pembuatan preparat mikroskopis dan awetan
DESCRIPTION
preparat mikroskopiTRANSCRIPT
PEMBUATAN PREPARAT MIKROSKOPIS DAN AWETAN
Mikroteknikn Tujuan: membuat sediaan yang dapat mendukung
berbagai disiplin ilmu (histologi, fisiologi, embriologi,dsb).
n Bahan kimia à padat, cair, gas dengan sifat yang berbeda-beda (sangat toksik, toksik, tidak toksik)
n Alat-alat:- alat gelas (staining jar, beker glass, gelas ukur, dll)- Alat bukan gelas (hot plate, oven, mikrotom, pinset,
dll)
Istilah-istilah dalam pembutan preparatn Fiksasi n Dehidrasi n Clearing
Fiksasiadalah usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk atau jaringan.
Tujuan: diperleh gambaran struktur sel/jaringan seperti pada aslinya
Macam fiksatif :- Sederhana (tunggal): alkohol,formalin
- Majemuk (campuran): larutan Bouin (asam pikrat, formalin, acidium aceticum glaciale/AAG)
DehidrasiAdalah penarikan molekul air dari jaringan
Tujuan : agar jaringan bebas air, sehingga jaringan lebih terawetkan
Dehidrasi dilakukan secara bertahap Macam dehidrant : ethyl alkohol, aseton
ClearingAdalah proses penarikan molekul dehidrasi dari jaringan.
Clearing agent : xylol, toluol, minyak cengkeh, dll
Macam-macam sediaann Sediaan sementara : supravital stainingn Sediaan permanen - Sediaan utuh ( whole mount)- Sediaan irisan (beku, seloidin, parafin)- Sediaan untuk jaringan tipis (rentang)- Sediaan jaringan cair (apus untuk darah, limfe)- Sediaan untuk jaringan keras
Sediaan Utuh (wholemount)n Tujuan: melihat struktur internal suatu organisme.
n Cara : Fiksasi à dehidrasi à staining à clearing à mounting à labelling
n Contoh: pembuatan preparat wholemount embrio ayam
n Bahan: telur dengan umur tertentu, garam fisiologis, pewarna: hematoxylin&eosin, alkohol, formalin
n Alat: gunting, pinset, gelas timbang (Ex: Whole mount embrio ayam)
SEDIAAN BEKUMetode Parafin Tujuan : melihat struktur sel Cara : narkose à pengambilan bahan à fiksasi à washing à dehidrasi à toluol à infiltrasi parafin à penanaman (embedding)à pengirisan à affiksing à deparafinasi à staining àmounting à labelling Pewarnaan (staining):
- Zat warna asam : acid fuchsin, eosin- Zat warna basa : hematoxylin
Sediaan Apusn Alat : object glassn Bahan : cairan jaringan (darah, limfe)n Cara kerja:
- teteskan darah/limfe di atas object glass- letakkan object glass lain dengan posisi sudut 450
- Tarik dengan arah yang berlawanan
Herbariumn Tujuan?n Materi herbariumn Informasi : etiket tempel dan etiket gantung
à kolektor, nomor koleksi, nama lokal spesimen, lokasi pengambilan dan tanggal.
Insektariumn Tahapan :1. Koleksi serangga 2. Mematikan serangga 3. Memasang pada papan kayu 4. Labelling
TEKNIS ASEPTIS Tujuan à steril dan mencegah kontaminasi Kontaminasi? Kontaminan ? Kultur murni?
Sterilisasi suatu usaha untuk membebaskan bahan-bahan dan
alat-alat dari semua bentuk kehidupan mikrobia Cara sterilisasi: mekanik, fisik, kimia,
Sterilisasi secara mekanik Dengan filtrasi Digunakan untuk bahan-bahan yang tidak tahan
panas Misalnya : serum darah, antibiotika, gula sederhana Berkefeld filter Seitz filter
Sterilisasi Fisik Alat dan bahan tahan panas Insenerasi : > 5000C Perebusan : 1000C Autoclave : 1210C, tekanan 1 atm, 15 menit Pemanasan kering Pasteurisasi (batch method & flash method)
Prinsip Kerja Autoclave
Sterilisasi secara kimia Bahan kimia yang à berupa gas: etilen oksida dan
formaldehid, senyawa kimia yang bersifat cair: glutaraldehid
Teknik sterilisasi secara kimia dapat dilakuakan dengan bahan yang mempunyai daya oksidasi seperti ozon dan hidrogen peroksida.
Media Pertumbuhan Nutrisi isolasi, pengujian sifat-sifat fisiologi dan
perhitungan jumlah mikrobia dalam suatu bahan Media untuk bakteri ≠ media untuk jamur
Syarat Media mengandung zat makanan yang mudah digunakan
oleh mikrobia tidak mengandung zat penghambat pertumbuhan mempunyai tekanan osmose dan tegangan
permukaan pH sesuai dengan kondisi mikrobia dalam keadaan steril.
Macam MediaBerdasarkan kandungan kimianya:
Anorganik medium organik medium sintetik medium non sintetik
Berdasarkan konsistensinya: Padat Semi padat Cair
Media Pertumbuhan
Teknik Isolasi Isolasi ? memindahkan mikrobia tersebut dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkan sebagai biakan murni dalam medium buatan.
Bagaimana caranya?
Cara-cara Isolasi Teknik Goresan (streak plate method) Teknik taburan (pour plate method) Teknik Sebaran ( spread method)
Teknik Goresan (streak plate method) Menghasilkan koloni terpisah Media agarà digores dg ose yg berisi koloni
bakteri/ jamur
Teknik taburan (pour plate method) Pengenceran bertingkat Inokulum diteteskan di petridis à dituang media Koloni terpisah
Pengenceran Bertingkat
Teknik Sebaran ( spread method) Pengenceran Kultur disebarkan pada media agar plate sterilà
penyebaran dengan alat penyebar yang telah disterilkan dengan alkohol dan dibakar
KAMIS, 30 DESEMBER 2010
Prinsip Kerja Pembuatan Preparat Histologi
Fiksasi
Fiksasi adalah suatu usaha manusia untuk
mempertahankan elemen -elemen sel atau jaringan
agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami
perubahan bentuk maupun ukuran. Dinamakan larutan
fiksatif karena kemampuan membuat jaringan mudah
menyerap warna. Mulanya dengan menyiapkan ikan,
lalu mengambil potongan kecil sebanyak dua potong
pada masing-masing organ insang, dan ginjal dan hati.
Organ tersebut dimasukkan ke dalam botol yang berisi
larutan Bouins dan diamkan selama ± 24
jam.
- Washing
Washing adalah proses pencucian untuk
menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Dalam
proses washing diusahakan tidak terdapat molekul-
molekul fiksatif yang tertinggal di dalam jaringan.
Molekul ini akan menjadi penghalang untuk proses
selanjutnya. Fiksatif menggunakan BOINS, maka
setelah kurang lebih 24 jam difiksasi kemudian
dilakukan pencucian menggunakan alkohol 70% yang
diganti berkali-kali hingga warna kuning hilang.
- Dehidrasi
Dehidrasi adalah proses penarikan molekul air dari
dalam jaringan. Tujuan dari dehidrasi adalah agar
seluruh ruang-ruang antar sel dalam jaringan dapat diisi
dengan molekul parafin. Dehidrasi menggunakan
alkohol bertingkat dari persentase rendah ke persentasi
tinggi (70%, 80%, 96%) masing-masing 2 x 15 menit.
Hal ini dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi
perubahan tiba-tiba pada terhadap sel dan jaringan.
- Clearing
Clearing adalah proses penjernihan atau
mentransparankan jaringan. Clearing berfungsi untuk
menarik alkohol atau dehidran yang lain dari dalam
jaringan agar dapat digantikan oleh molekul parafin.
Clearing menggunakan xylene dengan membenamkan
jaringan pada larutan tersebut selama 2 x 15 menit.
- Impregnasi
Impregnasi bisa juga disebut infiltrasi parafin yaitu
proses pengeluaran xilen dari dalam jaringan yang
akan digantikan oleh parafin cair. Setelah jaringan di
Clearing maka sampel dimasukkan kedalam cessed
and deckel kemudian di masukkan kadalam moldtray
yang berfungsi sebagai tempat infiltrasi parafin, yang
terdiri dari tiga wadah yaitu: pertama berisi parafin cair
dan xylene, wadah ke dua berisi parafin cair tanpa
xilene, dan wadah ke tiga berisi parafin cair murni.
Masing-masing 1 x 15 menit.
- Embeding
Proses penanaman jaringan ke dalam media parafin.
Tujuannya adalah untuk mempermudah dalam
melakukan proses pemotongan atau pengirisan
sampel. Dilakukan dengan mengeluarkan jaringan yang
sudah di Impregnasi dari moldtray, kemudian
menanamnya ke dalam lempengan blok yang berisi
parafin cair. Setelah itu tutup dengan menggunakan
casette and deckel lalu didinginkan pada cold plate.
- Cutting
Proses pemotongan atau pengirisan jaringan dengan
menggunakan mikrotom. Sampel yang dipotong
tebalnya sekitar 5 – 7 mikron. Pemotongan akan
berhasil jika pisau tidak tumpul, tidak berkarat, dan
tidak terdapat sisa-sisa parafin dari hasil pemotongan
sebelumnya dan posisi sampel lurus dan baik. Suhu
pisau dan suhu sampel serta ruangan harus sama agar
sampel tidak patah atau terpotong-potong saat
pengirisan.
- Staining
Staining adalah proses pewarnaan, dimana sampel
diwarnai dengan menggunakan zat warna. Tujuannya
yaitu untuk mewarnai jaringan sehingga mudah diamati
di mikroskop. Tahapan staining terdiri dari proses
deparafinasi atau penarikan parafin dari dalam jaringan.
Proses rehidrasi atau pemasukan molekul air ke dalam
jaringan yang dilakukan secara bertahap dengan
menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi tinggi
ke konsentrasi rendah. Proses ini sebagai media
penghantar zat warna ke jaringan. Selanjutnya proses
infiltrasi zat warna. Menggunakan haematoxilin untuk
mewarnai sitoplasma dan eosin untuk mewrnai inti sel.
Lalu dehidrasi kembali yang bertujuan untuk mencegah
kerusakan pada jaringan karena mengakibatkan
terjadinya pembusukan. Setelah parafin dikeluarkan
dengan menggunakan xilen selama 20 menit preparat
dikeringkan dan ditetesi dengan entelan dan ditutup
dengan deg glass. Kemudian diamati di bawah
mikroskop.