PEWARNAAN NEGATIF

LAPORAN UTAMA

Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat kelulusanPraktikum Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Pangan

Oleh :

Nama : Nur Rahayu SetiawatiNRP : 113020117Kelompok : EMeja : 4 (Empat)Asisten : Firmansyah

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PANGANJURUSAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNIKUNIVERSITAS PASUNDAN

BANDUNG2012

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb

Alhamdulillah penulis haturkan atas segala rahmat dan

karunia yang telah dilimpahkan Allah SWT sehingga penulis

dapat menyelesaikan Laporan Utama Praktikum Mikrobiologi

Pangan ini walaupun dengan melewati berbagai rintangan

yang tidak mudah.

Penulis menyadari, terselesaikannya penyusunan laporan

ini tidak terlepas berkat bantuan dan bimbingan daro berbagai

pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan

ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Allah SWT yang memberikan penulis kesehatan dan

usia sampai saat ini, sehinnga penulis mampu

melewati praktikum Mikrobiologi Pangan ini dengan

lancar.

2. Kedua orang tua penulis yang selalu memberikan doa,

dukungan, dan motivasi, serta selalu memberikan

uang saku untuk penulis.

3. Ibu Ir. Neneng Suliasih, MP. selaku koordinator

Laboratorium Mikrobiologi Pangan.

4. Teh Astrie Wijayanthie, selaku koordinator asisten

Praktikum Mikrobiologi Pangan yang menjadi asisten

yang paling memacu semangat penulis pada saat di

laboratorium

i

5. Kang Firmansyah, selaku asisten pembimbing yang

paling baik tiada tandingannya, selalu sabar, selalu

tersenyum, walau penulis selalu telat mengumpulkan

laporan. Hehe.. Tetapi nilai yang akang berikan tetap

sama dan terhitung besar. Terimakasih kaang..

6. Teh Selly, selaku asisten laporan yang membantu

penulis menyelesaikan laporan utama dari asisten

pembimbing ke teh Selly.

7. Teh Farah yang merupakan asisten favorit penulis,

Teh Vega yang paling cantik dengan behelnya, Teh

Natasa yang cantik dan juga sebagai penguji pada

saat penulis ujian praktikum, Teh Rianti yang selalu

tetap lincah di dalam laboratorium, dan Teh Rossi

yang kalem.

8. Mamih Tanty sebagai teman satu meja di Meja 4,

Yopan dan Vivi sebagai teman sekelompok, berkat

kerjasama dan kekompakan mereka, praktikum ini

dapat selesai.

9. Kepada Kelompok E yang tiada hentinya

menggetarkan, mengguncangkan Laboratorium

Mikrobiologi Pangan hingga cetar menggelegar dan

tetap menghadapi praktikum ini selalu ”Hadapi dengan

Senyumaann”

10. Kepada Laboratorium Mikrobiologi Pangan yang

bersedia menampung praktikan.

ii

11. Kepada meja 4 yang telah bersedia memberikan

tempat untuk penulis pada saat praktikum.

12. Bude Tami, Kino, Kacang, Aci, Widya, dll yang udah

mau saling membantu

13. Seluruh angkatan 2011 yang selalu kompak.

14. Kepada lift gedung C yang mau menampung

membawa praktikan naik ke lantai 4 dan turun lagi ke

lantai 1.

15. Motor penulis yang selalu mengantarkan penulis pagi

hari untuk praktikum dengan melewati panas, hujan,

angin, maupun badai

16. Kepada semuanya yang telah membantu penulis

Penulis doakan, semoga Allah SWT membalas semua

kebaikan orang-orang yang berada di balik layar tersebut

sehingga penulis mampu maju dengan semangat yang luaarrr

biasa.

Akhir kata penulis meminta maaf atas segala kekurangan

dalam penulisan Laporan Utama ini. Semoga Laporan Utama

ini dapat bermanfaat untuk semua kalangan. Amin.

Terimakasih.

Wassalamualaikum Wr.Wb

Bandung, Desember 2012

Penulis

v

INTISARI

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Sel bakteri tidak berwarna, sehingga sukar untuk diamati secara langsung. Pewarnaan sel bakteri dilakukan untuk mempermudah pengamatan morfologi bakteri tersebut. Proses pewarnaan bakteri lazim disebut pengecatan

Bacillus subtilis telah lama dikenal sebagai bakteri penghasil enzim . Berdasarkan pengaruh suhu habitatnya, bakteri ini bersifat fakultatif termofilik. Sifat ini mempengaruhi juga terhadap enzim yang dihasilkan dimana salah satunya adalah enzim lipase. Penelitian ini memfokuskan pada pengaruh suhu terhadap lipase yang dihasilkan Bacillus subtilis dengan menggunakan substrat minyak zaitun

Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari dan mengetahui sel-sel bakteri sehingga sel bakteri dapat dilihat secara jelas. Pronsip percobaan pewarnaan negatif yaitu berdasarkan pewarnaan tidak langsung dengan hanya mewarnai latar belakangnya (kaca objek.

Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada pewarnaan negatif dapat diketahui bentuk luar dan karakteristik dari bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga hanya mewarnai latar belakangnya saja dan bentuk dari bakteri tersebut adalah batang. Bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis yang merupakan bakteri

vi

basil dengan ukuran 0,5 µm x 1 µm. Biasanya bakteri tersebut ditemukan berkoloni atau membentuk endospora oval atau bersilinder

ABSTRACT

Negative staining, this method is not bacteria but coloring to dye a dark black background. In this staining microorganisms appear transparent (see-through). This technique is useful to determine the morphology and size of the cell. In this staining did not spread to warm or harsh treatment with chemicals, then the depreciation and one form that is less so the cells can be obtained by determining more precisely. This method uses china paints or inks nigrosin. Bacterial cells are colorless, so it is difficult to observe directly. Staining bacterial cells to facilitate observation of the morphology of the bacteria. The process of staining bacteria commonly called painting

Bacillus subtilis has long been known as an enzyme-producing bacteria. Under the influence of habitat temperature, thermophilic bacteria voluntary. These properties also affect the enzyme produced in which one of them is lipase. This study focuses on the effect of temperature on lipase produced by Bacillus subtilis using olive oil substrate

Negative staining objective is to study and know the bacterial cells so that bacterial cells can be seen clearly. Pronsip negative staining experiments are based on indirect staining with only the background color (glass objects

Based on the observations we can conclude that the negative staining can be seen outside the shape and characteristics of the bacteria that are difficult to color, so that only the background color only and shape of bacteria is rod. The bacteria used were Bacillus subtilis bacterium bacillus which is the size of 0.5 μm x 1 μm. Usually the

vii

bacteria are found in colonies or oval or cylinder form endospores

viii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR...............................................................i

INTISARI.................................................................................iv

ABSTRACT............................................................................v

DAFTAR ISI............................................................................vi

DAFTAR TABEL....................................................................vii

DAFTAR GAMBAR...............................................................viii

DAFTAR LAMPIRAN.............................................................x

1 BAB I PENDAHULUAN..................................................1

1.1 Latar Belakang Percobaan.......................................1

1.2 Tujuan Percobaan....................................................3

1.3 Prinsip Percobaan....................................................3

2 BAB II ALAT, BAHAN, DAN METODE PERCOBAAN...4

2.1 Alat yang digunakan.................................................4

2.2 Bahan yang digunakan............................................4

2.3 Metode percobaan...................................................5

3 BAB III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN. . .6

3.1 Hasil Pengamatan....................................................6

3.2 Pembahasan............................................................7

4 BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN............................21

4.1 Kesimpulan............................................................21

4.2 Saran.....................................................................21

5 DAFTAR PUSTAKA......................................................22

6 LAMPIRAN..........................Error! Bookmark not defined.

vi

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Negatif..................6

Tabel 2. Perbedaan Sifat bakteri Gram Positif dan Gram

Negatif…………………………………………………..16

Tabel 3. Penggolongan Bakteri berdasarkan Suhu…...........19

vii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Metode Percobaan Pewarnaan Negatif.................5

Gambar 2. Gambar Hasil Pengamatan Pewarnaan Negatif....6

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Mikroskop ........................................................23

Lampiran 2. Pemakaian Mikroskop......................................24

Lampiran 3. Pewarnaan Gram.............................................26

Lampiran 4. Pewarnaan Negatif...........................................27

Lampiran 5. Biakan Lapuk....................................................28

Lampiran 6. Pembentukan Gas............................................30

Lampiran 7. Pembiakan Sarcina lutea dan Serratia

marcescens………………………………………..31

Lampiran 8. Pemeriksaan Air...............................................32

Lampiran 9. Tetesan Bergantung.........................................36

Lampiran 10. Cawan Gores dan Tuang................................37

Lampiran 11. Pewarnaaan Spora ........................................39

Lampiran 12. Pengamatan Sel Hidup & Sel Mati..................40

Lampiran 13. Penetapan Jumlah Sel Total...........................41

Lampiran 14. Zat Anti Mikroba..............................................42

Lampiran 15. Uji Mutu Makanan...........................................43

Lampiran 16. Pembentukan AMK.........................................47

Lampiran 17. Pembentukan Indol.........................................48

Lampiran 18. Pembentukan H2S..........................................49

Lampiran 19. Penguraian Enzim..........................................50

Lampiran 20. Perubahan Air Susu.......................................52

Lampiran 21. Sterilisasi Alat dan Bahan..............................54

Lampiran 22. Peragian Gula................................................56

x

I PENDAHULUAN

Bab ini menguraikan mengenai : (1) (1) Latar Belakang

Percobaan, (2) Tujuan Percobaan, dan (3) Prinsip Percobaan

1.1 Latar Belakang Percobaan

Selain pewarnaan gram, untuk melihat sel-sel bakteri

dapat juga dilakukan pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif

atau pewarnaan asam merupakan salah satu teknik

pewarnaan bakteri. Akan tetapi teknik ini  bukan untuk

mewarnai sel bakteri, hanya mewarnai latar belakangnya

menjadi hitam gelap. Zat warna yang digunakan tidak akan

mewarnai sel, tetapi mewarnai lingkungan sekitar sehingga sel

bakteri tampak transparan. Dalam kondisi pH mendekati

netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif

dan senyawa pewarna juga bermuatan yang sama sehingga

akan ditolak oleh dinding sel. Pewarna yang biasa  digunakan

antara lain nigrosin, eosin, dan asam pikrat. Tetapi kini

nigrosin sudah tidak digunakan dalam  pewarnaan, dan diganti

dengan tinta cina. 

Pewarnaan negatif tidak hanya secara khusus

menvisualisasikan protein saja, tetapi dapat digunakan untuk

lipoprotein, isolasi organela, kompleks nukleoprotein. Pada

teknik ini apusan bakteri mengalami fiksasi dengan cepat

(beberapa detik sampai menit). Pewarnaan negatif adalah

cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk

1

membedakan specimen kecil dengan cairan optiknya. Untuk

mikroskop medan terang, pewarnaan negative biasanya

menggunakan cairan hitam, misalnya nigrosin. Spesimen

seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang

dicampur dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika

diamati dengan mikroskop, bakteri atau sporanya terlihat

bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan

negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa

pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati

netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif

sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak

oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.

Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan

nigrosin, asam pikrat, dan eosin.

Prosedur pewarnaan negatif sangat sederhana. Pertama,

apusan bakteri difiksasi dan dibiarkan hingga mengering pada

kaca objek. Kemudian ditetesi dengan zat pewarna. Ambil

kaca objek yang lain dan dorong apusan sejajar dengan kaca

hingga menghasilkan olesan yang tipis. Biarkan hingga kering

kemudian lihat sel bakteri pada mikroskop. Bakteri yang dapat

digunakan dalam pewarnaan ini seperti Pseudomonas

aeruginosa dan Lineola longa.

2

1.2 Tujuan Percobaan

Tujuan Percobaan adalah untuk mempelajari dan

mengetahui sel-sel bakteri sehingga sel bakteri dapat dilihat

secara jelas.

1.3 Prinsip Percobaan

Prinsip Percobaan pewarnaan negatif yaitu berdasarkan

pewarnaan tidak langsung dengan hanya mewarnai latar

belakangnya (kaca objek).

3

2 ALAT, BAHAN, DAN METODE PERCOBAAN

Bab ini menguraikan mengenai : (1) Alat yang digunakan,

(2) Bahan yang digunakan, dan (3) Metode Percobaan

2.1 Alat yang digunakan

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah

Mikroskop, lampu, kaca objek, jarum oase, pinset, pipet tetes ,

dan korek api.

2.2 Bahan yang digunakan

Bahan yang digunakan adalah biakan Bacillus subtilis,

pewarna nigrosin, alkohol 70%.

4

2.3 Metode percobaan

- Bersihkan kaca objek dengan

menggunakan alkohol 70 %

- Fiksasi diatas api untuk

menghilangkan lemak

-Pijarkan jarum oase

- Ambil biakan Bacillus subtilis

-Beri 1 tetes Nigrosin

-Ratakan dengan kaca objek

lainnya

- Diamkan hingga kering

- Amati dengan perbesaran 400 x

5

3 HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Bab ini membahas mengenai : (1) Hasil Pengamatan, dan

(2) Pembahasan

3.1 Hasil Pengamatan

Gambar Keterangan

100 X

Nama Bakteri : Bacillus subtilis

Bentuk : Batang

Susunan : Monobacillus

Warna : Transparan

Zat Warna : Nigrosin

400 X

(Sumber : Nur Rahayu.S, Kelompok E, Meja 4, 2012

6

3.2 Pembahasan

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya

ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat

dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran

1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang

beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih

panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan

makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm.

Bentuk bakteri bermacam-macam yaitu elips, bulat, batang

dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai

dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau

dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan

keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri

dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau

spiral (heliks).

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat

bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk

bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri

seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik

dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta

meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan

menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan

diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada

bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan

7

larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,

yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.

Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara

sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik

pewarnaan diferensial

Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa

pada pewarnaan negatif dapat diketahui bentuk luar dan

karakteristik dari bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga

hanya mewarnai latar belakangnya saja dan bentuk dari

bakteri tersebut adalah batang. Bakteri yang digunakan

adalah Bacillus subtilis yang merupakan bakteri basil dengan

ukuran 0,5 µm x 1 µm. Biasanya bakteri tersebut ditemukan

berkoloni atau membentuk endospora oval atau bersilinder.

Bakteri tersebut berumur 24 jam, karena pada usia tersebut

morfologi bakteri sudah terlihat jelas. Awalnya kaca objek

dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dan di fiksasi

untuk menghilangkan lemak pada kaca objek tersebut. Lalu

pijarkan jarum oase dan ambil biakan Bacillus subtilis. Pada

kaca objek yang telah di fiksasi tadi, beri 1 tetes nigrosin dan

biakan Bacillus subtilis. Ratakan dengan menggunakan kaca

objek yang lainnya, lalu di keringkan. Pewarna yang

digunakan dalam pewarnaan negatif yaitu nigrosin. Pewarna

nigrosin tidak mewarnai bakteri, tapi mewarnai preparat

sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna bening. Hal ini

disebabkan karena nigrosin dan bakteri sama-sama

8

bermuatan negatif. Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai

preparat, tidak mewarnai bakteri.

Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan

pada beberapa jenis bakteri. Struktur endospora sangat

bervariasi pada setiap spesies. Endospora merupakan struktur

yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim

misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam. Karena

kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan

dengan sel vegetatifnya, maka endospra berbentuk sangat

padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.

Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa,

sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. Bakteri

yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap

pewarnaan, sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan

hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan.

Pewarna yang digunakan dalam pengecatan negatif

adalah nigrosin. Pewarna tersebut tidak mewarnai bakteri, tapi

mewarnai preparat sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna

bening dengan preparat yang kontras. Hal ini disebabkan

karena tinta cina dan bakteri sama-sama bermuatan negatif.

Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai preparat, tidak

mewarnai bakteri. (Johnson & Case, 2007).

Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan

mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk membedakan

specimen kecil dengan cairan optiknya. Untuk mikroskop

medan terang, pewarnaan negative biasanya menggunakan

9

cairan hitam, misalnya nigrosin. Spesimen seperti bakteri

dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur

dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati

dengan mikroskop, bakteri atau sporanya terlihat bersinar

dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau

pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna

bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral,

dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga

pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh

dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.

Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan

nigrosin, asam pikrat, dan eosin.

Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk

batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan

vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu

berkisar 25-35 ºC. Bacillus subtilis juga telah berevolusi

sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan

lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi

seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau

oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya

memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set

kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR

CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari

bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam

jumlah besar ke luar dari sel (Schlegal, 1994).

10

Bacillus subtilis juga telah lama dikenal sebagai bakteri

penghasil enzim . Berdasarkan pengaruh suhu habitatnya,

bakteri ini bersifat fakultatif termofilik. Sifat ini mempengaruhi

juga terhadap enzim yang dihasilkan dimana salah satunya

adalah enzim lipase. Penelitian ini memfokuskan pada

pengaruh suhu terhadap lipase yang dihasilkan Bacillus

subtilis dengan menggunakan substrat minyak zaitun

(Johnson & Case, 2007)

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak

mempertahankan zat warna nigrosin/tinta Cina sewaktu

proses pewarnaan. Bakteri gram negatif memiliki system

membran ganda dimana membrane plasmanya diselimuti

membrane lapisan luar permeable. Bakteri gram negatif

memiliki dinding sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak

diantara membran dalam dan membrane luarnya. Banyak

spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen yang

berarti mereka berbahaya bagi organism inang. Sifat patogen

ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada

dinding sel gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida

(dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Anonim², 2011).

Proses pengecatan dilakukan dengan mengoleskan

pewarna dengan bakteri dari gelas objek ke gelas objek

lainnya. Preparat yang sudah diberi warna kemudian

dikeringkan tanpa fiksasi dengan panas. Hal ini disebabkan

karena proses fiksasi akan membuat sel bakteri tidak terlihat

11

jelas karen panas akan membuat pengecatan menjadi hitam

(Irianto, 2006).

Hasil pengecatan tersebut memperlihatkan sel bakteri

yang jelas baik dalam struktur dan ukurannya. Bacillus terlihat

transparan dengan bentuk batang. Latar belakang terlihat

gelap akibat pewarnaan negatif tetapi terlihat warna putih

transparan di sekeliling bakteri yang terlihat. Sehingga

pengecatan negatif dapat menggambarkan dengan jelas

struktur morfologi bakteri.

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif

dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat

warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat

pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat

pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri

dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan

terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar

dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan

negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion

positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin

blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa

digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan

negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat

pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada

daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di

atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).

12

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai

bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam

gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan

transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk

menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini

olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang

keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya

penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga

penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini

menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Sel bakteri tidak

berwarna, sehingga sukar untuk diamati secara langsung.

Pewarnaan sel bakteri dilakukan untuk mempermudah

pengamatan morfologi bakteri tersebut. Proses pewarnaan

bakteri lazim disebut pengecatan.

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah

Enterobactericeae, Salmonella sp, Shigella sp, Escherichia

coli, dan Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif

adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium,

Bacillus. Bakteri gram negatif yang paling terkenal adalah

Veilonella alcalescens (dahulu Micrococcus lactilyticus) dan

Megasphaera (dahulu Pepto streptococcus). Keduanya tidak

mampu untuk meragikan karbohidrat. Veillonella alcalescens

ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, juga perut

hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam

organik menjadi propionat, asetat, CO2, H2 (Schlegal, 1994).

13

Cat atau zat warna secara kimiawi dapat dibagi menjadi

dua macam, yaitu:

1. Cat basa yaitu cat (senyawa garam) yang gugus

kromofornya adalah kation (bermuatan positif (+)). Cat

tersebut akan mewarnai sel yang bersifat asam. Cat

basa mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat

dengan bagian-bagian sitoplasma sel. Contoh:

methylene blue, kristal violet, dan lain-lain.

2. Cat asam yaitu cat yang gugus kromofornya adalah

anion (bermuatan negatif (-)). Cat tersebut akan

mewarnai sel yang bersifat basa. Cat basa mudah

bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Contoh: congo

red, eosin, nigrosin dan lain-lain (Johnson & Case,

1980).

Teknik pengecatan bakteri terdiri dari 3 macam yaitu:

1. Pengecatan negatif.

Pengecatan ini dilakukan dengan mewarnai latar

belakang preparat, tapi tidak mewaranai bakteri

sehingga bakteri terlihat jelas dan kontras dengan

latar. Pengecatan menggunakan tinta cina. Bakteri

tidak terwarnai karena bakteri dan zat pewarna sama-

sama bermuatan negatif. Pengecatan negatif biasa

digunakan untuk menentukan morfologi bakteri tanpa

penggunaan pengecatan kasar atau teknik fiksasi.

Pengecatan negatif dapat digunakan untuk

14

mengkonfirmasi bentuk dan ukuran bakteri dan untuk

melihat kapsul (Johnson & Case, 2007).

2. Pengecatan sederhana.

Pengecatan dilakukan dengan memakai satu macam

cat. Sel bakteri akan terwarnai sesuai cat yang

dipakai. Cat yang biasa dipakai adalah safranin,

methylene blue, atau kristal violet. Pengecatan

sederhana biasa digunakan untuk mengetahui

morfologi, ukuran dan susunan bakteri

(Johnson & Case, 2007).

3. Pengecatan diferensial.

Pengecatan dilakukan dengan memakai beberapa

macam larutan cat. Teknik ini biasa digunakan untuk

mengelompokkan beberapa jenis bakteri.

(Johnson & Case, 2007).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat

penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa

perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri gram

positif dan bakteri ram negatif (Filzahazny, 2008) :

15

Tabel 2. Perbedaan Sifat bakteri Gram Positif dan Gram

Negatif

Bakteri Gram

Positif

Bakteri Gram

Negatif

Dinding SelLapisan petidoglikan

lebih tebal

Lapisan petidoglikan

Lebih tipis

Kadar Lipid 1-4 % 11-22%

Kebutuhan Nutrien KompleksRelatif lebih

sederhana

Resistensi terhadap

alkali (1% KOH)Lebih Pekat Larut

Kepekaan terhadap

YodiumLebih Peka Kurang Peka

Toksin yang

dibentukEksotoksin Endotoksin

Sifat Tahan AsamAda yang tahan

asam

Tidak ada yang

tahan asam

Kepekaan terhadap

PenisilinLebih peka Kurang peka

Kepekaan terhadap

StreptomisinTidak peka Peka

Resistensi terhadap

telluritLebih tahan Lebih peka

16

Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap

hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui.

Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi

pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan

mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang mempengaruhi

pertumbuhan mikroba :

1. Suplai Nutrisi

Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya,

memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan

pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut

adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur,

fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya.

Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini

dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga

pada akhirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi

tidak bersih dan higienis pada lingkungan adalah

kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi

pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat

tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh

karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan

bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan

meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar

pertumbuhannya terkendali.

2. Suhu / Temperatur

Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam

mempengaruhi dan pertumbuhan mikroorganisme.

17

Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara

yang berlawanan:

a)    Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme

naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila

suhu turun, maka kecepatan metabolisme akan

menurun dan pertumbuhan diperlambat.

b)    Apabila suhu naik atau turun secara drastis,

tingkat pertumbuhan akan terhenti, kompenen sel

menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel

menjadi mati. Berdasarkan hal di atas, maka suhu

yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme

digolongkan menjadi tiga, yaitu :

1)    Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di

bawahnya maka pertumbuhan terhenti.

2)    Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan

berlangsung paling cepat dan optimum (disebut juga

suhu inkubasi)

3)    Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada

di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi.

Sehubungan dengan penggolongan suhu di atas,

maka mikroba digolongkan menjadi

18

:

Tabel 2. Penggolongan Bakteri menurut Suhu

Kelompok Suhu

Minimum

Suhu

Optimum

Suhu

Maksimum

Psikrofil - 15o C. 10o C. 20o C.

Psikrotrof - 1o C. 25o C. 35o C.

Mesofil 5 – 10o C. 30 – 37o C. 40o C.

Thermofil 40o C. 45 – 55o C. 60 – 80o C.

Thermotrof 15o C. 42 – 46o C. 50o C.

Berdasarkan ketahanan panas, mikroba

dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu :

1)    Peka terhadap panas, apabila semua sel

rusak apabila dipanaskan pada suhu 60oC

selama 10-20 menit.

2)    Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan

suhu 100oC selama 10 menit untuk mematikan

sel.

3)    Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih

dari 60oC selama 10-20 menit tapi kurang dari

100 oC selama 10 menit untuk mematikan sel.

3. Keasaman atau Kebasaan (pH)

Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-

masing dan memiliki pH optimum yang berbeda-

beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh

19

pada kisaran ph 8,0 – 8,0 dan nilai pH di luar kisaran

2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.

4. Ketersediaan Oksigen

Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-

sendiri di dalam kebutuhannya akan oksigen.

Mikroorganisme dalam hal ini digolongkan menjadi :

1)    Aerobik : hanya dapat tumbuh apabila ada

oksigen bebas.

2)    Anaerob : hanya dapat tumbuh apabila tidak

ada oksigen bebas.

3)    Anaerob fakultatif : dapat tumbuh baik

dengan atau tanpa oksigen bebas.

4)    Mikroaerofilik : dapat tumbuh apabila ada

oksigen dalam jumlah kecil (Lestari, 2012).

20

4 KESIMPULAN DAN SARAN

Bab ini menguraikan mengenai : (1) Kesimpulan,

dan (2) Saran.

4.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan

bahwa pada pewarnaan negatif dapat diketahui

bentuk luar dan karakteristikdari bakteri yang sulit

diwarnai

4.2 Saran

Bakteri yang diuji, menggunakan berbagai

macam bakteri negative lainnya agar praktikan bias

lebih mengetahui bakteri-bakteri yang masuk ke

dalam pewarnaan negative

21

22

23

24