PEWARNAAN KUMANIke Irmawati P.A, MSi Med Bagian Mikrobiologi FK YARSI

Identifikasi kuman tahap I pemeriksaan mikroskopis pewarnaan kuman Untuk mempelajari : morfologi, struktur dan sifat-sifat kuman terhadap zat warna

Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pewarnaan yang baik :1. Preparat kuman yang baik * gelas obyek bersih & bebas lemak * umur biakan : 18-24 jam, kecuali M. tuberculosis ( 2-3 minggu) * tebal tipis sediaan tdk terlalu tebal & hrs rata 2. Kualitas zat warna selalu baru 3. Waktunya harus tepat

Cara membuat sediaan :

Tujuan dari fiksasi kuman :1. Merekatkan kuman 2. Memudahkan zat warna meresap 3. Sediaan kuman dapat disimpan

Jenis-jenis perwarnaan kuman:1. Pewarnaan negatif (back ground staining) 2. Pewarnaan sederhana 3. Pewarnaan diferensial 4. Pewarnaan khusus

1. Pewarnaan negatif Kuman tidak terwarnai tampak terang dg latar belakang gelap Misal dg zat warna negrosin/ tinta bak, congo red Untuk kuman yang sukar diwarnai : Spirochaeta ( Treponema, Leptospira & Borrelia) & kuman berkapsul (simpai)

2. PEWARNAAN SEDERHANA Penggunaan satu macam zat warna saja warna kuman sesuai zat warna yg dipakai Biru metilen, air fukhsin, ungu kristal (1-2 menit)

3. PEWARNAAN DIFERENSIAL Menggunakan lebih dari satu macam zat warna diferensiasi kuman terhadap zat warna Dibagi menjadi : a. Pewarnaan Gram b. Pewarnaan tahan asam

a. Pewarnaan gram Diferensiasi 2 macam kuman yaitu Positif Gram (ungu) dan Negatif Gram (merah) Sifat penting untuk membantu determinasi kuman identifikasi kuman tahap I

Teori yang mendasari perbedaan sifat tersebut: 1. Teori Salton : berdasar lipid yang larut pada kuman negatif gram dan denaturasi protein ddg sel pd kuman positif Gram setelah pencucian dg alkohol 2. Teori permeabilitas dinding sel : berdasarkan tebal tipisnya lap. peptidoglikan ddg sel

Perbedaan sifat Gram karena perbedaan komposisi dinding sel kuman

Skema dinding sel bakteri negatif & positif Gram

Langkah-langkah Pewarnaan Gram

5 menit, cuci 45-60 detik, cuci komplek UK-Jodium Dg alkohol 96%, 30 detik, cuci Air fukhsin, 1-2 menit, cuci, keringkan, dilihat dg mikroskop diberi emersi oil, perbesaran 1000 x

fuksin

Kuman kokus yang patogen terhadap manusia bersifat positif Gram, kecuali kokus dari familia Neisseriaceae

Kuman batang & spiral umumnya bersifat negatif Gram, kecuali batang dari genus : Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria dan Mycobacterium

Kokus positif Gram

Kokus negatif Gram (Neisseriaceae)

Batang Negatif Gram

Batang Positif Gram

b. Pewarnaan Tahan Asam Membedakan kuman tahan asam dengan yang tidak tahan asam Ada 3 jenis pewarnaan tahan asam : 1. Ziehl-Neelsen 2. Kinyoun-Gabbett 3. Tan Thiam Hok Sifat tahan asam 50% lipid ddg sel kuman tahan asam adl asam mikolat

Hasil pewarnaan : - kuman tahan asam berwarna merah - bukan tahan asam berwarna biru

Hasil pewarnaan tahan asam

4. PEWARNAAN KHUSUS Pewarnaan bagian tertentu sel kuman atau kuman yang tidak dapat diwarnai dgn pewarnaan biasa Jenis pewarnaan khusus, antara lain : Pewarnaan flagel ( Gray, Novel, Zettnow dan Fontana-Tribondeau) Pewarnaan simpai/kapsul (Muir, Hiss,GinsBurri) Pewarnaan spora (Klein) Pewarnaan nucleus/inti (Feulgen) Pewarnaan Neisser untuk kuman C. diphtheriae Pewarnaan kuman Spirochaeta (BeckerKrantz dan Fontana-Tribondeau)

Pewarnaan Flagel

Pewarnaan spora

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan Neisser

ISOLASI & KOLONI KUMAN

CARA MELAKUKAN ISOLASI (MEMBIAK/MENANAM) KUMANTujuan melihat/identifikasi koloni kuman untuk identifikasi spesies kuman, memperbanyak jumlah kuman serta mendapatkan biakan murni (pure culture) Pada media cair : mencelupkan 1 se/sengkelit (inoculating loop) berisi kuman dalam spesimen/suspensi dengan pipet tetes, diteteskan beberapa tetes (2-5 tetes) spesimen/suspensi kuman

Pada media padat :1. Streak culture (metode goresan) Goresan-goresan dibuat sejajar tdk bersentuhan supaya terjadi penipisan jumlah kuman, sehingga diperoleh koloni-koloni terpisah (tdk berhimpitan) untuk memudahkan identifikasi koloni kuman

2. Slant culture dengan membuat goresan-goresan pada permukaan media padat di tabung (permukaannya dibuat miring) biakan miring 3. Stab culture (biakan tusuk) dengan cara menusukkan se berisi kuman secara tegak lurus pada media padat dalam tabung (misalnya media agar tegak)

4. Pour culture (biakan tuang) biakan kuman mencampurkan kuman yang akan dibiak ke dalam media agar yang belum membeku (suhunya tidak terlalu panas sehingga kuman tidak mati), kemudian campuran tersebut dituang ke dalam plat dan dibiarkan membeku (dingin)

Setelah melakukan inokulasi (penanaman) dilanjutkan dgn inkubasi (pengeraman) dalam alat inkubator pada suhu yg sesuai (biasanya 37C) selama 18-24 jam (kuman aerob) Untuk kuman anaerob sebelum dimasukkan ke dalam inkubator, dimasukkan dahulu ke dalam anaerob jar (sungkup anaerob) untuk menciptakan suasana anaerob, karena kuman anaerob tdk dpt hidup pada suasana aerob (suasana yg terdpt oksigen)

KOLONI KUMAN

Kuman pada media padat membentuk koloni Koloni kuman sekelompok/kumpulan kuman sebagai hasil pertumbuhan dan perkembangbiakan suatu kuman Koloni kuman dapat dilihat dan diamati berbeda bentuk dan sifatnya, tergantung jenis kumannya maka koloni kuman dapat digunakan untuk membantu identifikasi spesies kuman (langkah kedua)

Hal-hal yang diperhatikan dalam identifikasi koloni kuman : 1. 2. 3. 4. ukuran/diameter koloni kuman dlm. mm bentuk koloni (bulat/menjalar/bersulam /tidak teratur) penampang permukaan koloni (cekung/cembung/datar) permukaan & tepi halus (Smooth = S) atau kasar (Rough = R) 5. mengkilap/buram (glossy/opaque) 6. warna koloni (pigmen : putih/kekuningan /kuning emas/ kehijauan/ ungu/merah) 7. jernih atau keruh 8. viskositas koloni : lunak seperti mentega, kering, keras, berlendir/mukoid = M (koloni kuman yg punya kapsul)

9. bila kuman tumbuh pd media agar darah zona hemolisis. Jenis zona hemolisis : > hemolisis (ada zona kehijauan di sekitar koloni) > hemolisis (ada zona hemolisis jernih transparan di sekitar koloni) > hemolisis gamma (tidak ada zona hemolisis di sekitar koloni)

Beberapa contoh koloni berpigmen : > koloni pigmen merah mis. Serratia marcesens > koloni pigmen ungu mis. Chromobacterium violaceum > koloni hijau mis. Pseudomonas aeruginosa > koloni kuning emas mis. Staphylococcus aureus > koloni putih mis. Staphylococcus epidermidis > koloni kuning kering mis. M. tuberculosis

S. marcesens

C. violaceum

P. aeruginosa

S. aureus

Beberapa contoh bentuk koloni kuman : > koloni menjalar mis. kuman Proteus vulgaris > koloni bersulam mis. kuman Bacillus mycoides > koloni mukoid mis. kuman Klebsiella pneumoniae > koloni jernih seperti titik-titik air, dgn zona hemolisis beta mis. Streptococcus pyogenes > koloni jernih dengan zona hemolisis alpha, mis. Streptococcus viridans

Koloni Bersulaman

Koloni mukoid

Koloni menjalar

Koloni rough

Koloni S. aureus di MSA

Koloni smooth (Staphylococcus)

Koloni smooth (Streptococcus)

PERBENIHAN (MEDIA) KUMAN

Manfaat membiak/ isolasi kuman Tujuan mempelajari koloni kuman guna mengidentifikasi spesies kuman Syarat perbenihan/media kuman : mengandung bahan nutrisi, garam, air yang diperlukan kuman (dalam jumlah cukup) bebas bahan kimia,dll. yang menghambat pertumbuhan kuman pH sesuai dengan sifat kuman steril

JENIS-JENIS PERBENIHAN

KONSISTENSI

NUTRISI

MANFAAT

1. Cair 2. Semisolid 3. Padat

1. Sederhana 2. Diperkaya

1. Transport 1. Persemaian 2. Diferensial 3. Selektif 4. Eksklusif 5. Khusus

Jenis Media Berdasar Konsistensi:1. Media cair Tempat : botol/tabung Contoh : air pepton, kaldu nutrient, kaldu darah, kaldu BHI (brain heart infusion) dsb. Kuman tumbuh media keruh (tdk terbtk koloni)

2. Perbenihan semisolid (1/2 padat) Tempat : tabung Mengandung 0.5% agar-agar Contoh : Media untuk melihat gerak kuman & media transport

Gerak kuman

3. Perbenihan padat/solid Tempat : tabung / cawan Petri (plat) Bahan pemadat menggunakan a. agar-agar 1.5-2.0% (agar-agar murni) b. serum sapi, kelinci, kuda (mis. Perbenihan Loeffler untuk kuman C. diphtheriae) c. telur, mis. Perbenihan Loewenstein Jensen (mengandung telur bebek) utk kuman M. tuberculosis

Kuman tumbuh koloni Koloni berbeda bentuk dan macamnya membantu identifikasi (langkah ke-dua) Jenis Media Berdasarkan Nutrisi 1. Perbenihan/media sederhana Mengandung bahan nutrisi pokok saja Contoh : media agar nutrient ( isi : agar-agar + pepton)

2. Perbenihan/media diperkaya (enriched) Penambahan bahan tertentu Contoh : Darah (agar darah), Serum (Loeffler) Telur, cairan ascites, as.Amino esensial, vitamin, yeast dsb.

Jenis media berdasarkan guna/manfaat 1. Media transport

Fungsi transport spesimen ke lab. Bentuk semisolid dalam tabung tertutup (prop plastik) Mengandung cukup nutrisi utk kuman kuman tdk matiContoh media Charcoal, Carry-Blair, Stuart, Amies.

Media Stuart

2. Media persemaian Bentuk cair, dalam tabung/botol Fungsi memperbanyak jumlah kuman ttt dlm spesimen dgn menyingkirkan faktor-faktor penghambat pertumbuhan kuman tsb. Contoh : media empedu (Gal/bile) S. typhosa media air pepton alkalik Vibrio (pH 8.0) media selenit dan Kauffman kuman enteric

Selenit

3. Media diferensial Fungsi untuk membedakan sifat pertumbuhan kuman, karena mengandung bahan tertentu Contoh : media Agar Darah diferensiasi kuman berdasarkan sifat hemolisanya thdp eritrosit media agar Endo, Mac Conkey diferensiasi kuman peragi laktosa dgn non peragi laktosa

Mac Conkey

Agar darah

Agar Endo

4. Media selektif Fungsi membiak kuman yang diinginkan Mengandung bahan yg menghambat pertumbuhan kuman yg tdk diinginkan Contoh media untuk kuman enteric, mis. Media SS (Salmonella-Shigella); media WB (Wilson-Blair)

SS Agar

5. Media eksklusif

Media yang daya seleksinya lebih baikContoh :

- media TCBS (thiosulphate citrate bile sucrose) utk Vibrio

6. Media khusus Mis. untuk kuman anaerob, kuman Gonococcus, Leptospira dsb. Media utk kuman anaerob, a.l. : a. media thioglikolat mengandung Na- thioglikolat (reduktor O2) dan rezasurin (indikator O2) b. media Tarozzi mengandung potongan jaringan segar, mis. hati (sumber enzim katalase, peroksidase & superoksid-dismutase) Kuman anaerob tdk memiliki enzim yg mengubah H2O2 (bersifat toksis) sehingga akan mati, karena itu perlu media khusus dan suasana khusus (anaerob)

SELAMAT BELAJAR