanos destacan diversos agentes productores de gastroenteritis como

los Norovirus, Sapovirus, Astrovirus, Rotavirus y Adenovirus del grupo F, as como los agentes de lashepatitis entricas (A y E). Atendiendo al nmero de brotes alimentarios asociados a estos agentes, losms importantes desde la perspectiva de seguridad vrica de los alimentos son: Norovirus genogrupoI (NoV GI) y II (NoV GII) y el virus de la hepatitis A (HAV). No obstante, no hay que menospreciar lposibilidad de que se originen futuros brotes alimentarios de gastroenteritis por Sapovirus, debido asu creciente incidencia en la poblacin, as como de hepatitis E que aun siendo una hepatitis de bajaincidencia en nuestras latitudes es muy comn en China y sudeste asitico y, en el contexto actual decomercio global de alimentos, representa un riesgo potencial. Cabe destacar que algunos animales,como el cerdo y el jabal, pueden tambin ser infectados por el virus de la hepatitis E y actuar comoreservorio del virus, puesto que se han documentado algunos casos de infeccin en humanos porconsumo de hgado poco cocinado proveniente de animales infectados.

Entre los alimentos que presentan un mayor riesgo de estar contaminados por virus entricosdestacan los moluscos bivalvos por su alta capacidad de ltracin y de concentracin de los vi-rus potencialmente presentes en el agua de cultivo, as como las verduras que se consumen enensalada y las frutas tipo baya irrigadas con aguas con aportes fecales. Este tipo de alimentos suelenconsumirse crudos o poco cocinados incrementando al mximo el riesgo de infeccin. Asimismo, esposible la contaminacin de los alimentos por una manipulacin higinica deciente por parte de losmanipuladores, tanto sintomticos como asintomticos, excretores de virus.

Un importante factor que contribuye a la transmisin de los virus entricos a travs de alimentos essu elevada estabilidad extracorprea o ambiental que en algunos casos, como por ejemplo en el HAV,es extrema.

Debido a que los alimentos son una de las fuentes de transmisin de los virus entricos, a que, enocasiones, los brotes afectan a comunidades cerradas de poblaciones de riesgo (hospitales, residencias)y a que Espaa es un importante pas productor y consumidor de moluscos bivalvos, que son uno de losprincipales alimentos potencialmente involucrados en la transmisin de estos virus, la Direccin Ejecutiva

de la Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y Nutricin (AESAN) ha solicitado al Comit Cientcla elaboracin de un informe que valore el estado del conocimiento respecto a la contaminacin vrica delos alimentos, con especial nfasis en moluscos bivalvos, y sus mtodos de control.

Este informe permitir valorar el grado de conocimiento sobre este tema en Espaa y hacer unplanteamiento de futuro respecto a las necesidades de informacin que se suscitan ante la posibilidadde que, por parte de la Comisin Europea, se establezcan lmites para determinados virus en alimentos(moluscos bivalvos).

Biologa de los Norovirus (NoV)Los Norovirus (NoV) son miembros de la familiaCaliciviridae (Fauquet et al., 2005) y como tales sonvirus no envueltos con cpside icosadrica de unos 27-40 nm de dimetro en cuyo interior albergan un


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genoma RNA de cadena simple de polaridad positiva de unas 7 Kb. Dicho genoma contiene tres pautasabiertas de lectura que codican respectivamente para las protenas no estructurales, que incluyenlos enzimas requeridos en la replicacin y una proteasa, la protena mayoritaria de la cpside o VP1y la protena minoritaria de la cpside o VP2. Una caracterstica muy importante del genoma de los

Norovirus es su elevada variabilidad (Domingo y Vennema, 2008).Por otra parte, hay que destacar que a pesar de inmensos esfuerzos no se ha conseguido replicar

estos virus en cultivo celular (Duizer et al., 2004). Aunque existen referencias que indican lo contrario, lfalta de reproducibilidad de los resultados descritos pone en duda la veracidad de la adaptacin de losNorovirus a multiplicar en cultivo celular (Straub et al., 2007). Se cree que la incapacidad de replicarinvitroviene determinada por la falta del receptor(es) adecuados en las lneas celulares testadas puestoque la transfeccin del RNA vrico da lugar a ciclos infecciosos monocelulares (Guix et al., 2007). Edenitiva, todo ello lleva a la utilizacin de tcnicas moleculares para su deteccin (Kageyama et al.,2003) (Loisy et al., 2005) (Lowther et al., 2008). Ello unido a la alta variabilidad anteriormente citadaimplica la necesidad de escoger, mediante criterios muy slidos las regiones mejor conservadas delgenoma para el desarrollo de las tcnicas moleculares de deteccin (Pint y Bosch, 2008).

Los NoV se clasican en cinco grandes genogrupos. Los NoV humanos pertenecen a los genogrupoI (GI), II (GII) y IV (GIV). Dentro del genogrupo II se encuentran tambin virus que infectan cerdos yel genogrupo III virus que infectan bovinos y aunque no se ha demostrado de forma dedigna se hasugerido que podra tratarse de agentes zoonticos. Cada genogrupo contiene mltiples genotipos queemergen y varan temporalmente (Koopmans, 2005) (Siebenga et al., 2007b) (Domingo y Vennema,2008) (Kroneman et al., 2008). Los genogrupos se denominan por nmeros romanos y los genotipospor nmeros rabes (Atmar, 2010).

La transmisin de los NoV humanos se da, principalmente, va ingestin de agua o alimentoscontaminados as como por contacto persona-persona o por contacto con fomites contaminados.Ciertos genotipos se asocian ms a un tipo de transmisin concreto. As se ha descrito que el genotipoGII.4 se transmite mayoritariamente por contacto persona-persona, mientras que los brotes originadospor consumo de bivalvos contaminados se asocian generalmente al genogrupo GI (Le Guyader et al.,2006b) (Siebenga et al., 2007a). No hay que olvidar que se ha demostrado que los Norovirus humanosdel genotipo GI.1 se internalizan de forma especca en las clulas del hepatopncreas de ostras (Le

Guyader et al., 2006a). Adems se han descrito diferencias entre los distintos genotipos en cuanto a lainteraccin con distintos ligandos. As el genotipo GI.1 usa como ligando un carbohidrato que contieneun antgenoA-like , y que est presente slo en clulas del hepatopncreas, mientras que el genotipoGII.4 utiliza adems de este carbohidrato otro que contiene cido silico y que se halla presente enla gran mayora de tejidos (Le Guyader et al., 2006a) (Maalouf et al., 2010). Se cree que la unin aligandos con cido silico sera ms dbil, de forma que los virus del genotipo GII.4 se internalizarancon menor eciencia que la unin a ligandos con antgenoA-like lo cul contribuira a una mayorpersistencia de los virus del genotipo I.1 y a una menor ecacia de los procesos de depuracin.

El perodo de incubacin de la enfermedad oscila de 10 a 51 horas y la dosis infecciosa es baja (Glasset al., 2009). Para el caso concreto del virus Norwalk, Teunis et al. (2008) estimaron una dosis infecciosaal 50% de entre 18 y 1.000 partculas vricas. En cierto tipo de alimentos como el marisco se detectan


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habitualmente concentraciones muy superiores a las citadas, quedando patente el riesgo asociado (LeGuyader et al., 2003) (Le Guyader et al., 2010). Por otra parte, estos niveles de virus son excretadospor pacientes antes de mostrar ninguna sintomatologa e incluso despus de que sta haya cesado, locual pone de maniesto el potencial papel de los manipuladores de alimentos en la transmisin de la

gastroenteritis por NoV. Se estima que las gastroenteritis por NoV de origen alimentario representanentre un 12% y un 47% del total de gastroenteritis por NoV y el resto se originara por contactopersona-persona o contacto con fomites contaminados (FAO/WHO, 2008).

Biologa del virus de la hepatitis A (HAV)El virus de la hepatitis A (HAV) pertenece a la familiaPicornaviridae (Fauquet et al., 2005) y comotal es un virus desnudo con cpside icosadrica de unos 27 nm de dimetro que contiene un RNA depolaridad positiva de unas 7 Kb. A diferencia de los NoV, el genoma de los picornavirus contiene unanica pauta de lectura abierta. A nivel gentico, el HAV destaca por tener una tasa de mutacin alta anivel de mutaciones sinnimas, dentro del intervalo de otros picornavirus, pero una tasa especialmentebaja en cuanto a mutaciones no sinnimas (Sanchez et al., 2003), sobretodo a nivel de la cpside.Esta caracterstica denota fuertes constricciones estructurales que explican la baja variabilidad ami-noacdica de la regin de la cpside y la existencia de un nico serotipo. Sin embargo, bajo presininmune se pueden seleccionar mutantes de escape a anticuerpos monoclonalesin vitro (Aragonset al., 2008) e incluso a las vacunas existentesin vivo (Perez-Sautu et al., 2011). La razn ltima dedichas constricciones estructurales se encuentra a nivel genmico en un uso muy sesgado de codonesque es antagnico al de la clula hospedadora y con una localizacin estratgica de acumulacionesde codones raros en ciertas regiones del genoma codicante de la cpside, con el n de ralentizarla velocidad de traduccin y permitir el plegamiento correcto de la protena (Aragons et al., 2010).Ello permite al virus tener una cpside altamente cohesiva, siendo muy destacable la estabilidad delHAV frente a diversos agentes fsicos y qumicos, como altas temperaturas y bajo pH (Hollinger yEmerson, 2007), a diversas condiciones ambientales extremas, como desecacin (Abad et al., 1994),y a desinfeccin (Abad et al., 1994). La necesidad de mantener estas agrupaciones de codones raros,que jugaran un papel importante en la biologa estructural de la cpside del virus, explicara la bajavariabilidad aminoacdica puesto que es infrecuente una mutacin que d lugar a un cambio de ami-

nocido compatible con la estructura y que adems conserve el grado de rareza del codn. Este usoespecial de codones se debe adems contextualizar con otras caractersticas muy particulares de labiologa molecular del HAV como son una formacin, altamente ineciente, del complejo de iniciacinde la traduccin (Brown et al., 1994) (Whetter et al., 1994) y la incapacidad de inducir la inhibicin dela sntesis proteica celular (Ali et al., 2001). En conjunto todo ello contribuye a unas tasas de replicacindel virus muy bajas y as slo unas pocas cepas del virus se han podido adaptar a la multiplicacin encultivo celular. Las cepas silvestres del virus se deben detectar por tcnicas moleculares basadas enregiones altamente conservadas del genoma.

A pesar de existir un nico serotipo del virus, se reconocen seis genotipos (I al VI) de los cuales elI, II y III corresponden a cepas humanas y el IV, V y VI a cepas de simio (Costa-Mattioli et al., 2002).No existen datos que indiquen que unos genotipos se transmitan ms de un modo u otro, como se


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ha sealado para los NoV, y ni siquiera parece que haya diferencias en cuanto a patogenicidad entrelos distintos genotipos (Rezende et al., 2003). Los genotipos ms bien denotan distintos orgenesgeogrcos (Robertson et al., 1992).

La hepatitis A es una hepatitis aguda que nunca cronica. El perodo de incubacin es de alrededor

de tres semanas durante las cuales el virus se excreta asintomticamente en grandes cantidades enlas heces de los pacientes. Ello es as porque es durante este perodo que el virus replica activamenteen hgado, pero la sintomatologa, que incluye elevacin de las transaminasas e inamacin heptica,viene dada ms por la respuesta inmune celular adaptativa al cabo de las tres semanas, que por lapropia replicacin vrica (Hollinger y Emerson, 2007). Otro problema aadido, desde la perspectivade la contaminacin de alimentos, es que en nios menores de 5 aos la hepatitis A es mayormenteasintomtica pero el virus se excreta en grandes cantidades. La dosis infecciosa es muy baja y se haestimado en 10-100 partculas (FDA/CFSAN, 1992). Como en el caso de los NoV estos bajsimos nivese superan ampliamente en las heces de los pacientes (108 copias genmicas por gramo) y de ah laimportancia de los excretores asintomticos.

A diferencia de los NoV, que son virus emergentes a escala global, el HAV es slo endmico en pasecon condiciones sociosanitarias bajas y de ah la trascendencia de las importaciones de alimentoscontaminados (Costafreda et al., 2006) (Pinto et al., 2009) (Polo et al., 2010). Adems, en los pases noendmicos, como Espaa, la poblacin no entra en contacto con el HAV en la infancia con lo cual llegaa la edad adulta inmunolgicamentenave y es precisamente en la edad adulta cuando se maniestala infeccin clnicamente ms importante llegando a una mortalidad del 1% en la poblacin de ms de60 aos (Hollinger y Emerson, 2007).

Se estima que las hepatitis A de origen alimentario representan slo alrededor del 5% del total yel resto se originaran por contacto persona-persona o contacto con fomites contaminados (FAO/WHO,2008).

Deteccin y cuanticacin molecular de NoV humanos y HAV en matricesalimentariasComo se ha sealado anteriormente, ni las cepas silvestres del HAV ni los NoV humanos replicanen cultivo celular lo cul hace necesaria la aplicacin de tcnicas moleculares para su deteccin y

cuanticacin, puesto que alternativas como la deteccin inmunolgica presentan el inconvenientede falta de sensibilidad para la deteccin de los bajos niveles de contaminacin presentes en losalimentos. En los ltimos aos se han publicado numerosas metodologas basadas en la aplicacin dela reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), concretamente en la combinacin de la retrotranscripcinde RNA a cDNA y la amplicacin del cDNA por PCR (tcnica de RT-PCR), para la deteccin del HNoV en matrices alimentarias. Sin embargo, aunque todas ellas, ms o menos correctas dependiendode una buena seleccin deprimers de regiones altamente conservadas de los genomas, adolecen defalta de armonizacin y estandarizacin. Es por ello que un Comit de la Direccin General Sanco dela Unin Europea (UE) (CEN/TC 275/WG6/TAG4-viruses in foods) est desarrollando y validando desde2004 una doble metodologa estandarizada (cuantitativa y cualitativa) para la deteccin del HAV yNoV humanos en matrices alimentarias (verduras de ensalada, supercies alimentarias, frutas tipo


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baya, moluscos bivalvos y agua embotellada) con el n de establecer mtodos de referencia. La parteprimera del estndar (mtodo cuantitativo) y la segunda parte (mtodo cualitativo) se presentaron en2009 y 2010, respectivamente, a los pases miembros del Comit Europeo de Normalizacin (CEN) parasu valoracin tcnica y formal. La publicacin denitiva de los mtodos se espera para 2012.

La estandarizacin de las metodologas se basa en tres puntos: En primer lugar, es clave escoger las regiones ms conservadas del genoma de los virus a detectar,

para que las tcnicas sean de amplio espectro. La estructura secundaria del genoma de los virusRNA puede tener en s misma una funcin determinante en el ciclo replicativo del virus. Por ello, esevidente que las regiones genmicas involucradas en la formacin de dichas estructuras debernser altamente conservadas entre cepas y, por lo tanto, que la secuencia de las mismas tender aser menos variable. Disearprimers dirigidos contra dichas regiones es un valor seguro para hacerfrente a la alta tendencia a la variacin que presentan los virus RNA (Pint y Bosch, 2008). En elcaso del HAV, la regin mejor/ms altamente conservada se halla en el extremo 5 no codicantedel genoma puesto que contiene una estructura secundaria implicada en la formacin delcomplejo de iniciacin de la traduccin, concretamente la estructura denominada IRES (InternalRibosome Entry Site ) (Costafreda et al., 2006). En el caso de los NoV no existe una estructuraparecida al IRES del HAV y una alternativa es la regin comprendida entre el nal del ORF1 (pautade lectura abierta codicante de la polimerasa) y el principio del ORF2 (pauta de lectura abiertaque codica para las protenas de la cpside) o unin ORF1/ORF2 dnde se ha detectado un altogrado de conservacin logentica y dnde presumiblemente debe de existir una estructura delRNA que permita la sntesis del RNA subgenmico molde para la produccin de altas cantidadesde protenas de la cpside (Kageyama et al., 2003).

En segundo lugar, las reacciones moleculares para la retrotranscripcin del RNA (Transcriptasainversa, RT) hasta cDNA y su posterior amplicacin (Polimerasas termoestables) son muy sen-sibles, particularmente la RT, a diversidad de inhibidores. Es por ello necesario la inclusin decontroles exhaustivos que convenientemente adicionados a los tubos de reaccin permitancontrolar la eciencia de las actividades enzimticas.

En tercer lugar, y de forma muy importante, es necesario controlar el punto ms crtico de ladeteccin de virus en alimentos: el proceso de extraccin de los virus y sus genomas. Cualquier

mtodo molecular, por sensible que sea, ser un rotundo fracaso si no se consigue extraer deforma eciente los cidos nucleicos a detectar. Por desgracia, no existen mtodos milagrosospara la extraccin de los cidos nucleicos vricos a partir de matrices alimentarias y los mejoresde ellos ofrecen eciencias que no suelen superar el 10%. Por ello es de vital importanciacontrolar la eciencia de dicho proceso y la mejor alternativa es el uso de un virus modeloaadido a concentraciones conocidas a la muestra, previamente al proceso de extraccin. Dichovirus control debe cumplir una serie de requisitos que son: tener una estructura parecida ypropiedades sicoqumicas similares a los virus diana a detectar, que nunca pueda estar presenteen las muestras y por supuesto que no tenga potencial patognico, es decir un virus atenuado(Pint y Bosch, 2008).


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Todas estas premisas se contemplan y cumplen rigurosamente en el protocolo CEN/TC 275/WG6TAG4-viruses in foods.Adems, la inclusin de los controles descritos permite no slo detectarcualitativamente la presencia de virus en alimentos, sino que disponiendo de sistemas de determinacinde las eciencias de los puntos crticos de la tcnica permite cuanticar con buena precisin el nmero

de copias genmicas presentes en la muestra.Disponer de una metodologa estandarizada que permita comparar datos obtenidos por distintos

laboratorios y analizar la contaminacin de productos de diversas procedencias geogrcas representa unvalor aadido importantsimo desde la perspectiva de la seguridad vrica de los alimentos. Sin em bargolas tcnicas moleculares adolecen de no proporcionar informacin sobre el potencial infeccioso de losvirus presentes en una muestra alimentaria, puesto que lo que se determina es la presencia del genomade los virus (tcnicas cualitativas) o el nmero de copias genmicas (tcnicas cuantitativas) y ello no essinnimo de infectividad, puesto que podra ser que la cpside del virus estuviera alterada e incapaz deunirse al receptor e iniciar el ciclo biolgico, o incluso que el genoma estuviera alterado en otras regionesdistintas a la de deteccin. Es por ello de vital importancia llevar a cabo estudios rigurosos del nivel decontaminacin presente en distintos tipos de alimentos y con procedencias distintas y compararlo con losniveles de ataque asociados entre sus consumidores, para intentar determinar el nivel mximo permisiblede copias genmicas en dichos alimentos. Es decir, al menos para las tcnicas cuantitativas, se trata deestablecer unos lmites por debajo de los cuales el riesgo de infeccin tras el consumo de esos alimentossea muy bajo, teniendo en cuenta que el riesgo cero no existe.

Contaminacin por NoV humanos y HAV en moluscos bivalvos: revisin bi-bliogrcaEl tipo de alimento que ha sido analizado de forma ms exhaustiva y rutinaria para la deteccin devirus entricos es el molusco bivalvo. Por ello, este informe se centra en los datos existentes en estetipo de matriz alimentaria.

Los moluscos bivalvos son animales ltradores que concentran el material particulado presente enlos grandes volmenes de agua que diariamente ltran con el n de obtener su alimentacin. Entredicho material particulado se pueden encontrar protozoos, bacterias y virus que infectan humanos silas aguas de cultivo han recibido vertidos fecales. Aunque estos agentes patgenos se encuentran

diluidos en el agua de cultivo, despus del proceso de ltrado quedan concentrados en los tejidos de losbivalvos, especialmente en el hepatopncreas. En la actualidad no existen tratamientos de depuracinde marisco bivalvo cien por cien efectivos en la eliminacin de virus, y los que consiguen mayoreseliminaciones son incompatibles con las exigencias organolpticas de este tipo de alimento. Por ello,la prevencin de las infecciones asociadas al consumo de bivalvos pasa por el control de las aguas decultivo. Sin embargo, los criterios microbiolgicos clsicos basados en recuentos deEscherichia coli enel agua de cultivo o en tejido de bivalvo no garantizan la ausencia de virus en los bivalvos. Por ello,es recomendable la deteccin y/o cuanticacin de virus ya sea en las aguas de cultivo o en el propiomarisco bivalvo. El laboratorio de referencia para el control de la calidad vrica del marisco bivalvode Europa, en colaboracin con los laboratorios de referencia de los Estados miembros de la UE, haoptado por el control de virus en producto nal.


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En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de muestras positivas para NoV humanos y/o HAV en distintosestudios que analizan la presencia de dichos virus en moluscos bivalvos recolectados y distribuidosen distintos pases europeos durante el perodo 2001-2008. En nueve estudios se analizaron sloNoV, en dos slo HAV y en cinco ambos virus. En estos ltimos estudios, que comprenden anlisis de

muestras procedentes de Francia, Espaa e Italia, destaca la mayor frecuencia de deteccin de NoVhumanos. Adems, se pone de maniesto la alta prevalencia de HAV en muestras originarias de Italia,concretamente en los mares Jnico y Adritico que baan las costas de la regin de la Puglia que esendmica para hepatitis A. En el resto de estudios de marisco procedente de otros pases europeosdestaca la alta frecuencia de deteccin de NoV humanos que es, por otro lado, independiente dela categora de la zona de recoleccin, es decir no existe correlacin entre la positividad para NoVhumanos y el nivel de contaminacin bacteriano de la zona de cultivo. Dicha observacin est enconcordancia con muchos trabajos publicados con anterioridad (Le Guyader et al., 2000) (Romalde etal., 2002) (Vilarino et al., 2009). Y de ah un argumento ms para el control de la presencia de virusen marisco puesto que no hay garanta de ausencia de virus con las actuales normas de clasicacinde las zonas de cultivo. Sin embargo, ello no signica que no deba controlarse el agua de las zonasde cultivo sino todo lo contrario hay que controlarlas segn los criterios microbiolgicos habituales yadems se debe establecer un control de la presencia de virus.


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Tabla 1. Porcentaje de muestras de marisco positivas para NoV humanos y/o HAV en distintos estudios deanlisis de marisco recolectado en las costas europeasPas de Punto Fecha de Nmero Tcnica NoV HAV Referenciaorigen muestreo recoleccin muestras deteccin

Tienda al detalle 2004-2008 58 Real time 12% NT1 (Boxman, 2010)

Francia Holanda RT-PCR Tienda al detalle Suiza 2001-2002 61 RT-PCR 13% 0% (Beuret et al., 2003)EspaaGalicia rea B 2005 24 Real time 58% 0% (Vilarino et al., 2009) RT-PCR

rea C 2005 17 Real time 53% 0% (Vilarino et al., 2009) RT-PCRItaliaDelta del rea B 2005-2006 96 RT-PCR y 10% 0% (Suffredini et al.,

ro Po Real time 2008)Mar Adritico rea B 2003-2004 235 RT-PCR 14% 6% (Croci et al., 2007)Puglia Tienda al detalle Italia 2005-2008 116 RT-PCR 12% NT (Terio et al., 2010)Mar Jnico rea B 2002 29 RT-PCR NT 90% (Di Pinto et al., 2003)Mar Jnico rea C 2002 20 RT-PCR NT 30% (Di Pinto et al., 2003)Gran Bretaa/IrlandaGran rea B 2004-2006 237Real time 57% NT (Lowther et al., 2008)Bretaa RT-PCRIrlanda rea A 2005-2007 119Real time 31% NT (Flannery et al., 2009) RT-PCRIrlanda rea B 2005-2007 42 Real time 54% NT (Flannery et al., 2009) RT-PCRIrlanda rea C 2005-2007 6 Real time 33% NT (Flannery et al., 2009) RT-PCRHolandaHolanda Tienda al detalle 2004-2008 126Real time 9% NT (Boxman, 2010)

Holanda RT-PCRHolanda rea A 2004-2008 104Real time 1% NT (Boxman, 2010)

RT-PCR

Holanda rea A 2003-2004 21 RT-PCR 5% NT (Boxman et al., 2006)Alemania/Pases NrdicosAlemania/ rea A 2004-2008 36Real time 11% NT Boxman, comunica-Dinamarca RT-PCR cin personalNoruega rea A 2000-2003 681Real time 7% NT (Myrmel et al., 2004) RT-PCR)

1NT: No tratado. Fuente: (Boxman, 2010).


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Niveles de contaminacin por NoV humanos y HAV en moluscos bivalvosdistribuidos en EspaaDistintos laboratorios espaoles estn ya implementando las metodologas desarrolladas en el CEN/TC275/WG6/TAG4-viruses in foods para el control y cuanticacin de virus en marisco.

En la Tabla 2 se muestran los niveles de contaminacin para NoV humanos GI y GII y HAV dedistintos tipos de marisco de diversa procedencia. Los resultados mostrados son las medias de lascopias genmicas crudas por gramo de hepatopncreas, sin aplicar los factores de correccin deeciencia de extraccin y amplicacin, puesto que la metodologa CEN/TC 275/WG6/TAG4-virusesin foods establece que las muestras con eciencias de extraccin y/o amplicacin


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En la Tabla 4 se muestran los valores corregidos de todas aquellas muestras para las que se obtuvieroneciencias de extraccin por encima del nivel de corte del 1% propuesto por la metodologa CEN/TC275/WG6/TAG4-viruses in foods. Como puede observarse los niveles de copias genmicas por gramode hepatopncreas aumentan de forma signicativa debido a los factores de correccin.

Tabla 3. Porcentaje de muestras de marisco con eciencias de extraccin de virus y cidos nucleicos consideradasmalas (10%)

Eciencia Extraccin Lab. 1 Lab. 2 Lab. 3 Lab. 4 MediaSD

10% 5 52 0 18 1923

Tabla 4. Anlisis de los niveles de contaminacin vrica de marisco distribuido en Espaa. Los virus testadosson NoV humanos GI y GII y HAV. La concentracin vrica se expresa como media SD de las copias genmicaspor gramo de hepatopncreas corregidas teniendo en cuenta las eciencias de extraccin y/o amplicacin. Lasmuestras negativas no se incluyen en el clculo de las medias. En aquellos casos dnde se dispone de una nicamuestra se indica el resultado puntual. Las muestras negativas no se incluyen en el clculo de las medias Alimento NoV GI NoV GII HAV Meretrix lyrata 2,6 x 1074,4 x 107


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Por todo ello y para hacer compatibles la seguridad vrica de los alimentos y la economa del sectorproductivo, de aquellos alimentos contaminados en origen, no es suciente con detectar virus sinoque es recomendable cuanticar los ttulos de copias genmicas de forma estandarizada y establecerniveles de permisibilidad por encima de los cules el alimento testado sea considerado no apto para

el consumo, al menos mientras no existan sistemas de inactivacin vrica efectivos que no afecten laspropiedades organolpticas de los alimentos en cuestin.

La gran incgnita, sin embargo, sigue siendo la determinacin del potencial replicativo de las copiasgenmicas. Reformulando la pregunta: cuntas copias genmicas han de ingerirse para originaruna infeccin en un individuo susceptible? Esta es la pregunta clave para la cul todava no existeuna repuesta exacta. Para el caso del HAV se ha descrito que la relacin nativa, es decir sin quemedie ningn tipo de mecanismo de inactivacin, entre partculas fsicas o copias genmicas y virusinfecciosos, es de aproximadamente 60:1 (Jansen et al., 1988) (Deng et al., 1994). Por otro lado, unestudio llevado a cabo durante la investigacin de un brote de hepatitis A causado por el consumo detellinas contaminadas (Costafreda et al., 2006) (Pinto et al., 2009) describe la existencia de linealidadentre la dosis infecciosa, calculada en base a la relacin anteriormente citada de copias genmicas:virus infecciosos de 60:1 y determinando el ttulo de copias genmicas mediante una metodologaestandarizada que incluye factores correctivos para la eciencia de extraccin y amplicacin, y el nivelde infeccin en la poblacin consumidora. As se estima que 4,3 x 103 copias genmicas (72 partculasinfecciosas) produciran infeccin en un 11% de los consumidores, 2,5 x 104 copias genmicas (420partculas infecciosas) produciran infeccin en un 36% de los consumidores y 3,5 x 104 copias genmicas(582 partculas infecciosas) produciran infeccin en un 41% de los consumidores. En el caso de NoVhumanos la relacin de copias genmicas: virus infecciosos no se ha podido determinar debido a lafalta de cepas que se multipliquen en cultivo celular. No obstante, s existen estudios que demuestrancorrelacin positiva entre la carga vrica en alimentos y su capacidad para producir infeccin (Lowther etal., 2010), aunque por falta de aplicacin de factores correctivos y la utilizacin de unidades de PCR enlugar de copias genmicas es difcil comparar los resultados publicados con otros que se puedan generar.

En cualquier caso la implementacin de metodologas estandarizadas para la determinacin delas copias genmicas de NoV humanos y HAV en alimentos potencialmente contaminados en origen,aunque no dena de forma exacta el potencial de riesgo asociado, s constituye una aproximacin y

por ende representa un paso adelante en el control de la seguridad vrica de los alimentos y un valoraadido para aquellos alimentos que se consideren aptos para el consumo.

Sin embargo, es importante enfatizar que slo un porcentaje pequeo de las gastroenteritis por NoVy hepatitis A estn directamente asociadas al consumo de alimentos. La gran mayora de casos son porcontacto persona-persona o por contacto con fomites contaminados y estos casos podran prevenirse conmedidas higinicas correctas como el lavado de manos frecuente y sobretodo despus de usar el bao.

Conclusiones del Comit Cientco1. La presencia de virus entricos, particularmente Norovirus humanos y el virus de la hepatitis A,

en alimentos contaminados con materia fecal es causa de gastroenteritis y hepatitis entricas deorigen alimentario. As pues se hace necesario controlar su presencia con mtodos sucientemente


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sensibles para detectar los bajos niveles de virus presentes en dichos alimentos que sin embargorepresentan un riesgo sanitario por la baja dosis infecciosa de los virus entricos. Con todo esnecesario destacar que la mayora de infecciones por Norovirus humanos y el virus de la hepatitisA se originan por contacto persona-persona y por contacto con fomites contaminados y que el

porcentaje de casos asociados a consumo de alimentos contaminados es bajo.2. Los alimentos ms frecuentemente asociados a gastroenteritis y hepatitis son los contaminados en

origen como moluscos bivalvos, verduras de ensalada y frutos tipo baya que se consumen crudos opoco cocinados y en menor medida alimentos contaminados por manipulacin incorrecta despusde su cocinado.

3. Los Norovirus humanos y las cepas silvestres del virus de la hepatitis A no multiplicanin vitro encultivos celulares. Por ello, los mtodos ms adecuados para su deteccin gracias a su sensibilidadson los basados en la amplicacin por PCR y concretamente en la tcnica de RT-PCR, ya que setrata de virus RNA.

4. Las tcnicas actuales de RT-PCR a tiempo real permiten detectar y cuanticar la carga viral de unamuestra. Sin embargo, requieren de una exhaustiva estandarizacin y de la inclusin de controlesde los pasos crticos de la tcnica que son la extraccin de virus y cidos nucleicos y las reaccionesmoleculares de RT-PCR. La metodologa desarrollada por el Comit Europeo de Normalizacin CENTC 275/WG6/TAG4-viruses in foods, cumple con estos requisitos y va ser prximamente publicada.

5. Aunque las tcnicas moleculares de cuanticacin (copias de genomas vricos) adolecen defalta de informacin sobre el potencial infeccioso de las muestras analizadas, existen datos queconrman la correlacin entre ttulo de copias genmicas y potencial infeccioso de la muestra. Apartir de aqu es necesario denir los lmites mximos de copias genmicas permisibles presentesen muestras alimentarias a n de disminuir al mximo el riesgo para la salud teniendo en cuentaque el riesgo cero no existe.

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