isolasi dan pewarnaan bakteri
TRANSCRIPT
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
1/36
PEMERIKSAAN BAKTERI
DENGAN PEWARNAAN
9/9/2015 1
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
2/36
ISOLASI BAKTERI
PEMBIAKAN (KULTUR) BAKTERI
Tujuan : Untuk memudahkan pemeriksaan,
Kultur dapat disimpan dalam lemari es untuk waktu
yang lama.1. Kultur CAMPURAN, Kultur MURNI
untuk mendapatkan satu spesies dalam satu
kultur, maka perlu dibuat kultur murni (pureculture). Kultur murni dapat diperoleh dari kultur
campuran (mixed culture) dengan cara sebagai
berikut.
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
3/36
Kultur yang pertama diperoleh adalah kultur campuran.
Contoh : sampel dari udara, tanah, kotoran; sampel
disebarkan pada medium steril, akan tumbuh beraneka koloni
yang masing-masing punya sifat yang khas. Jika salah satukoloni tersebut, ditanam pada medium baru yang steril,
maka bahan itu akan tumbuh menjadi koloni yang murni,
asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat
menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yangsteril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Kultur yang
diperoleh disebut piaraan pertama (primary culture), dan
sifatnya murni. Kultur ini dapat disimpan, tetapi tiap waktu
tertentu harus diadakan peremajaan dengan
memindahkannya ke medium baru. Piaraan-piaraan yang
diperoleh dari piaraan pertama disebutpiaraan turunan (sub-
culture).
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
4/36
Ada kultur species bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu
tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun
piaraan itu selalu disimpan di dalam lemari es. Untukmeremajakan kultur caranya sama dengan yang di atas
yaitu dengan memindahkan koloni dari stok yang lama
kepada medium yang baru.
Cara lain untuk menyimpan kultur murni dengan
liofilisasi. Dalam bentuk ini bakteri dapat disimpan
sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 4o
C.
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
5/36
MEDIUM ATAU SUBSTRAT
Medium yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah
medium yang mengandung zat-zat organik.
. MEDIUM CAIRMedium cair yang dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1
liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton. Peptonialah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, danpada putih telur. Pepton mengandung banyak N2, sedang kaldu berisigaram-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukanpHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikianini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut di atas masih
perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksiatau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelahtabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas,
dapatlah mereka dimasukkan ke dalam alat pensteril (autoklaf).
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
6/36
MEDIUM PADAT
Susunannya hampir sama dengan medium cair, tetapi ini
ditambah agar atau gelatin (protein dari kolagen) sehinggamenjadi padat.
MEDIUM YANG DIPERKAYAKebanyakan bakteri dapat tumbuh pada dasar makanan seperti
disebut di atas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus,Mycobacterium tuberculosis, Diplococus pneumoniae, danNeisseria gonnorhoeaememerlukan zat makanan tambahanberupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen.Serum atau darah itu dicampurkan ke dalam medium yangsudah disterilkan.Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serumatau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan.Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuatdengan cara ini. Untuk menumbuhkan Lactobacillusdanbeberapa spesies lainnya pada medium ditambahkan susu atau air
tomat
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
7/36
CARA MEMBUAT KULTUR MURNI
Di alam bebas tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas darispesies lainnya.
Untuk memurnikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu:DENGAN PENGENCERANCara ini pertama kali dilakukan oleh Lister tahun 1865. Membuat biakanmurni Streptococcus lactisyang diisolasik dari susu yang sudah asam.Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-
macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceranini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, darienceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jikadari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan padasuatu medium padat, kemungkinan besar k akan didapatkan beberapa
koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga diperolehsatu koloni. Selanjutnya spesies ini dapat dijadikan biakan murni. Kalaubelum yakin koloni tunggal yang diperoleh itu murni, kita dapatmengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagaisampel.
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
8/36
B. DENGAN PENUANGAN
Robert Koch (1843 1905) yaitu dengan mengambil sedikit
sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, kemudiandisebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatinencer. Sehingga diperoleh biakan adukan. Setelah mediummengental, beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni
yang masing-masing dapat dianggap murni. Denganmengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, makaakhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Kochyang sangat berjasa, yaitu Petriyang menciptakan cawandengan tutup yang sekarang terkenal sebagai cawan Petri(Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Heseyangmenemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Agarternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental
suatu medium. Agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95o C.
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
9/36
C. DENGAN PENGGESEKANMetode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitumemakan waktu, dengan cara ini bakteri anaerob tidak
dapat tumbuh.Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itusetelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan padapermukaan medium padat, maka beberapa waktu (kurang
lebih setelah 12 jam) akan tampak koloni yang letaknyatersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahansampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akandiperoleh suatu kultur murni.
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
10/36
IDENTIFIKASI BAKTERI
1.Pemeriksaan Mikroskopik,Bentuk bakteri, gram
2. PergerakanBergerak E. coli,
Tetesan bergantung
3. Uji biokimia
4. PCR (Polymerase Chain
Reaction)
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
11/36
Pewarnaan
Suatu teknik untuk mempelajari morfologi
bakteri dengan cara pemberian zat warna
kepada sel bakteri.
Bagian-bagian sel dapat diamati, karena
dapat menyerap zat warna yang berbeda
oleh masing-masing bagian sel.
9/9/2015 11
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
12/36
Kenapa perlu diwarna ?
Bakteri ukurannya sangat kecil 05-1 u x 10 u
Dibawah mikroskop tidak jelass bagian-
bagian nya.
Untuk melihat dengan jelas perlu diberi zat
warna.
9/9/2015 12
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
13/36
PEWARNAAN BAKTERI
- Dikembangkan oleh Erlich dan Robert Koch
- Yang berperan pada pewarnaan dinding sel dan
membran sitoplasma (Protein yang mengandung
gugus amino dan karboksil)
PEWARNAAN BAKTERI HIDUP (LIVING STATE)
- Menggunakan zat warna yang tidak toksis- Jarang dilakukan karena bakteri hidup sukar
menyerap warna
- Untuk melihat pergerakan bakteri
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
14/36
PEWARNAAN BAKTERI MATI (FIXED STATE)
- Intensifier (agar pewarnaan berjalan cepat),bahan kimia (fenol, deterjen), fisis (panas)
- Mordant, suatu bahan yang dapat memperkuat
ikatan zat warna dengan bakteri
Teori pewarnaan bakteri :
1. Teori fisis (Fisher), pewarnaan suatu proses
absorbsi zat warna oleh bakteri, tergantung pada
kekuatan absorbsi dari permukaan bakteri
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
15/36
2. Teori Kimiawi (Paul Ehrlich)
Pewarnaan merupakan reaksi kimiawi antara zat
warna dengan bakteri yang akan menghasilkan
komponen baru yang berbeda dengankomponen pembentuknya.
Penyiapan sampel- Dibuat sediaan berupa apusan pada gelas
objek (slide)
- Fiksasi, tujuannya :- melekatkan spesimen pada gelas objek
- membunuh bakteri tanpa merusak morfologinya
- memudahkan bakteri diwarnai
- men im an slide an belum sem at diwarnai
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
16/36
Umumnya ada 2 macam zat warna
Zat warna bersifat asam
Komponen warnanya adalah anion
Dalam bentuk garam natrium
Zat warna bersifat basa
Komponen warna kation.
Dalam bentuk klorida
9/9/2015 16
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
17/36
Macam-Macam Zat Warna Bakteri
No Nama Zat Pewarnaan Warna Bakteri
1 Sapranin Merah
2 Gentian violet Ungu
3 Methylen blue Biru
4 Malachit green Hijau
5 Karbol fuchsin Merah
9/9/2015 17
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
18/36
Struktur Sel
Sel terdiri dari :
Dinding sel , terdiri dari :
- lapisan peptidoglikan- asam teikoat
Membran plasma, terdiri dari :
- membran protein- lapisan fosfolipid
9/9/2015 18
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
19/36
Macam-Macam Pewarnaan
1. Pewarnaan Sederhana
- Menggunakan 1 macam zat warna.
- Warna bakteri hanya 1- Tidak dapat membedakan sifatnya.
- Untuk melihat ukuran dan bentuknya.
9/9/2015 19
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
20/36
2. Pewarnaan Differensial
- Menggunakan lebih dari 1 zat warna- Membedakan sifat bakteri.
- Melihat bagian-bagian bakteri.
- Dapat digunakan untuk identifikasi
bakteri tahap awal.
9/9/2015 20
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
21/36
Macam-Macam Pewarnaan Differensial
1. Pewarnaan Gram
2. Pewarnaan BTA
3. Pewarnaan Spora
4. Pewarnaan Granul
9/9/2015 21
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
22/36
Fiksasi
Proses melengketkan sediaan pada kaca
obyek.
Bakteri mati, tetpai tidak lisis.
Secara Kimia : metanol
Secara Fisika : pemanasan diatas nyala api.
9/9/2015 22
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
23/36
Pewarnaan Gram
Ditemukan Christian Gram (1884).
Pewarnaan dasar dan rutin dalam
identifikasi bakteri lebih lanjut.
Kuman dibagi dua :
- Gram positif berwarna ungu
- Gram negatif berwarna merah.
9/9/2015 23
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
24/36
Tahap pewarnaan Gram
Perlakuan Waktu
Warna Bakteri
Gram + Gram -
Pembuatan preparat
Fiksasi
Gentian violet 30 detik ungu unguCuci dengan air
Larutan
iodium
30 detik - -
Cuci dengan air dan keringkanDekolorisasi dengan alkohol 20 detik
Cuci dengan air dan keringkan
Sapranin 30 detik ungu merah9/9/2015 24
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
25/36
PEWARNAAN GRAM
- Hans Christian Gram (1884)
- Gram positif (ungu), negatif (merah)
- Gram positif, peptidoglikan dinding selnya tebal
sehingga dapat mempertahankan warna kristal
violet walaupun sudah dilunturkan
- Gram negatif, peptidoglikannya tipis, sehingga
warna kristal violet akan luntur waktu diberialkohol dan menjadi merah setelah diberi
safranin
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
26/36
Pewarnaan BTA
Untuk mengidentifikasi kuman M. tbc dan M.
leprae
Kuman M.tbc dan M. leprae mempunyai
dinding sel yang banyak mengandung lipid.
Sukar ditembusi zat warna biasa.
Perlu pemanasan.
Bakteri M tbc dan M leprae berwarna merah.
9/9/2015 26
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
27/36
Tahap Pewarnaan BTA
Buat preparat.
Fiksasi
Zat Warna Karbol Fuchsin sambil dipanaskan (tidak
mendidih) 3 menit.
Cuci dengan air
Pelunturan dengan asam alkohol hingga bersih.
Methylen blue 1 menit.
9/9/2015 27
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
28/36
Zat Warna Pewarnaan BTA
Karbol fuchsin = merah.
Methylen blue = biru.
Asam alkohol sebagai peluntur. Kuman BTA positif : batang berwarna merah.
Kuman BTA negatif : batang berwarna biru.
Sensitifitas : 5000 BTA / ml sputum.
9/9/2015 28
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
29/36
Metoda Pewarnaan BTA
1. Ziehl Nellson
2. Kinyoun Gabbet
3. Tan Tiam Hook.
9/9/2015 29
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
30/36
PROSEDUR ZIEHL NEELSEN
- Sediaan dikeringkan, lalu difiksasi
- Di (+) karbol fukhsin, dipanaskan 5 menit
- Sisa zat warna dibuang, bilas dengan air
- Di (+) alkohol asam selama 5
10 detik
- Sisa zat peluntur dibuang dan dibilas dengan air
- Di (+) metilen blue selama 30 menit
- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air- Dikeringkan dengan kertas penghisap, dan
dilihat dibawah mikroskop
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
31/36
PEWARNAAN KHUSUS
- Untuk melihat struktur tertentu bakteri misalnya
kapsul, flagel, spora.
Pewarnaan spora
- Spora alat untuk mempertahankan diri bagi
bakteri
- Spora sulit diwarnai, jika telah berikatan denganzat warna sulit dilepaskan.
- Pewarnaan Schaeffer Fulton
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
32/36
Prosedur :
- Dibuat sediaan, dikeringkan dan difiksasi- Di (+) zat warna hijau malakhit dan dipanaskan 5
menit
- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air
- Di (+) safranin 30 detik
- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air
- Dikeringkan dan dilihat dibawah mikroskop
- Spora berwarna hijau dan bentuk vegetatifberwarna merah, latar belakang berwarna merah
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
33/36
PEWARNAAN KAPSUL
- Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan
negatif menggunakan tinta cina
Prosedur Hiss :
- Dibuat sediaan dan difiksasi
- Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit
- Dicuci dengan larutan CuSO4 20%- Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
34/36
Prosedur :
- Dibuat sediaan, dikeringkan dan difiksasi- Di (+) zat warna hijau malakhit dan dipanaskan 5
menit
- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air
- Di (+) safranin 30 detik
- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air
- Dikeringkan dan dilihat dibawah mikroskop
- Spora berwarna hijau dan bentuk vegetatifberwarna merah, latar belakang berwarna merah
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
35/36
PEWARNAAN KAPSUL
- Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan
negatif menggunakan tinta cina
Prosedur Hiss :
- Dibuat sediaan dan difiksasi
- Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit
- Dicuci dengan larutan CuSO4 20%- Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop
-
7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri
36/36
9/9/2015 36