laporan pewarnaan bakteri

LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )

Laporan pewarnaan gram

A. Tujuan

Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B. Dasar Teori

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. pewarnaan asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia

dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat

Bakteri garam (+)

Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel

Kandungan lipid rendah (1-4%)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilin

Lebih sensitif

Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)

Lebih dihambat

Kurang dihambat

Kebutuhan nutrisi

Kebanyakan spesies relatif kompleks

Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap

perlakuan fisik

Lebih tahan

Kurang tahan

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering

selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

A. Alat dan Bahan

NO

Alat

Jumlah

Bahan

1

Jarum ose

1

Biakan murni B. cereus dan E.colipada medium NA yang berumur 24 jam

2

Pembakar spirtus

1

Aquades steril

3

Kaca preparat

1

Larutan hucker’s crystal violet

4

Pipet tetes

1

Larutan mordan lugol iodine

5

Mikroskop

1

Larutan alkohol 96%

6

Gelas kimia

3

Larutan safranin

7

Kaca objek

1

8

Tabung reaksi

1

B.

Kaca Objek

Cara Kerja

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol

Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api

Kaca objek yang telah steril

Ditetesi aquades

Jarum ose

Dibakar sampai merah

Dicelupkan pada alkohol

Jarum ose yang steril

Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus

Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).

Disimpan di atas kaca objek

Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek

Kaca objek yang telah berisi sampel

Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

Dicuci dengan air yang mengalir

Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)


Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)


Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)


Dikeringkan pada udara terbuka

Hasil

Diamati dibawah mikrosko

A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel pengamatan

Gambar 1. Fiksasi

Sumber : dokumentasi Pribadi

Bakteri yang telah di ambil kemudian di simpan pada kaca objek yang dicampur dengan setetes aquades. Setelah itu difiksasi di atas api sampai kering. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa merusak sel bakteri.

Gambar 2. Pada saat ditetesi violet

Sumber : dokumentasi pribadi

Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet. Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Hasilnya terdapat warna ungu pada kaca objek.

Gambar 3. Penambahan lugol


Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca objek tetap berwarna ungu akibat dari tetesan violet.

Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%


Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, warna ungu pada kaca objek menghilang akibat penambahan dari alkohol.

Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin


Setelah warna ungu pada bakteri hilang, kemudian bakteri ditetesi safranin sampai terendam dan biarkan selama 1 menit. Kemudian cuci di air yang mengalir. Hasilnya, bakteri yang dihasilkan berwarna merah muda.

Gambar 6. Hasil pewarnaan


Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)


Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10

Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna

oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

B. Kesimpulan

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar Pustaka

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.

http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November 2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS.

Pewarnaan Gram (Mikrobiologi)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri adalah makhluk hidup yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Ini berarti pula bahwa bakteri cukup tipis sehingga tembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Sehingga untuk mengatasi hal tersebut maka perlu dilakukan pengecatan atau pewarnaan pada tubuh bakteri tersebut.

Pewarnaan gram pertma kali dikemukakan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Pada dasarnya pewanaan gram adalah pewarnaan majemuk, karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna dan pewarnaan diferensial, karena pewarnaan ini mampu mendeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok, yaitu gram negatif dan gram positif.

Penggunaan prinsip pewarnaan gram ini akan membantu dan mempermudah untuk melakukan identifikasi bakteri dan berdasarkan hal itu lah kita melakukan praktikum pewarnaan gram ini agar praktikan dapat mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram serta memahami prosedur pewarnaan warna.

1.2 Rumusan masalah

Bagaimana prosedur pewarnaan gram pada praktikum kali ini?

1.3 Tujuan Praktikum

Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram serta memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaanya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PengertianPewarnaan Gram

Pewarnaan garam adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Iud,2008).

2.2Jenis Pewarnaan Pada Bakteri

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Entjaang,2003).

a. Pewarnaan asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. PewarnaanBasa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Entjang,2003).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Dwidjoseputro, 1987).

2.3 Dasar Pewarnaan

Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran (Schegel, 1994).

Pada umumnya jenis – jenis pengecatan dibagi atas 4 macam yaitu (Awetz, 2008):

a. Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel–sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel–sel dan struktur-struktur yang sukar diwarnai secara langsung.

b. Pengecatan sederhana, yaitu pewarnaan yang hanya satu macam cat saja. Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin barayanglainnya

c. Pengecatan khusus digunakan untuk melihat alat tambahan pada bakteri.

d. Pengecatan diferensial menggunakan lebih dari satu macam zat warna.

BAB III

METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum dasar-dasar pewarnaan gram telah dilaksakan pada hari Kamis pada tanggal 1 April 2014, bertempat di Laboratorium Dasar Universitas Muhammadiyah Pontianak.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Nama alat

Jumlah

Akuades steril

~

Alcohol 70%

~

Bunsen

1

Botol semprot

1

Gelas objek

Secukupnya

Jarum ose

2

Mikroskop

1

Penjepit

1

3.2.2 Bahan

Nama bahan

Jumlah

Biakan bakteri yang berumur 24 jam

Satu set pewarna gram;gram A,gram B,gram C dan gram D

3.3 Cara kerja

Di siapkan preparat olesan bakteri

Larutan gram A

2-3 pada olesan bakteri dan dibiarkan 1 menit

Dikeringkan menggunakan kartas isap

Cuci dan keringkan

Diamati dengan mikroskop

Cuci dengan akuades

Larutan gram B (1 menit)

Gram C (30 detik)

Cuci dan keringkan keringkan

Cuci dan keringkan

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Nama Sampel

Pengenceran

Gambar

Nama Bakteri

Jenis Gram

Kolam

10-4

Diplobasil

Gram Negatif

10-5

Usus

10-4

Monokokus

Gram Positif

10-5

4.2 Pembahasan

4.2.1 Pengertian bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. selain itu bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (yang berukuran mikroscopis) akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat morfologinya maka dari itu dilakukan pewarnaan bakteri yang biasa disebut pengenceran baketri. pada umumnya larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer yang lebih dari satu persen.

4.2.2 Pengertian perwarnaan gram

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar. gram positif dan gram negatif, cat gram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. gram merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violel, etil alkohol, cimemonilium oksalai dan aquadest. bkan merupakan bahan kimia berbahaya dan biasa digunakan pewarnaan mikroskopi, baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama (ungu) pada pewarnaan dengan gram A.

4.2.3 Langkah-langkah pewarnaan

Pengecatan diferensial mengunakan dua warna yang kontras untuk membedakan antara jenis organisme yang berbeda.ada empat bahan yang biasanya di gunakan dalam pewarnaaa gram adalah sebagai berkut:

Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah :

1.Crystal Violet

Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).

2. Yodium

Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.

3. Alkohol

Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :

Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu

Bakteri menjadi tidak berwarna

4. Safranin

Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target.

Cara pengamatan bakteri pada pewarnaan gram ini adalah mengambil bakteri yang didapat dari air usus ikan patin. Pewarnaan ini dilakukan dengan mengambil sedikit larutan sample dengan bantuan jarumose yang sebelumya telah di panaskan dengan api bunnsen dan meletakkannya diatas kaca preparat.Langkah pertamayaitu, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.Setelah itu di keringkan dengan mmenggunakan hair dryer sampai benar-benar kering .

4.2.4 Perlakuan

Perlakuan dengan gram negatif yaitu campuran iodiumm, kalium iodium dan aquades. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk mengangkat aktifitas pengikat zat warna oleh bakteri sehingga pengikt zat warna oleh bakteri lebih kuat. memperjelas warna dari zat tersebut mempersulit pewarnaan zat warna, pada pewarnaan terbentuknya persenyawaan komplekskistal violet yodium. tanpa penambahan larutan . zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemulai gram merupakan cat yang terdiri dari campuran asetan dan etil alkohol. gram c merupakan larutan pemulai. larutan pemulai berfungsi untuk melarutkan lipid pada membran bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet yodium. gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safrafin-

etil alohol dan aquadest. safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet. yodium tetap terikat pada dinding-dinding sel. pada bakteri gram negatif, penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah , karena ungu yang dihasilkan oleh kristal violet yodium telah luntur dengan tipisnya membran sel sehingga safrafin dapat terikat. oleh karena itu gram D atau zat kedua berfungsi sebagai membedakan terhadap zat kedua berfungsi sebagi membeda terhadap zat warna kristal violet.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna.

Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup(kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)

4.2.4 Hasil Pengamatan

Pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop tampak mikoorganisme dari sampel air kolam dengan pengenceran 10-4 berbentuk dipobasil dengan jenis gram negatif. Dimana bakteri gram negatif adalah bakteri, yang kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemdian terwarnai dengan pewara tandingan, yaitu safranin, sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan.

Pengamaan kedua yaitu pada sampel usus ikan patin dengan pengenceran 10-4 didapat bakteri monococcus dengan jenis gram positif. Bakteri gram positif adalah bater yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safraninTeknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.

Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum, yaitu diplobasil dengan jenis gram negatif dan monococcus dengan jenis gram positif.

5.2 Saran

Diharapkan dalam praktikum selanjutnya alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum mikrobiologi, lebih di tingkatkan ketersediaannya.

DAFTAR PUSTAKA

Awetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:Malang

Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti.

Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Pres.

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Cara Pewarnaan Bakteri

MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010)

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

2.1 Macam-macam pewarnaan

2.1.1 Pewarnaan

Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan

1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis

2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.

3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus Mycobacterium.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).

2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1. Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

gambar pewarnaan sederhana

2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam

Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram posittif contoh bakteri gram negatif

Sumber: “http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram

Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).

Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)

Sumber: www.google.com

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.

Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .

Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

Sumber http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpg

Protokol pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:

Sumber:

Prinsip kerja:

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.

Cara Kerja :

• Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.

• Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.

• Dibuat sediaan dan dikeringkan.

• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik

• Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.

• Sediaan dicuci dengan air.

• Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.

• Diperiksa dibawah mikroskop.

Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :

pewarnaan Neisser (granula volutin),

pewarnaan yodium (granula glikogen).

5. Pewarnaan negatif

Tujuan

Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

laporan pewarnaan bakteri

Documents