ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR MANGROVE Sonneratia alba PENGHASIL ENZIM GELATINASE

SKRIPSI

Oleh:

UMAYA RIZKA FITRIYAH NIM. 135080301111063

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2017

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR MANGROVE Sonneratia alba PENGHASIL ENZIM GELATINASE

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan

di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya

Oleh:

UMAYA RIZKA FITRIYAH NIM. 135080301111063

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

DESEMBER 2017

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR MANGROVE Sonneratia alba PENGHASIL ENZIM GELATINASE

SKRIPSI

Oleh:

UMAYA RIZKA FITRIYAH NIM. 135080301111063

Telah dipertahankan didepan penguji

Pada tanggal 22 Desember 2017 dan dinyatakan telah memenuhi syarat

Dosen Pembimbing 1

(Prof. Dr. Ir. Happy Nursyam, MS)

NIP. 19600322 198601 1 001

Tanggal:

Menyetujui,

Dosen Pembimbing 2

(Dr. Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP)

NIP. 19810602 200604 1 001

Tanggal:

Mengetahui,

Ketua Jurusan

Manajemen Sumberdaya Perairan

(Dr. Ir. Arning Wilujeng Ekawati, MS)

NIP. 19620805 198603 2 001

Tanggal:

IDENTITAS TIM PENGUJI

Judul : ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI

ENDOFIT AKAR MANGROVE Sonneratia alba

PENGHASIL ENZIM GELATINASE

Nama Mahasiswa : UMAYA RIZKA FITRIYAH

NIM : 135080301111063

Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan

PENGUJI PEMBIMBING:

Pembimbing 1 : Prof. Dr. Ir. HAPPY NURSYAM, MS

Pembimbing 2 : Dr. Sc. ASEP AWALUDIN PRIHANTO, S.Pi, MP

PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:

Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. HARTATI KARTIKANINGSIH, MSi

Dosen Penguji 2 : RAHMI NURDIANI, S.Pi, MApp.Sc, PhD

Tanggal Ujian : 22 DESEMBER 2017

PERNYATAAN ORISINALITAS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini :

Nama : Umaya Rizka Fitriyah

NIM : 135080301111063

Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi “Isolasi dan Identifikasi

Molekuler Bakteri Endofit Akar Mangrove Sonneratia Alba Penghasil Enzim

Gelatinase” yang saya tulis ini benar merupakan hasil karya saya sendiri, dan

pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang tertulis

dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila terdapat dikemudian hari tebukti atau dapat dibuktikan skripsi ini

hasil plagiasi, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut,

sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.

Malang, 22 Desember 2017

Mahasiswa

Umaya Rizka Fitriyah

RIWAYAT HIDUP

Umaya Rizka Fitriyah adalah penulis dari tugas akhir ini

yang merupakan anak terakhir dari pasangan suami istri H.

Zainuri Noer dan Siti Fatimah. Penulis lahir di Malang

tanggal 4 Maret 1995, saat ini berumur 22 tahun.

Menempuh pendidikan di SDN Tulus Besar 02 pada tahun

2001, dilanjutkan di SMPN 1 Tumpang pada tahun 2007,

kemudian SMAN 1 Tumpang pada tahun 2010 dan terakhir baru menyelesaikan

pendidikan di Universitas Brawijaya Jurusan Manajemen Sumberdaya Perairan

Program Studi Teknologi Hasil Perikanan.

Penulis semasa kuliahnya berusaha aktif dengan mengikuti berbagai

macam organisasi guna mengembangkan diri. Penulis sangat menyadari bahwa

tidak hanya kemampuan akademik saja namun perlu diimbangi dengan

organisasi untuk meningkatkan softskill. Penulis tertarik pada isu-isu lingkungan

dan sosial yang sangat erat kaitannya dengan konsentrasi studi Teknologi Hasil

Perikanan. Sebagai seorang yang menggeluti dibidang pangan maka

pemanfaatan sumberdaya alam menjadi produk yang berguna bagi manusia juga

perlu memikirkan dampak terhadap ekologi. Oleh sebab itu, penulis tetap

berinovasi dibidang pangan namun juga memperhatikan kebaikan alam itu

sendiri. Hingga akhirnya konsep itu tertuang pada tugas akhir yang terselesaikan

dengan baik. Penulis menyusun tugas akhir berupa skripsi yang berjudul “Isolasi

dan Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit Akar Mangrove Sonneratia Alba

Penghasil Enzim Gelatinase”. Penulis berharap tugas akhir tersebut dapat

bermanfaat bagi semua pihak sekaligus turut menyumbang hasil penelitian untuk

bidang keilmuan. Akhir kalimat penulis mengucapkan syukur atas

terselesaikannya tugas akhir ini.

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahirobbil ‘alamin, penyusun ucapkan puji syukur kepada Allah

SWT atas rahmat, taufik dan hidayahNya penyusun dapat menyelesaikan skripsi

ini. Sholawat dan salam senantiasa dihaturkan kepada Nabi Muhammad SAW

yang telah memberikan suri tauladan yang baik bagi umat manusia demi

mencapai kebahagiaan dunia akhirat. Skripsi ini merupakan salah satu syarat

untuk memperoleh gelar sarjana di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,

Universitas Brawijaya, Malang.

Dalam penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan

berbagai pihak. Ucapan terimakasih sebesar-besarnya penyusun sampaikan

kepada:

1) Kedua orang tua, yaitu Almarhum H. Zainuri Noer dan Ibu Siti Fatimah.

Juga kakak-kakak, Ina Fitriyah, Farizal Muhana, Alvin Hana Naziyullah,

dan Naila Azizah yang banyak memberikan motivasi, semangat dan juga

do’a.

2) Dr. Ir. Happy Nursyam, MS selaku Dosen Pembimbing I dan Dr. Sc. Asep

Awaludin Prihanto, S.Pi, MP selaku Dosen Pembimbing II yang telah

banyak memberikan pengarahan dan bimbingan sejak pembuatan usulan

Skripsi sampai terselesaikannya Skripsi ini.

3) Seluruh dosen Program Studi Teknologi Hasil Perikanan yang telah

memberikan ilmunya selama menempuh pendidikan.

4) Sahabat saya, Hervina Benazir Ardiyanti yang telah banyak memberikan

bantuan baik berupa penginapan, tenaga, semangat juga do’a.

5) Teman-teman tim bimbingan skripsi yang telah banyak membantu dari

awal hingga akhir, atas segala bantuan, semangat, dan kerja samanya.

6) Teman-teman Bidadari Syurga, Roosita Raudhatul Hikmah, La’aali’ul

Masruroh, Erlian Miratul Hayati, Fauziah Dwi Sari, Hervina Benazir

Ardiyanti dan Devi Pbiyani yang setia menemani dalam perjalanan suka

duka menempuh pendidikan S1 di Universitas Brawijaya ini.

7) Teman-teman 5 Sekawan, Ana Sichatul Fitria, Kamalia Rizki Rahmawati,

Isna Rosyidah, dan Idkha Trisin Tyandika yang banyak memberikan

motivasi semangat juga do’a.

8) Seluruh pihak yang telah membantu terselesaikannya Skripsi ini yang

tidak dapat disebutkan satu-persatu, Penyusun ucapkan terima kasih

jazakumullah ahsanal jaza’.

ABSTRAK

Enzim gelatinase merupakan enzim yang menghidrolisis gelatin menjadi polipeptida, peptida dan asam amino.Enzim gelatinase merupakan salah satu enzim yang penting karena perannya dalam menghasilkan hidrolisat gelatin.Hidrolisis gelatin secara enzimatis menghasilkan hidrolisat gelatin yang mengandung asam amino glisin, prolin, dan hidroksiprolin yang mempunyai sifat sebagai antioksidan dan antihipertensi.Salah satu sumber enzim gelatinase yaitu bakteri endofit.Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa memberi efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang.Bakteri endofit yang didapatkan diidentifikasi molekuler gen penyandi 16S rRNA. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri endofit akar mangrove Sonneratia albayang mampu menghasilkan enzim gelatinase serta untuk mengetahui homologi atau kemiripan bakteri endofit mangrove Sonneratia alba berdasarkan hasil identifikasi molekuler gen penyandi 16S rRNA. Metode yang digunakan adalah metode deskriptif eksploratifdengan dua tahap penelitian.Tahap pertama dimulai dari pengambilan sampel akar mangrove Sonneratia alba dari Pantai Aeng Sareh, Madura, kemudian isolasi bakteri endofit dari akar mangrove Sonneratia alba, dan skrining gelatinase. Tahap kedua penelitian adalah identifikasi molekuler, dan konfirmasi dengan pewarnaan gram.Berdasarkan isolasi bakteri diperoleh 4 isolat bakteri.Hasil dari skrining aktivitas enzim gelatinase diperoleh 4 isolat bakteri mampu menghasilkan enzim gelatinase.Hasil terbaik terdapat pada isolat bakteri A2, sehingga diidentifikasi untuk mengetahui jenis spesiesnya berdasarkan 16S rRNA.Berdasarkan hasil identifikasi molekuler gen penyandi 16S rRNA isolat bakteri A2 memiliki kemiripan dengan bakteri Lysinibacillus fusiformis dengan nilai similaritas 87% dan diberi nama sebagai Lysinibacillus fusiformis UB-U. Berdasarkan hasil filogenetik, Lysinibacillus fusiformis UB-U memiliki hubungan yang lebih dekat dengan Lysinibacillus boronitolerans strain DNP-20 dengan nilai bootstrap 87%. Lysinibacillus fusiformis UB-U adalah gram negatif dan berbentuk batang (basil).

Kata kunci: Bakteri Endofit, Mangrove Sonneratia alba, Gelatinase, 16S rRNA,

Filogenetik

ABSTRACT

Gelatinase enzyme produced by microorganism hydrolyze gelatin into its

sub-compounds (polypeptides, peptides, and amino acids). Gelatinase enzyme is

an important enzyme because of their potential role in producing gelatin

hydrolysate. Gelatin derived peptides that have repeated unique glycine proline

and hydroxyproline in their structure who have antioxidant and antihypertensive

activity. Endophytic bacteria occupy internal tissues of plants without causing

damage to their hosts. Endophytic bacteria were isolated and identified, through

partial sequencing of the 16S rRNA encoding gene. This research used a

descriptive explorative method with two stages of research. The first stage is

started from a sampling of root mangroves Sonneratia alba from Aeng Sareh

Beach, Madura, then isolation of endophyte bacterial from root mangrove

Sonneratia alba, and screening of gelatinase. The second stage of research is

molecular identification and confirmation by gram staining. The results of the

screening are obtained 4 isolates that produced activity of gelatinase which the

best gelatinase activity is producing by isolate A2, so it is identified to know its

species type based on 16S rRNA. Based on the results of molecular

identification, isolate A2 has similarities with Lysinibacillus fusiformis with a

similar value of 87% and a value of 13% can be used to distinguish strains with

other bacteria so named Lysinibacillus fusiformis UB -U. Based on phylogenetic

results, Lysinibacillus fusiformis UB-U has a close relation with Lysinibacillus

boronitolerans strain DNP-20 with bootstrap value of 87%. Lysinibacillus

fusiformis UB-U is a gram-negative and rod-shaped (bacillus).

Keywords: Bacterial Endophyte, Mangrove Sonneratia alba, Gelatinase, 16S rRNA, Phylogenetic

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, wassholatu wassalamu ‘ala Rosulillah, puji syukur

kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan rahmat, taufik dan

hidayahNya sehingga Skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Molekuler

Bakteri Endofit Akar Mangrove Sonneratia alba Penghasil Enzim Gelatinase”

dapat diselesaikan dengan baik dan lancar.

Penyusunan Skripsi ini ditujukan sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Perikanan (S.Pi) di Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan, Universitas Brawijaya. Selain itu, penulisan Skripsi ini bertujuan untuk

memperoleh mikroorganisme dari endofit mangrove dan dapat diidentifikasi serta

untuk mengetahui bahwa mikroorganisme tersebut dapat menghidrolisis gelatin.

Penyusun berharap Skripsi ini memberi manfaat dan barokah bagi para

pembaca sekalian, khususnya kepada mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan, untuk dijadikan sebagai bahan tambahan wawasan. Akhir kata,

sebagai manusia biasa pastilah Penyusun tidak luput dari kesalahan dalam

pembuatan Skripsi ini, sehingga Penyusun mengharapkan kritik dan saran dari

pembaca sekalian, demi kesempurnaan penulisan berikutnya.

Malang, 20 Oktober 2017

Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman

RINGKASAN .......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ............................................................................................. viii

DAFTAR ISI............................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ..................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xiii

1. PENDAHULUAN ................................................................................................. 1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................... 3

2. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 4

2.1 Enzim ........................................................................................................ 4 2.2 Enzim Gelatinase ..................................................................................... 9 2.3 Pidada Putih (Sonneratia alba) .............................................................. 10 2.4 Bakteri Endofit ........................................................................................ 12 2.5 Isolasi dan Identifikasi Spesies Mikroorganisme ................................... 13

2.5.1 Isolasi Mikroorganisme ................................................................... 13 2.5.2 Identifikasi Mikroorganisme dengan Teknik Molekular 16S rRNA . 16 2.5.3 Analisis Hasil Sequencing dan Analisis Pohon Filogenik. ............. 19 2.5.3 Program BLAST Sebagai Penunjang Pembuatan Pohon

Filogenetik. ...................................................................................... 19 2.5.3 Pewarnaan Gram ............................................................................ 20

3. METODOLOGI .................................................................................................. 21

3.1 Materi Penelitian ..................................................................................... 21 3.1.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................... 21 3.1.2 Alat Penelitian dan Bahan Penelitian ............................................. 21

3.2 Metode Penelitian ................................................................................... 22 3.3 Prosedur Penelitian ................................................................................ 23 3.3.1 Penelitian Pendahuluan (Tahap I) ......................................................... 23

3.3.1.1 Pengambilan Sampel Mangrove..................................................... 23 3.3.1.2 Isolasi Bakteri Endofit Mangrove .................................................... 24

3.3.2 Penelitian Utama (Tahap II) ................................................................... 26 3.3.2.1 Penapisan Bakteri Penghasil Enzim Gelatinase ............................ 26 3.3.2.2 Analisa Spesies Bakteri Menggunakan Sekuensing 16s rRNA ..... 27 3.3.2.3 Analisis Bioinformatika .................................................................... 31 3.3.2.4 Pewarnaan Gram ............................................................................ 33

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 34 4.1 Hasil Isolasi Bakteri dari Bagian Mangrove ........................................... 34 4.2 Hasil Skrining Bakteri Penghasil Enzim Gelatinase .............................. 37 4.3 Hasil Identifikasi Molekuler 16S rRNA ................................................... 38

4.3.1 Isolasi DNA ...................................................................................... 38 4.3.2 Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA .............................. 40 4.3.3 Hasil Amplifikasi Gen ...................................................................... 41 4.3.4 Pengurutan dan Pembacaan Sekuen DNA .................................... 42 4.3.5 Penggabungan Hasil Sequencing Forward dan Reverse .............. 43 4.3.6 BLAST ............................................................................................. 45

4.4 Filogenik Sekuen DNA ........................................................................... 46 4.5 Konfirmasi Pewarnaan Gram dan Morfologi Lysinibacillus fusiformis .. 47

5. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................. 49 5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 49

5.2 Saran ...................................................................................................... 49

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 50

LAMPIRAN ............................................................................................................ 55

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Pewarnaan gram ............................................................................................... 20

2. Komposisi Media Skrining Gelatinase .............................................................. 27

3. Primer Forward dan Reverse ............................................................................ 29

4. Karakteristik Morfologi Koloni Bakteri Endofit Mangrove ................................. 35

5. Hasil Analisis Uji Gelatinase ............................................................................. 37

6. Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA ....................................... 40

7. Pengurutan Sekuen Gen 16S rRNA ................................................................. 43

8. Hasil Reverse Complement dan Format Fasta Assembly ............................... 44

9. Hasil Analisis BLAST Isolat A2 ......................................................................... 46

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Grafik Pengaruh Konsentrasi Enzim Terhadap Laju Reaksi ............................. 6

2. Grafik Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Laju Reaksi .......................... 7

3. Grafik Pengaruh Suhu terhadap Laju Reaksi ..................................................... 8

4. Grafik Pengaruh pH terhadap Laju Reaksi ......................................................... 9

5. Mekanisme Gelatinase Menghidrolisis Gelatin ................................................ 10

6. Mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba) ....................................................... 10

7. Peta Lokasi Pengambilan Sampel .................................................................... 24

8. Hasil Isolat Bakteri Endofit Akar Mangrove Pidada Putih ................................ 35

9. Hasil Pemurnian dengan Metode Streak Plate 3 Kuadran .............................. 36

10. Hasil Isolasi pada Agar Miring ........................................................................ 36

11. Hasil Uji Gelatinase ......................................................................................... 37

12. Hasil Isolasi DNA Isolat Bakteri A2 ................................................................. 39

13. Hasil Elektroforesis Gel Agarosa .................................................................... 41

14. Pohon Filogenik Lysinibacillus fusiformis UB-H ............................................. 46

15. Hasil Pewarnaan Gram Lysinibacillus fusiformis UB-H ................................. 47

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema Pengambilan Mangrove ....................................................................... 56

2. Skema Isolasi Bakteri Endofit ........................................................................... 56

3. Dokumentasi Penelitian Isolasi Bakteri ............................................................ 57

4. Skema Proses Skrining Bakteri Penghasil Gelatinase .................................... 59

5. Skema Identifikasi Molekuler Teknik 16S rRNA ............................................... 60

6. Konfirmasi Pewarnaan Gram dan Morfologi Bakteri ........................................ 65

7. Hasil Elektroferogram Isolat A2 Sekuen Forward ............................................ 66

8. Hasil Elektroferogram Isolat A2 Sekuen Reverse ............................................ 67

9. Hasil BLAST Isolat Bakteri ................................................................................ 69

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim gelatinase adalah enzim yang berperan dalam menghidrolisis

gelatin menjadi polipeptida, peptida dan asam amino. Terdapat bakteri tertentu

yang dapat memproduksi enzim gelatinase, diantaranya yaitu Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens dan Serratia

marcescens. Keberadaan bakteri penghasil enzim gelatinase ini dapat dideteksi

dengan uji gelatinase (Balan et al., 2012).

Enzim gelatinase merupakan salah satu enzim yang penting karena

perannya dalam menghidrolisis gelatin. Hidrolisis gelatin secara enzimatis

menghasilkan hidrolisat gelatin yang mengandung asam amino glisin, prolin, dan

hidroksiprolin yang mempunyai sifat sebagai antioksidan dan antihipertensi.

Permintaan hidrolisat gelatin yang cenderung meningkat, membuat para peneliti

mulai mengembangkan produksi hidrolisat gelatin dari enzim gelatinase (Sai-Ut

et al., 2013).

Penggunaan enzim di Indonesia diperkirakan mencapai 2.500 ton dengan

nilai impor sekitar 200 milyar rupiah pada tahun 2017, dengan laju pertumbuhan

volume rata-rata 5-7% per tahun (Nasir, 2017). Karena tingginya nilai impor

tersebut, maka diperlukan penanggulangan salah satunya dengan memproduksi

enzim sendiri dengan mengoptimalkan pemanfaatan sumberdaya hayati yang

dimiliki Indonesia (Suhartono, 2000).

Beberapa tahun terakhir penggalian sumber daya mikroba yang terdapat

didalam jaringan tanaman mulai banyak mendapat perhatian. Mikroba tersebut

mulai dipelajari untuk berbagai tujuan salah satunya untuk memproduksi enzim

(Clay, 1988). Mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman disebut mikroba

endofitik. Mikroba ini hidup di antara sel tumbuhan dan bersimbiosis mutualisme

2

dengan inangnya (Kumala et al., 2006). Kelebihan enzim yang dihasilkan oleh

mikroba adalah enzim dari mikroba ini bisa diproduksi dalam jumlah yang besar

(Standbury dan Whitaker, 1984), mutunya lebih seragam dan harganya lebih

murah karena mikroba dapat tumbuh pada media yang didapat dari limbah

pertanian (Satiawiharja,1997).

Endofit yang diisolasi dari tumbuhan mangrove sangat berpotensi untuk

pencarian produk alami yang baru. Lingkungan tumbuhan mangrove yang unik

semi salinitas memberikan peluang mikroorganisme sebagai mikroba endofitik

menyebar luas dalam daun, akar maupun organ lainnya dari tumbuhan inang

(Amrani et al., 2012). Akar merupakan organ yang kontak secara langsung

dengan lingkungan salin, oleh karena itu akar merupakan suatu struktur dan

berfungsi mengatur pengambilan dan transpor ion (Shannon et al., 1994). Pada

ekosistem mangrove, endofit dapat terlibat dalam proses dekomposisi bahan-

bahan organik. Keterlibatan endofit akar ini dapat dilihat dari produksi enzim

penting yang digunakan untuk mendegradasi bahan-bahan yang kaya akan lignin

dan protein. Menurut hasil penelitian Maria et al., (2005), endofit yang

berasosiasi dengan tanaman mangrove Acanthus ilcifolius dan Acrostichum

aureum berpotensi untuk memproduksi senyawa anti mikroba dan enzim

ekstraseluler.

Salah satu tumbuhan berkhasiat obat yang memiliki banyak manfaat

adalah mangrove Sonneratia alba. Kelompok Sonneratia merupakan sumber

yang kaya tanin yang dikenal sebagai antimikroba. Daun mangrove Sonneratia

digunakan untuk antimikroba dan anti diabetes (Milon, 2012). Oleh karena itu,

dalam penelitian ini digunakan sampel dari mangrove Pidada Putih (Sonneratia

alba) untuk mendapatkan bakteri penghasil enzim gelatinase.

Seiring perkembangan teknologi, identifikasi spesies bakteri dapat

dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik PCR

3

terhadap bakteri sering menggunakan analisis sekuen 16S rRNA (ribonucleic

acid). Metode ini digunakan karena sangat akurat dalam mengidentifikasi suatu

spesies, baik itu dari organisme eukariotik dan prokariotik. Selain itu kelebihan

utama penggunaan 16S RNA sebagai marker karena bersifat universal,

representatif, dan praktis untuk menentukan spesies dan mengkonstruksi

kekerabatan filogenetik (Aris, 2011).

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri

endofit penghasil enzim gelatinase yang berasal dari Pantai Aeng Sareh Madura.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah terdapat bakteri endofit pada akar mangrove Pidada Putih

(Sonneratia alba) yang mampu menghasilkan enzim gelatinase?

2. Apakah identitas bakteri penghasil enzim gelatinase berdasarkan sekuen

16S rRNA?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan bakteri endofit pada akar mangrove Pidada Putih

(Sonneratia alba) yang mampu menghasilkan enzim gelatinase.

2. Mengetahui identitas bakteri endofit akar mangrove Pidada Putih

(Sonneratia alba) yang mampu menghasilkan enzim gelatinase berdasarkan

identifikasi 16S rRNA.

1.4 Manfaat

Laporan skripsi ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa

informasi tentang cara mendapatkan bakteri endofit penghasil enzim gelatinase

cara identifikasi bakteri dengan berbasis molekuler 16S rRNA, serta cara

mengoperasikan software yang digunakan dalam mendapatkan identitas bakteri

endofit mangrove yang berpotensi menghasilkan enzim gelatinase.

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

Enzim merupakan protein yang memiliki fungsi spesifik sebagai katalis

yang efektif, memiliki spesifisitas terhadap substrat, dan hanya akan mengkatalis

reaksi tertentu (Sumarsih, 2002). Sedangkan menurut Volk dan Wheleer (1988),

enzim adalah molekul protein yang sangat besar dan dianggap sebagai katalis

organik yang dapat mempercepat reaksi biologis berjuta-juta kali. Dalam reaksi

kimia yang dipercepat ini, enzim tidak mengalami kerusakan atau mengalami

perubahan. Perubahan yang terjadi selama reaksi bukanlah perubahan yang

permanen.

Enzim bekerja secara spesifik, yaitu setiap jenis enzim hanya dapat

bekerja pada satu jenis senyawa atau reaksi kimia, hal ini disebabkan karena

struktur kimia tiap enzim berbeda dan bersifat tetap. Sistem kerja enzim dengan

cara menempel pada substrat dan menurunkan energi aktivasi yang dengan

sendirinya mempercepat proses reaksi. Satu molekul enzim dapat mengkatalis

10 sampai 1000 molekul substrat per detik (Pelczar dan Chan, 2005).

Enzim terdapat pada sel-sel tumbuhan, fungi, bakteri, dan hewan

(Herdyastuti dan Nuniek, 2009). Enzim banyak digunakan pada berbagai bidang

industri, produk pertanian, kimia, dan medis. Enzim memiliki sifat-sifat spesifik

yang menguntungkan yaitu efisien, selektif, dapat diprediksi, reaksi tanpa produk

samping, dan ramah lingkungan. Sifat-sifat tersebut menyebabkan penggunaan

enzim semakin meningkat dari tahun ke tahun, peningkatan diperkirakan

mencapai 10-15% per tahun (Rahayu, 2004).

Tidak semua enzim yang dihasilkan hanya berfungsi untuk keperluan

aktivitas di dalam sel, tetapi terdapat beberapa enzim yang diekskresikan

sehingga dapat berfungsi untuk aktivitas di luar sel. Oleh karena itu, dikenal

5

adanya dua enzim, yaitu enzim intraseluler/ endoenzim dan enzim ekstraselular/

eksoenzim (Pelczar and Chan, 2005). Endoenzim umumnya merupakan enzim

yang digunakan untuk proses sintesis di dalam sel dan untuk pembentukan

energi (ATP) yang berguna untuk proses kehidupan sel, energi dalam proses

respirasi. Sedangkan eksoenzim umumnya berfungsi untuk mencernakan

substrat secara hidrolisis, untuk dijadikan molekul yang lebih sederhana dengan

berat molekul (BM) lebih rendah sehingga molekul tersebut dapat masuk

melewati membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat

di luar sel tidak digunakan dalam proses kehidupan sel (Campbell et al., 1998).

2.1.1 Klasifikasi Enzim

Klasifikasi enzim secara internasional meliputi: nama golongan dan

macam reaksi yang dikatalisisnya (Wirahadikusumah, 1989). Enzim menurut

Poedjadi (1994), dibagi menjadi enam golongan yang digolongkan berdasarkan

pada jenis reaksi yang dikatalisis, keenam golongan enzim tersebut yaitu:

1) Oksido-reduktase

Enzim yang berperan dalam reaksi oksidasi-reduksi. Enzim yang

termasuk dalam golongan ini ada dua yaitu dehidrogenase dan oksidase. Contoh

enzim dehidrogenase yaitu: alkohol dehidrogenase dan glutamat dehidrogenase.

Contoh enzim oksidase yaitu: glukosa oksidase dan glisin oksidase.

2) Transferase

Enzim yang berperan dalam reaksi pemindahan gugus tertentu. Contoh

enzim yang termasuk golongan ini adalah metiltransferase,

hidroksimetiltransferase dan aminotransferase.

3) Hidrolase

Enzim yang berperan dalam reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis enzim

hidrolase, yaitu jenis yang memecah ikatan ester, memecah glikosida, dan yang

6

memecah ikatan peptida. Contoh enzim hidrolase yaitu esterase, lipase, amilase,

aminopeptidase, karboksipeptidase, pepsin, tripsin, dan kimotripsin.

4) Liase

Enzim yang termasuk golongan ini mempunyai peranan penting didalam

reaksi pemisahan suatu gugus dari suatu substrat (bukan cara hidrolisis).

2.1.2 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi

enzim, konsentransi substrat, temperatur dan pH.

1) Konsentrasi enzim

Terdapat hubungan linear antara konsentrasi enzim dengan laju reaksi.

Semakin tinggi konsentrasi enzim maka semakin cepat laju suatu reaksi (Pelczar

and Chan 2005). Grafik pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi dapat

dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Grafik Pengaruh Konsentrasi Enzim terhadap Laju Reaksi

(Sumber: Pelczar dan Chan, 2005)

2) Konsentrasi substrat

Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi suatu enzim.

Konsentrasi yang tinggi dapat mempercepat laju reaksi. Tapi apabila konsentrasi

substrat diperbesar maka tidak ada lagi penambahan laju reaksi (Berg et al.,

2007). Hal ini disebabkan enzim mengalami kejenuhan karena konsentrasi

substrat yang tinggi namun tanpa adanya peningkatan konsentrasi enzim

7

sehingga semua sisi aktif enzim sudah ditempati oleh substratnya dan ketika

produk telah terbentuk serta meninggalkan sisi aktif enzim maka segera sisi aktif

enzim akan ditempati oleh molekul substrat berikutnya (Campbell et al., 1998).

Peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kecepatan laju reaksi

sampai batas tertentu dimana enzim telah jenuh oleh keberadaan substrat

sehingga kecepatan laju suatu reaksi akan konstan. Grafik pengaruh konsentrasi

substrat terhadap laju reaksi dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Grafik Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Laju Reaksi

(Sumber: Pelczar and Chan, 2005)

3) Suhu

Suhu dapat menentukan aktivitas maksimum enzim. Tercapainya suhu

optimum tergantung pada enzim, pH, dan waktu. Makin tinggi suhu akan lebih

meningkatkan kecepatan reaksi. Hal ini disebabkan oleh atom-atom dalam

molekul enzim memiliki energi yang lebih besar dan adanya kecenderungan

untuk bergerak karena membukanya rantai ikatan protein setelah putusnya

ikatan-ikatan yang lemah sehingga akan menurunkan tingkat laju keseluruhan

(Campbell et al., 1998).

Pada suhu optimum energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi

bertambah sehingga molekul-molekul yang bereaksi semakin banyak dan produk

yang dihasilkan semakin besar. Di atas suhu optimum aktivitas enzim akan turun

karena terjadi denaturasi protein yang dapat merubah konformasi struktur

sehingga enzim akan kehilangan sifat alamiahnya. Denaturasi protein dapat

8

terjadi pada suhu 45o-50o C. Beberapa enzim yang sangat tahan terhadap

denaturasi pada suhu tinggi, khususnya enzim hasil isolasi dari mikroorganisme

termofilik (Pelczar and Chan, 2005). Grafik pengaruh suhu terhadap laju reaksi

dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Grafik Pengaruh Suhu terhadap Laju Reaksi

(Sumber: Pelczar dan Chan, 2005)

4) pH

Aktivitas konsentrasi enzim yang dapat mencapai maksimum disebut pH

optimum. pH optimum menunjukkan muatan gugus samping asam amino berada

pada keadaan yang sesuai sehingga enzim sangat efisien dalam mempercepat

reaksi biokimia yang spesifik (Campbell et al., 1998). pH optimum tergantung

pada masing-masing enzim karena setiap enzim memiliki pH optimum yang

spesifik yang juga tergantung pada konsentrasi substrat yang digunakan. Pada

kondisi pH rendah maka gugus muatan negatif akan terprotonasi sehingga dapat

menetralkan muatan negatif. Pada kondisi pH tinggi maka gugus muatan positif

akan terdisosiasi sehingga dinetralkan. Grafik pengaruh ph terhadap laju reaksi

dapat dilihat pada Gambar 4.

9

Gambar 4. Grafik Pengaruh pH terhadap Laju Reaksi

(Sumber: Pelczar dan Chan, 2005)

2.2 Enzim Gelatinase

Enzim gelatinase merupakan enzim yang berperan dalam hidrolisis

gelatin menjadi polipeptida, peptida, asam amino (Shahimi et al., 2016). Gelatin

menurut Hastuti dan Sumpe (2007), adalah produk alami yang diperoleh dari

hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan protein yang larut yang bisa bersifat

sebagai gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai non gelling agent.

Terdapat beberapa spesies bakteri yang dapat menghasilkan enzim

gelatinase, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. fumarioli, B. pumilus, B.

gelatini, B. thermoamylovrans, dan Anoxybacillus, Brevibacillus, dan Geobacillus

(Declerck et al., 2004). Dalam mengidentifikasi bakteri yang dapat menghasilkan

gelatinase dapat dilakukan tes hidrolisis gelatin. Tes ini berlangsung dalam dua

reaksi berurutan. Dalam reaksi pertama, gelatinase akan memecah gelatin

menjadi polipetida dan selanjutnya akan diubah menjadi asam amino.setelah itu,

asam amino hasil hidrolisis akan diambil oleh bakteri untuk digunakan dalam

proses metabolisme. Jika gelatin telah tedegradasi, medium yang digunakan

tidak dapat menjadi cair sehingga jika suatu organism dapat memecah gelatin,

medium yang berisikan gelatin akan tetap menjadi cair walaupun telah

dimasukkan ke dalam kulkas sekalipun (Roy, 2013).

Berikut disajikan mekanisme hidrolisis gelatin oleh enzim gelatinase pada

Gambar 5.

10

Gambar 5. Mekanisme Gelatinase Menghidrolisis Gelatin

(Sumber: Roy, 2013)

2.3 Pidada Putih (Sonneratia alba)

Pidada putih (Sonneratia alba) ditemukan pada daerah estuaria yang

berbatasan antara muara sungai dengan substrat yang berpasir. Sonneratia alba

dapat tumbuh baik pada lokasi bersubstrat pasir, lumpur, atau berpasir (Bengen,

2004). Gambar mangrove Pidada Putih dapat dilihat pada Gambar 6. Adapun

klasifikasi mangrove Pidada Putih menurut Puspayanti et al., (2013) adalah

sebagai berikut.

Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Myrtales Famili : Sonneratiaceae Genus : Sonneratia Spesies : Sonneratia alba Smith.

Gambar 6. Mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba)

Sonneratia alba memiliki kulit kayu berwarna putih tua hingga coklat,

dengan celah longitudinal yang halus. Akarnya berbentuk kabel di bawah tanah

11

dan muncul kepermukaan sebagai akar nafas yang berbentuk kerucut tumpul

dan tingginya mencapai 25 cm. Daun Sonneratia alba memiliki susunan tunggal,

bersilangan, bentuk oblong sampai bulat ukuran panjang 5–10 cm. Bunga

biseksual, gagang bunga tumpul panjangnya 1 cm. Letaknya di ujung atau pada

cabang kecil. Buah Sonneratia alba seperti bola, ujungnya bertangkai dan bagian

dasarnya terbungkus kelopak bunga. Buah mengandung banyak biji (150-200

biji) dan tidak akan membuka pada saat telah matang. Sonneratia alba dapat

mencapai ketinggian mencapai 20 meter dengan diameter 40 cm, memiliki

system perakaran akar napas, seperti biji, kokoh, lancip, diameter pangkal akar

mencapai 5 cm. Sonneratia alba umumnya tumbuh didaerah pertemuan sungai

yang landai atau teluk berlumpur dalam (Tjitrosoepomo, 2009).

Sonneratia alba adalah jenis pionir, tidak toleran terhadap air tawar dalam

periode yang lama, menyukai tanah yang bercampur lumpur dan pasir, kadang-

kadang pada batuan dan karang. Sering ditemukan di lokasi pesisir yang

terlindung dari hempasan gelombang, juga di muara dan sekitar pulau-pulau

lepas pantai, di lokasi dimana jenis tumbuhan lain telah ditebang, maka jenis ini

dapat membentuk tegakan yang padat. Perbungaan terjadi sepanjang tahun,

bunga hidup tidak terlalu lama dan mengembang penuh di malam hari, mungkin

diserbuki oleh ngengat, burung dan kelelawar pemakan buah.Di jalur pesisir yang

berkarang mereka tersebar secara vegetative.Kunang-kunang sering menempel

pada pohon ini dikala malam. Buah mengapung karena adanya jaringan yang

mengandung air pada bijinya. Akar nafas tidak terdapat pada pohon yang

tumbuh pada substrat yang keras (Noor et al., 2006).

Sonneratia alba merupakan jenis mangrove yang banyak dimanfaatkan

oleh masyarakat lokal sebagai dodol, wajik, permen dan sirup. Salah satu alasan

mengkonsumsi buah Sonneratia alba adalah mirip dengan apel (mangrove

apple) dan tidak beracun untuk dikonsumsi. Masyarakat di Sulawesi Selatan,

12

khususnya daerah Kabupaten Luwu dan Tana Toraja, menggunakan kulit batang

Sonneratia alba dalam proses pembuatan salah satu jenis minuman tradisional

beralkohol dengan tujuan untuk mempertahankan aroma dan mencegah rasa

kecut (Firdaus dan Sinda 2003). Selain itu, Sonneratia alba juga digunakan

sebagai obat, dimana kulitnya digerus dan direbus dan air rebusannya diminum

untuk mengontrol kehamilan dan membantu dalam persalinan kelompok etnik

Biak (Mamoribo et al., 2003).

2.4 Bakteri Endofit

Mikroba endofit adalah organisme hidup berukuran mikroskopis (bakteri

dan jamur) yang hidup di dalam jaringan tanaman (xylem dan floem), daun, akar,

buah, dan batang (Simarmata et al., 2007). Tanaman tingkat tinggi mengandung

beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan metabolit sekunder yang

diduga akibat koevolusi transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman

inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan et al., 2001). Bakteri endofit menurut

Hallman et al. (1997) adalah bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman tanpa

menimbulkan gejala penyakit pada tanaman tersebut dan dapat diisolasi dari

jaringan tanaman yang sudah disterilisasi permukaannya atau diekstrak dari

jaringan tanaman bagian dalam. Bakteri ini dapat hidup pada bagian tanaman

seperti pada akar, batang, bunga dan kotiledon (Resti et al., 2013). Populasi

bakteri paling tinggi terdapat pada akar (Hidayah dan Yulianti, 2008).

Beberapa bakteri yang termasuk bakteri endofit yaitu Enterobacter,

Rahnella, Rhodanobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Xanthomonas an

Phyllobacterium (Khan dan Doty, 2009). Bakteri digunakan sebagai sumber

suatu produk hayati akan memudahkan proses dan mengurangi biaya produksi,

sehingga pada akhirnya menghasilkan produk dengan harga lebih murah (Radji,

2005). Bakteri endofit yang menginfeksi tanaman sehat pada jaringan tertentu

13

mampu menghasilkan mikotoksin, enzim, antibiotika serta metabolit lain (Putra,

2007). Beberapa keuntungan bila menggunakan mikroorganisme dalam

menghasilkan produk hayati adalah dapat diproduksi dalam skala besar, waktu

yang diperlukan untuk produksi relatif efisien dan dapat diproduksi secara

berkesinambungan dengan biaya relatif rendah (Melliawati et al., 2015).

2.5 Isolasi dan Identifikasi Spesies Mikroorganisme

2.5.1 Isolasi Mikroorganisme

Isolasi adalah proses pemurnian bakteri dari sekelompok bakteri yang

terdapat dalam habitat yang sama. Pemurnian ini bertujuan untuk mendapatkan

bakteri murni yang hanya terdiri dari satu spesies saja. Bakteri yang sudah

dimurnikan, kemudian akan dibiakkan dalam media buatan untuk mendapatkan

kultur bakteri murni dalam jumlah banyak. Terdapat tiga jenis isolasi yang umum

dilakukan yaitu isolasi pada media cawan, isolasi pada medium cair, dan isolasi

sel tunggal. Isolasi agar cawan dilakukan dengan menggunakan goresan

kuadran atau metode agar tuang. Keberhasilan metode ini sangat tinggi karena

kebanyakan bakteri, kapang dan khamir dapat membentuk koloni pada media

padat sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan sel-sel tersebut pada

agar cawan sehingga timbul koloni- koloni yang terpisah. Isolasi medium cair

digunakan untuk beberapa bakteri yang ukuran selnya besar, tidak dapat tumbuh

pada agar cawan, hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode yang digunakan

adalah metode pengenceran. Metode ini mempunyai kelemahan karena hanya

dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba yang jumlahnya dominan dalam

suatu campuran populasi mikroba. Isolasi sel tunggal digunakan untuk

mengisolasi sel mikroba yang ukurannya besar serta tidak dapat diisolasi dengan

metode cawan maupun pengenceran (Fardiaz, 1988).

14

Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikroba perlu dilakukan isolasi untuk

memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar dan Chan (1986), setiap koloni yang

berlainan mewakili macam mikroba yang berbeda sehingga hal ini dapat

digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikroba. Untuk mengisolasi mikroba di

bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang akan

memenuhi persyaratan tipe mikroba tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan

dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi,

dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar dan Chan,

1986).

Mikroba endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang

telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai.

Pada isolasi mikroba endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong

pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli et al., 2001). Prosedur

isolasi bakteri endofit adalah kunci penting untuk penelitian bakteri endofit

(Hallmann et al., 1997), karena hal ini cukup sensitif untuk mendapatkan bakteri

endofit, beberapa prosedur isolasi hanya cocok untuk jaringan tanaman tertentu.

Proses isolasi sering menggunakan gabungan sterilisasi permukaan jaringan

akar dengan perendaman jaringan tanaman serta menggunakan metode streak

atau metode plate (Schulz et al., 2006).

Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan

merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara

mengisolasi dan menanam mikroba adalah:

1) Spread plate method (cara tebar/sebar)

Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara

menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/ sebaran di permukaan media agar

yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur

mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui,

15

maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-

kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-

300 koloni). Koloni mikroba yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat

dihitung.

2) Pour plate method (cara tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang

mencair pada temperatur 45-50 oC dengan suspensi bahan yang mengandung

mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan

terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari

1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono et al., 1980)..

3) Streak plate method (cara gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada

cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni.

Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung

mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah

inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang

mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono

et al., 1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang

terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang

menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal

tersebut harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering

permukaannya (Lay, 1994).

16

2.5.2 Identifikasi Mikroorganisme dengan Teknik Molekular 16S rRNA

Metode pengklasifikasian bakteri secara molekular dengan pendekatan

genetik muncul pada tahun 1940 an. Pendekatan genetik digunakan untuk

mengukur kedekatan dan kekerabatan antara isolat-isolat bakteri. Proses

pengklasifikasian tersebut terus dikembangkan sampai akhirnya ditemukan

metode baru, yaitu metode analisis urutan DNA yang menyandi gen 16S rRNA

(Murray et al., 2001).

Beberapa sebab mengapa gen 16S rRNA digunakan untuk identifikasi

bakteri yaitu : (1) bersifat universal (dapat ditemukan di semua jenis bakteri), (2)

sekuen basanya bersifat konservatif, (3) jumlah di dalam sel melimpah, (4)

memenuhi ukuran untuk perhitungan secara statistika (tidak terlalu panjang dan

tidak terlalu pendek), serta (5) ketersediaan informasinya lengkap, yaitu dengan

cara mengakses database di GenBank (Madigan et al., 1997). Proses amplifikasi

gen 16S rRNA dapat dilakukan melalui teknik PCR.

a) Isolasi DNA

Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau

gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan

DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan

enzimatik yang sangat spesifik. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi

enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari

vektor pengklonan. Oleh sebab itu isolasi DNA genom yang utuh sangat

diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan

Widyastuti, 2006).

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk

berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui

elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari

bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama isolasi DNA ada

17

tiga yakni penghancuran, ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti

selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Sambrook et al., 1989).

b) Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction atau reaksi rantai polimerase adalah teknik

ilmiah dalam biologi molekular yang digunakan untuk mengamplifikasi beberapa

basa DNA menjadi ribuan sampai jutaan kopi basa. PCR dikembangkan oleh

Kary Mullis pada 1983 (Bartlett et al., 2003). Reaksi PCR merupakan reaksi

replikasi DNA yang terjadi di luar tubuh makhluk hidup.

Reaksi polymerase chain reaction membutuhkan beberapa komponen.

Komponen-komponen tersebut meliputi primer, dNTP, bufer, kation divalen, DNA

cetakan, dan DNA polimerase. Primer adalah sepasang DNA untai tunggal atau

oligonukleotida rantai pendek yang menginisiasi gen DNA target. dNTP alias

building blocks berfungsi sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP

terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP,

dGTP, dan dTTP. Bufer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi dan

menyediakan lingkungan kimia yang cocok agar PCR berjalan optimum dan

menstabilkan DNA polimerase. Kation divalen yang umum digunakan dalam

reaksi PCR adalah magnesium (Mg2+). Kation divalen berfungsi sebagai kofaktor

DNA polimerase. DNA cetakan merupakan sumber gen DNA target. DNA

polimerase berfungsi sebagai enzim. DNA polimerase mempunyai suhu optimal

sekitar 700C (Sambrook et al., 2001).

Reaksi PCR dilakukan dalam sebuah alat pengendali suhu yang dapat

memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi dalam waktu singkat. Reaksi PCR

mempunyai siklus optimal antara 20 - 40 siklus, dimana masing-masing siklus

terdiri dari 2 - 3 suhu berbeda (Rychlik et al., 1990). Reaksi PCR mempunyai

18

beberapa tahapan, antara lain inisiasi, denaturasi, annealing, extension, dan

elongasi akhir.

Teknik PCR telah digunakan secara luas untuk berbagai macam

kebutuhan, antara lain:

1. Isolasi Gen

DNA berfungsi sebagai penyandi genetik, yaitu panduan sel dalam

memproduksi protein dan sebagai transkrip DNA untuk menghasilkan RNA

(Yuwono, 2007). Selanjutnya, RNA diterjemahkan untuk menghasilkan rantai

asam amino atau protein. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA yang dikenal

dengan nama probe. DNA probe memiliki urutan basa nukleotida yang sama

dengan gen target yang akan diisolasi. Probe dibuat dengan teknik PCR dengan

menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

2. Sekuensing DNA

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik sekuensing DNA.

Metode sekuensing DNA yang umum digunakan adalah metode Sanger (chain

termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy

terminator, dimana pada proses awal reaksi PCR hanya menggunakan satu

primer dan tambahan dideoxynucleotide yang diberi label fluorescent. Warna

fluorescent setiap basa berbeda. Perbedaan warna tersebut digunakan untuk

membedakan dan menentukan urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui.

c) Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis menurut Yuwono (2007), adalah suatu teknik pemisahan

molekul sel berdasarkan massa dan bentuk molekulnya dengan menggunakan

medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang

akan dipisahkan. Elektroforesis memanfaatkan muatan listrik yang ada pada

makromolekul, yaitu DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan

negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari kutub

19

positif ke kutub negatif, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif

ke kutub positif. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk menganalisis DNA,

RNA, maupun protein. Elektroforesis DNA digunakan untuk menganalisis

fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi, hasil isolasi DNA

kromosom, produk PCR, dan lain sebagainya. Elektroforesis DNA memerlukan

gel agarosa. Agarosa merupakan suatu bahan semi-padat berupa polisakarida

yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan serbuk

agarosa dalam suatu bufer dan dibantu pemanasan.

2.5.3 Analisis Hasil Sekuensing dan Analisis Pohon Filogenik

Dalam ilmu biologi, filogeni atau filogenesis adalah kajian mengenai

hubungan antara kelompok-kelompok organisme yang dikaitkan dengan proses

evolusi. Filogenetik merupakan ilmu yang mempelajari hubungan evolusi

beberapa kelompok organisme yang berbeda (contohnya spesies atau populasi).

Dalam studi filogenetik, cara yang paling tepat untuk menghubungkan beberapa

kelompok organisme adalah dengan membuat atau mendesain pohon filogenetik.

Pohon filogenetik digunakan untuk membatasi taksa masing-masing kelompok

individu yang saling terhubung.

Struktur pohon filogenetik terdiri dari root, branch, node, branch length,

dan clade. Root merupakan nenek moyang semua taksa. Branch mendefinisikan

hubungan antara taksa. Node mewakili unit taksonomi dan dapat berupa suatu

spesies yang telah ada. Branch Length mewakili jumlah perubahan yang telah

terjadi. Clade berupa kelompok dua taksa atau lebih.

2.5.4 Program BLAST Sebagai Penunjang Pembuatan Pohon Filogenetik

Program BLAST dapat digunakan untuk membandingkan urutan

terpenting dari semua urutan yang tersimpan dalam GenBank maupun NCBI.

Jika nama ilmiah atau hubungan kekerabatan suatu organisme tidak diketahui,

20

NCBI menyediakan link langsung ke beberapa organisme yang umum digunakan

dalam proyek penelitian molekuler.

2.5.5 Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial

yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Prinsip pewarnaan

Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar (kristal violet)

setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu

karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan sel gram

negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan

kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Pelczar and Chan, 2008).

Tabel 1. Pewarnaan Gram

No Larutan Reaksi pada bakteri

Gram Positif Gram Negatif

1. Ungu kristal (UK)

Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu

2. Larutan yodium (Y)

Komplek UK-Y terbentuk di dalam sel; sel tetap berwarna ungu

Kompleks UK-Y tebentuk di dalam sel; sel tetap berwarna ungu

3. Alkohol Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut; daya rembes dinding sel dan membran menurun, UK-Y tak dapat keluar dari sel; sel tetap berwarna ungu

Lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks UK-Y keluar dari sel; sel menjadi tak berwarna

4. Safranin Sel tak terpengaruhi, tetap ungu.

Sel menyerap zat pewarna, menjadi merah.

Sumber: Pelczar dan Chan, 2008

3. METODE PENELITIAN

3.1 Materi Penelitian

3.1.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium

Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya, Malang, Laboratorium

Keamanan Hasil Perikanan dan Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya Malang, serta Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana

Malik Ibrahim, Malang. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari-September

2017.

3.1.2 Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada proses penelitian isolasi dan identifikasi

bakteri adalah cawan petri, tabung reaksi, rak tabung rekasi, erlenmeyer, beaker

glass, mortar dan alu, , vortex mixer, gelas ukur, pipet volume, pipet serologis,

bola hisap, spatula, corong kaca, jarum loop, jarum ose, sprayer, bunsen,

washing bottle, nampan, laminar air flow (LAF), autoklaf, timbangan digital, lemari

pendingin, kamera, spatula, kompor, panci, PCR (Polymerase Change Reaction),

elektroforesis, dry bath, hot plate, sentrifuge, spektrofotometer uv-vis, cuvet, blue

tip, yellow tip, tube sentrifuge, vortex mixer, mikroskop, kaca objek, cover glass,

dan freezer.

Bahan yang digunakan pada proses penelitian isolasi dan identifikasi

bakteri meliputi bahan utama yaitu akar mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba)

yang diambil dari Pantai Aeng Sareh Madura, bahan untuk media isolasi

menggunakan Luria Bertani Agar (LBA) dengan komposisi pepton, NaCl, yeast

ekstrak, agar bakteriologi, media skrinning gelatin dengan komposisi pepton 5

22

g/l, beef extract 3g/l, gelatin 120 g/l, bahan untuk pewarnaan gram yaitu:

akuades, kristal violet, safranin, iodin, alkohol.

Sedangkan bahan untuk identifikasi 16S rRNA adalah buffer cell lysis

solution, nuclei lysis, protein precipitation solution, isopropanol, ethanol 70%,

DNA rehydration solution, Tris-EDTA (TE) buffer, komposisi PCR dengan volume

total 20 μl/tube terdiri atas 6 μl ddH2O, 10 μl PCR kit Go Taq® Green Master Mix

(10 x buffer taq polymerase, dNTP, MgCl2, primer, Taq DNA polymerase,

ddH2O), primer forward 1 μl, primer reverse 1 μl dan 2 μl DNA, agarosa, TBE

buffer, etidium bromide, ddH2O, Komposisi sequencing terdiri dari amplikon gen

sampel yang telah dipurifikasi 2 µl, ddH2O 10 µl, Big Dye terminator 8 µl

(menggunakan ABIPRISM® Big Dye® terminator v3.1 cycle sequencing kits),

larutan penyangga 5 µl (buffer dengan EDTA (Applied Biosystem)), dan primer

dengan konsentrasi 20 pmol, Hi-DiTM Formamide (Genetic Analysis Grade-

Applied Biosystem).

3.2 Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskiriptif

eksploratif yaitu proses menganalisa dan memperbarui data dalam

pengumpulannya disajikan secara sistemik untuk pemahaman yang lebih mudah.

Penelitian deskriptif eksploratif menurut Arikunto (2002), yaitu suatu jenis

penelitian yang menjelaskan fenomena dalam suatu penelitian dengan

menemukan hal yang baru penyebab suatu gejala. Penelitian deskriptif

eksploratif menurut Suryabrata (2006), adalah metode menemukan hal baru

menemukan sebab-sebab kemungkinan hubungan keterkaitan dengan

penjelasan yang rinci kepada satu atau lebih kelompok faktor yang saling terkait.

23

3.3 Prosedur Penelitian

Proses penelitian ini dirancang dalam 2 tahapan penelitian yang saling

terkait yaitu:

Tahap I:

• Pengambilan sampel mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba) di Pantai

Aeng Sareh Madura

• Isolasi bakteri endofit mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba)

Tahap II:

• Skrining bakteri endofit mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba)

penghasil enzim gelatinase

• Identifikasi molekuler bakteri endofit mangrove Pidada Putih (Sonneratia

alba) penghasil enzim gelatinase

3.3.1 Penelitian Pendahuluan (Tahap I)

3.3.1.1 Pengambilan Sampel Mangrove (Munif, 2011)

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel yang berasal

dari endofit akar mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba) yang berasal dari

Pantai Aeng Sareh, Sampang, Madura. Sampel akar Pidada Putih (Sonneratia

alba) diambil secara acak akar yang menjulang ke atas yang berdiameter ±1 cm

dengan panjang 10 cm. Kemudian dikemas di dalam plastik polyethylene.

Sampel yang telah diambil dibawa menuju Laboratorium Keamanan Hasil

Perikanan (KHP) Universitas Brawijaya Malang dan disimpan pada suhu 4 ºC

hingga sampel akan digunakan. Skema pengambilan mangrove dapat dilihat

pada Lampiran 1.

Pantai Aeng Sareh merupakan Pantai yang bertempat di Desa Aeng

Sareh, Kecamatan Sampang, Kabupaten Sampang, Madura, Jawa Timur. Pantai

Aeng Sareh memiliki jarak sekitar 112 km dari Kota Malang. Letak geografis

24

Pantai Aeng Sareh pada 7°13'5.57"S dan 113°19'8.89"E. Peta wilayah

pengambilan sampel dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. Peta Lokasi Pengambilan Sampel

3.3.1.2 Isolasi Bakteri Endofit Mangrove

3.3.1.2.1 Preparasi Sampel (Munif, 2011)

Sampel bagian akar mangrove Sonneratia alba dicuci dengan air

mengalir. Kemudian sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Lalu

sampel dihaluskan menggunakan mortar dan alu yang steril. Selanjutnya masing-

masing sampel yang sudah halus ditimbang sebanyak 1 gram lalu dimasukkan

ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml Na-fis steril sebagai pengenceran 10-1, dan

dihomogenkan dengan menggunakan vortex mixer. Selanjutnya, dilakukan

pengenceran dari 10-1 hingga 10-5 dengan mengambil 1 ml dari pengenceran 10-1

dan dipindah ke dalam tabung reaksi pengenceran 10-2 begitu seterusnya hingga

pengenceran 10-5 dengan pipet serologis yang berbeda.

Skala 1: 1.800.000

25

3.3.1.2.2 Pembuatan Media LBA (Sambrook dan Russel, 2001)

Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Luria Bertani

Agar (LBA). Digunakan media LBA karena memungkinkan pertumbuhan yang

cepat dan hasil pertumbuhan yang baik bagi banyak spesies (Sezonov et al.,

2007). Media LBA ditimbang berdasarkan komposisinya. Komposisi media LBA

per 1000 ml antara lain 5 gram yeast extract, 10 gram pepton, 10 gram NaCl, dan

15 gram agar bakteriologi. Bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam

erlenmeyer dan ditambahkan akuades. Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan

alumunium foil. Media disterilisasi dengan autoklaf 121 ºC dan tekanan 0,15 MPa

selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi, media dikeluarkan dan dibiarkan

hingga hangat-hangat kuku. Selanjutnya proses penuangan pada cawan petri

steril dengan pengkondisian aseptis. Media ditunggu hingga memadat dan

dilanjutkan proses penanaman.

3.3.1.2.3 Penanaman pada Media LBA (Aminullah et al., 2015)

Setelah dilakukan pengenceran bertingkat, dilakukan penanaman pada

media Luria-Bertani Agar. Proses penanaman dilakukan di dalam laminar air

flow. Metode penanaman yang digunakan adalah metode sebar. Sampel dari

pengenceran 10-3 hingga 10-5 diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan ke

permukaan LBA dalam cawan petri, dan diratakan menggunakan triangle.

Selanjutnya sampel diinkubasi selama 24 jam dengan temperatur 37 ºC.

3.3.1.2.4 Isolasi Murni dan Pembuatan Stok Bakteri (Aminullah et al., 2015)

Media LBA yang telah ditanam bakteri dan sudah diinkubasi diamati dan

dilihat koloni yang tumbuh. Kemudian dilakukan pemilihan isolat bakteri untuk

dimurnikan. Adapun karakteristik pemilihan isolat bakteri dilihat dari terpisahnya

bakteri dari koloni. Apabila terdapat koloni tunggal yang tumbuh, isolat

26

diinokulasikan ke media LBA baru dengan komposisi yang sama menggunakan

metode streak plate kuadran.

Cara menginokulasi dengan metode streak kuadran yaitu pertama

panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Lalu

ose yang sudah dingin untuk digoreskan pada permukaan media LBA dalam

cawan petri dengan pola zig-zag, kemudian cawan diputar 90º dan dilakukan

streak pada bagian 2 dengan menggores satu kali bagian 1 dan dibuat pola zig-

zag hingga dua per tiga cawan tertutup, kemudian ulangi cara sebelumnya

dibagian 3 hingga semua tertutup oleh goresan isolat. Setelah dimurnikan,

diinkubasi lagi selama 24 jam dengan temperatur 37 ºC. Pemilihan isolat dengan

memperhatikan bakteri yang terpisah dari koloni dengan warna yang sama

dengan koloni.

Selanjutnya membuat stok bakteri dan isolat tersebut dibuat dengan

menyimpannya di agar miring. Caranya dengan mengambil 1 koloni dari cawan

pemurnian bakteri kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi berisi media

Luria-Bertani Agar 5 ml yang sudah memadat dan miring. Kemudian diinkubasi

selama 24 jam dengan temperatur 37 ºC, setelah diinkubasi stok bakteri

disimpan di lemari es. Skema isolasi bakteri endofit dapat dilihat pada Lampiran

2 dan dokumentasi isolasi bakteri endofit dapat dilihat pada Lampiran 3.

3.3.2 Penelitian Utama (Tahap II)

3.3.2.1 Penapisan Bakteri Penghasil Gelatinase (Cruz dan Torres, 2012)

Isolat bakteri yang diperoleh dari bagian mangrove Pidada Putih

(Sonneratia alba) diuji aktivitas gelatinasenya secara kualitatif. Isolat bakteri

diambil menggunakan jarum loop yang telah disterilisasi, kemudian ditanamkan

ke tabung reaksi yang berisi media skrining gelatinase dengan komposisi yang

ditunjukkan oleh Tabel 2 berikut ini.

27

Tabel 2. Komposisi Media Skrining Gelatinase

Bahan Jumlah (g/l)

Pepton Beef Extract Gelatin

5 3 120

(Sumber: Cruz dan Torres, 2012)

Kemudian isolat bakteri yang sudah ditanam diinkubasi pada suhu ruang

selama 3 hari. Jika media gelatin yang telah diinokulasikan kultur murni mencair

pada suhu ruang, dan tidak bisa kembali membeku saat didinginkan selama 30

menit di dalam kulkas maka kultur tersebut positif menghasilkan enzim

gelatinase. Skema proses skrining bakteri penghasil gelatinase dapat dilihat pada

Lampiran 4.

3.3.2.2 Analisa Spesies Bakteri Menggunakan Sekuensing 16S rRNA

1) Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan prosedur dari Kit Isolasi

DNA (Wizard Genomic DNA Purification Kit from Promega) dengan langkah

berikut; diambil 0,5 g sampel, dimasukkan dalam tube 2 ml yang berisi 1,5 ml

buffer cell lysis solution dan di mix (sampai tercampur). Inkubasi pada temperatur

ruang selama 10 menit kemudian centrifuge 2,000 xg selama 10 menit.

Supernatan dibuang dengan tetap memperhatikan pelet agar tidak ikut terbuang,

pellet ditambahkan 1 ml nuclei lysis dan di vortek. Tambahkan 0,3 ml protein

precipitation solution, kemudian di vortek selama 20 detik, centrifuge 2,000 xg

selama 10 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan tube 1,5 ml baru yang

berisi 1 ml isopropanol kemudian di vortek dan dicentrifuge 2,000 xg selama 1

menit. Supernatan dibuang (pellet tidak boleh terbuang), ditambahkan 1 ml

etanol 70% centrifuge 2,000 xg selama 1 menit, supernatant dibuang dan pelet

dikeringkan dengan vakum untuk memastikan etanol benar-benar hilang. Hasil

pelet dilarutkan dengan menambahkan 75 µl DNA rehydration solution. Setelah

28

itu diinkubasi pada temperatur 65 ºC selama 1 jam, selanjutnya disimpan pada

temperatur -20 ºC hingga digunakan.

2) Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA yang telah diisolasi

menggunakan mesin UV spektrofotometer Biorad. Pengukuran kemurnian dan

konsentrasi DNA dilakukan dengan mengambil sampel DNA sebanyak 5 μl

kemudian ditambah dengan 995 μl Tris-EDTA (TE) buffer dan diletakkan pada

alat vortek hingga larutan homogen. Lalu larutan dimasukkan dalam kuvet dan

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm.

Sebelum dilakukan absorbansi dilakukan peneraan dengan menggunakan TE

buffer sebagai larutan blanko. Penentuan tingkat kemurnian DNA dilakukan

dengan rumus berikut.

Kemurnian DNA pada perbandingan pada kisaran nilai <0,5. DNA

yang memiliki kisaran nilai kemurnian >0,5 menunjukkan keberadaan

kontaminasi polisakarida. Perhitungan kemurnian DNA pada perbandingan

memiliki kisaran nilai 1,8-2. DNA yang memiliki kisaran nilai kemurnian >2

menunjukkan bahwa terjadi kontaminasi protein sedang kisaran nilai <1,8

menunjukkan keberadaan kontaminasi RNA (Fatchiyah et al., 2011). Perhitungan

konsentrasi DNA dilakukan dengan rumus berikut.

Keterangan: A260 = nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 yang sebanding dengan 50 μg untai ganda DNA per ml

Konsentrasi DNA = A260 x 50 x Faktor Pengenceran

Kemurnian DNA =

29

3) Primer

Primer merupakan rantai asam nukleat yang berfungsi sebagai titik awal

untuk mensintesis DNA yang diperlukan dalam mereplikasi DNA. Primer yang

digunakan pada penelitian ini adalah berdasarkan Lane (1991). Primer dapat

dilihat pada Tabel 3 berikut ini.

Tabel 3. Primer Forward dan Reverse

Primer Lokasi Temperature Melting

5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ 27F 52,2 ºC 5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’ 1492R 52.8 ºC

4) Amplifikasi Gen dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Amplifikasi genotyping gen dilakukan dengan teknik Polymerase Chain

Reaction atau PCR dengan menggunakan mesin thermal cycler. Komposisi PCR

dengan volume total 20 μl/tube terdiri atas 6 μl ddH2O, 10 μl Polymerase Chain

Reaction (PCR) kit Go Taq® Green Master Mix (10 x buffer taq polymerase,

dNTP, MgCl2, primer, Taq DNA polymerase, ddH2O), primer forward 1 μl, primer

reverse 1 μl dan 2 μl DNA sampel hasil isolasi.

Penentuan temperatur amplifikasi mengacu pada Correa (2012), secara

berurutan proses amplifikasi dikondisikan pada temperatur pre-denaturasi 95 ºC

selama 5 menit 1 kali siklus dan 30 kali siklus denaturasi dengan temperatur 95

ºC 30 detik, temperatur annealing 55 ºC selama 30 detik, dan temperatur

elongasi 72 ºC selama 30 detik, dilanjutkan dengan 1 siklus ekstensi pada

temperatur 72 ºC selama 10 menit dan temperatur 4 0C selama 5 menit.

5) Konfirmasi Hasil Amplifikasi Gen

Hasil Polymerase Chain Reaction (PCR) semua sampel DNA yang telah

diamplifikasi dikonfirmasi dengan menggunakan elektroforesis horizontal gel

agarosa 1,5%. Gel agarosa 1,5% dilakukan dengan cara berikut, bubuk agarosa

ditimbang sebanyak 0,6 gram kemudian dilarutkan di dalam 40 ml TBE buffer

30

dan dipanaskan hingga terbentuk larutan yang transparan (bening). Larutan

agarosa didiamkan hingga hangat kemudian dituangkan ke dalam cetakan

elektroforesis yang telah ditambah dengan 0,5 μl etidium bromida. Sisir dipasang

pada ujung bak elektroforesis dan didiamkan hingga larutan agarosa mengeras

(gel). Sisir diambil pada gel agarosa yang telah terbentuk kemudian dipindahkan

pada bak elektroforesis ditambah dengan TBE buffer hingga seluruh permukaan

gel tertutup larutan buffer. Sebanyak 2 μl sampel DNA dicampur dengan 1 μl

loading dye dicampur kemudian dimasukkan ke dalam sumuran secara perlahan.

Selanjutnya, dilakukan proses elektroforesis (running) dengan tegangan 65 Volt

selama 1,5 jam. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan menggunakan UV

transiluminator dan didokumentasikan dengan kamera polaroid.

6) Purifikasi Amplikon Gen

Sampel amplikon hasil PCR gen yang sebagian telah digunakan untuk

konfirmasi elektriforesis dimasukkan dalam tube dengan volume maksimum 1,5

ml. Sampel tersebut ditambah dengan sodium asetat (Merck) sebanyak 0,1%

dari total volume sampel amplikon dalam tube yang akan dipurifikasi. Berikutnya

ditambahkan ethanol absolut dingin sebanyak dua kali volume larutan sodium

asetat dan sampel amplikon. Kemudian dilakukan spin down dengan

menggunakan alat sentrifugasi dan disimpan pada temperatur -20 ºC selama 60

menit. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada

temperatur 4 ºC selama 15 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 200 µl

etanol 70% dingin dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada

temperatur 4 ºC selama 15 menit. Pelet hasil sentrifugasi ini kemudian

dikeringkan dengan menggunakan inkubator pada temperatur 37 ºC. Pelet yang

telah kering ditambah dengan ddH2O sebanyak 15 µl.

7) Sequencing (Pengurutan Sekuen) DNA Amplikon Gen

31

Sequencing atau pengurutan sekuen DNA dilakukan untuk mengetahui

sekuen DNA yang mengalami polimorfisme. Sequencing dilakukan dengan

menggunakan sampel DNA dari hasil PCR yang telah dipurifikasi. Pada

konfirmasi amplifikasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa, pita yang paling

tebal dipilih sebagai sampel untuk sequencing. Pita yang paling tebal dipilih

dengan asumsi bahwa DNA telah dikenali oleh primer yang spesifik dan

teramplifikasi dengan panjang sekuen yang sesuai. Komposisi sequencing terdiri

dari amplikon gen sampel yang telah dipurifikasi 2 µl, ddH2O 10 µl, Big Dye

terminator 8 µl (menggunakan ABIPRISM® Big Dye® terminatorv 3.1 cycle

sequencing kits), larutan penyangga 5 µl (buffer dengan EDTA (Applied

Biosystem), dan primer dengan konsentrasi 20 pmol sebanyak 2 µl sehingga

jumlah keseluruhan 25 μl. Selanjutnya dilakukan PCR sequencing dengan

optimasi temperatur sesuai petunjuk reagen kit sequencing, sampel hasil PCR

sequencing dilakukan purifikasi ulang sebelum dilanjutkan ke mesin sequencing,

hasil purifikasi berupa amplikon kedua ini ditambah dengan larutan buffer khusus

yaitu Hi-DiTM Formamide (Genetic Analysis Grade-Applied Biosystem) dan

disequencing menggunakan ABIPRISM® 310 Genetic Analyzer di Laboratorium

Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam

Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang.

3.3.2.3 Analisa Bioinformatika

Hasil sekuensing berupa elektroferogram dan urutan basa nukleotida

dianalisis dengan menggunakan program DNA Baser BioEdit. Menurut Hall

(1999), program BioEdit terintegrasi dengan program bioinformatika lainnya

seperti ClustalW, BLAST yang memungkinkan peneliti dapat mensejajarkan

banyak sekuen DNA secara bersamaan dan mencari kedekatannya dengan data

yang tersedia di gen bank secara akurat, mudah dioperasikan, bersifat open

32

source (tidak berbayar), dan yang terpenting memiliki tingkat ketepatan yang

tinggi. Pada penelitian ini program BioEdit digunakan untuk membaca hasil

sekuensing dan mengcopynya dalam bentuk format Fasta (>_) yang kemudian

digabungkan dengan cara manual.

Sedangkan untuk penggabungan hasil sekuensing antara forward dan

reverse dilakukan secara manual. Adapun langkah-langkahnya adalah sebagai

berikut: hasil pembacaan sekuensing yang berupa fasta forward dan reverse

dibuka pada Microsoft word. Kemudian pada fasta revese dicopy dan dilakukan

reverse complement dengan cara online pada laman

https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html kemudian submit dan

diperoleh hasil fasta reverse complement. Kemudian dilakukan pencarian basa

yang sama antara forward dan reverse complement dengan mencari secara

manual. Setelah diperoleh basa yang sama antara forward dan reverse

complement kemudian digabungkan basa bagain depan sampai basa bagian

yang sama pada forward dan basa setelah bagian yang sama sampai akhir pada

revrese complement, sehingga diperoleh format fasta assembly yang kemudian

dianalisis menggunakan BLAST.

3.3.2.3.1 Analisis BLAST

Hasil sequencing berupa urutan basa nukleotida kemudian dianalisis

dengan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Program ini berasal dari National Center of Biotechnology Information (NCBI)

yang mulai banyak dikembangkan diberbagai institusi baik pendidikan maupun

komersil. Program ini mencari kesamaan (similarity) antara sekuen DNA atau

protein yang ingin diketahui dengan database sekuen lain yang terdapat pada

GenBank. Kelebihan program ini adalah bekerja sangat cepat, dapat dipercaya,

dan fleksibel karena dapat diadaptasikan pada berbagai analisis sekuen (Bodell

33

et al., 2003). Pencarian database menurut Rukmana (2015), dapat dilakukan

dengan langkah-langkah sebagi berikut:

Diketik http://www.ncbi.nlm.nih.gov (website GenBank Amerika Serikat).

Diklik “BLAST” pada home NCBI. Dipilih Nucleotide blast untuk memilih program

analisis. Dimasukkan uturan DNA hasil sekuensing dalam program tersebut

dengan cara memblok data sekuen (dalam format FASTA) dan dicopy paste

pada form yang tersedia. Diklik “RUN BLAST” dan tunggu hasilnya.

3.3.2.3.2 Analisis Filogenetik Sekuen DNA

Setelah diketahui spesies dan genus bakteri, selanjutnya analisis

filogenetik sekuen DNA untuk memvisualisasikan hubungan kekerabatannya.

Pohon filogenetik dibuat menggunakan program Phylogeny.fr. Phylogeny.fr yang

dapat diakses secara online pada laman http://www.phylogeny.fr/. Langkah yang

pertama yaitu buka file hasil dari “RUN BLAST” pada BLAST. Lalu klik bakteri

yang sama sebanyak 4 jendela Description. Klik Download | FASTA (aligned

sequences) | continue. Selanjutnya, cari format fasta bakteri pada

http://www.ncbi.nlm.nih.go | genome | ketik nama bakteri pada kolom search |

enter | klik bakteri | FASTA (Ketentuan: 3 bakteri yang mempunyai genus yang

sama dengan bakteri hasil BLAST tetapi spesiesnya berbeda, kemudian 2 bakteri

yang mempunyai genus yang berbeda dengan bakteri hasil BLAST tetapi

spesiesnya sama dan 1 bakteri yang paling berbeda baik genus maupun spesies.

Jadikan satu file dalam fasta BLAST sebelumnya). Buka laman

www.phylogeny.fr. Ditekan one Click| buka file Fasta dari BLAST. tekan submit

dan tunggu hingga hasil keluar dan diperoleh pohon filogenik bakteri. Skema

identifikasi molekuler teknik 16S rRNA dapat dilihat pada Lampiran 5.

3.3.2.4 Pewarnaan Gram (Cappucino & Sherman, 2011)

34

Langkah pertama yang dilakukan adalah gelas objek dibersihkan dari

lemak dengan alkohol 70% dan diberi label. Akuades diteteskan pada

permukaan gelas objek. Kemudian isolat bakteri diambil dengan jarum ose steril,

kemudian isolat dicampur dengan akuades dan diulas merata pada permukaan

gelas objek. Selanjutnya dilakukan fiksasi panas dengan cara melewatkan

preparat di atas api. Sediaan mikroskopik yang sudah kering ditetesi dengan

kristal violet secara merata dan didiamkan selama satu menit. Kemudian larutan

lugol diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan maksimal 30 detik.

Selanjutnya preparat di cuci dengan akuades dan dikeringkan. Kemudian larutan

safranin diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan selama dua

menit. Selanjutnya preparat dicuci kembali dengan akuades dan dikeringkan.

Bentuk sel diamati menggunakan mikroskop. Isolat bakteri yang termasuk Gram

(+) ditunjukkkan dengan sel bakteri berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram (-)

sel bakteri berwarna merah. Skema konfirmasi pewarnaan gram dan morfologi

bakteri dapat dilihat pada Lampiran 6.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Isolasi Bakteri dari Bagian Mangrove

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh 4 isolat

bakteri endofit yang diisolasi dari akar dari mangrove Pidada Putih (Sonneratia

alba). Masing-masing isolat diberi kode A1, A2, A3 dan A4 untuk

membedakannya. Hasil isolat bakteri endofit akar Pidada Putih (Sonneratia alba)

yang berhasil ditumbuhkan pada media luria-bertani agar dapat dilihat pada

Gambar 8.

Gambar 8. Hasil Isolat Bakteri Endofit Akar Mangrove Pidada Putih

Selanjutnya, dilakukan pengamatan morfologi terhadap koloni bakteri

yang didapatkan. Pengamatan morfologi makroskopik koloni bakteri endofit ini

dilakukan dengan mengamati karakteristik koloni (pengamatan pada plate agar)

berupa bentuk, elevasi, tepi dan warna. Hasil pengamatan morfologi koloni

bakteri endofit dicantumkan pada Tabel 4.

36

Tabel 4. Karakteristik Morfologi Koloni Bakteri Endofit Mangrove

Isolat Morfologi Koloni

Bentuk Elevasi Tepi Warna

A1 irregular timbul Bergelombang Putih Susu A2 bulat datar Bergelombang Putih Susu A3 bulat timbul Halus Putih Kekuningan A4 irregular datar Bergelombang Putih Kekuningan

Bakteri dikatakan sebagai bakteri endofit jika warna pada permukaan

koloni putih kekuningan atau kental seperti susu. Selain itu bakteri endofit

dicirikan dengan bentuk sel individu yang batang, serta bentuk koloni yang bulat,

oval atau tidak beraturan (Pelczar, 1986). Selanjutnya, ke 4 isolat bakteri endofit

dimurnikan dengan menggunakan metode streak plate tiga kuadran untuk

mendapatkan koloni tunggal yang terpisah. Teknik streak plate menurut Winarni

(1997), memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan.

Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum

digoreskan ke permukaan media dalam cawan petri dengan jarum ose. Di antara

garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat

tumbuh menjadi koloni. Kemudian isolat yang sudah dimurnikan disimpan pada

agar miring dan disimpan dalam suhu 4ºC sebagai penyimpanan stok.

Hasil pemurnian bakteri dengan metode streak plate tiga kuadran dapat

dilihat pada Gambar 9 dan hasil isolat bakteri pada agar miring dapat dilihat pada

Gambar 10.

Gambar 9. Hasil Pemurnian dengan Metode Streak Plate 3 Kuadran

37

Gambar 10. Hasil Isolasi pada Agar Miring

4.2 Hasil Skrining Bakteri Penghasil Enzim Gelatinase

Pengujian ini bertujuan untuk memperoleh isolat bakteri penghasil enzim

gelatinase. Sebanyak 4 isolat bakteri yang berhasil diisolasi dari endofit

mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba) diinokulasikan pada media nutrien

gelatin dalam tabung reaksi dan diinkubasi selama 3 hari. Jika media gelatin

yang telah diinokulasikan mencair pada suhu ruang, dan tidak bisa kembali

membeku saat didinginkan selama 30 menit di dalam lemari es maka kultur

murni tersebut positif menghasilkan enzim gelatinase. Gambar hasil uji

gelatinase dapat dilihat pada Gambar 11 dan hasil analisis uji gelatinase dapat

dilihat pada Tabel 5.

38

Gambar 11. Hasil Uji Gelatinase

Tabel 5. Hasil Analisis Uji Gelatinase

No Kode Isolat Hasil Kedalaman Cairan (cm)

1 2 3 4

A1 A2 A3 A4

+ + + +

4,84 3,57 4,23 5,31

Keterangan:

(+) Media gelatin cair setelah dimasukkan lemari es 30 menit

(-) Media gelatin padat setelah dimasukkan lemari es 30 menit

Media gelatin yang telah diinokulasikan kultur murni diinkubasi selama 3

hari pada suhu ruang, lalu dimasukkan lemari es selama 30 menit. Setelah itu

dilakukan pengecekan kecairan media yaitu dengan memiringkan tabung dengan

sudut 45̊ dan media yang cair diukur tingkat kedalaman cairannya. Hasil uji

gelatinase ke 4 isolat tersebut menunjukkan hasil positif karena media gelatin

tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit, hal ini sesuai

dengan pendapat Cappucino dan Sherman (1983), bahwa uji positif ditandai

dengan medium gelatin tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari es selama

30 menit. Enzim gelatinase akan menghidrolisis gelatin menjadi asam-asam

amino yang dapat digunakan sebagai nutrien oleh bakteri sehingga media gelatin

39

menjadi cair (Harley dan Prescott, 2002). Kemampuan bakteri dalam mencerna

gelatin menurut Cappuccino dan Sherman (2002), merupakan salah satu

karakter yang penting untuk diamati karena pola pencairan gelatin oleh bakteri

berbeda-beda. Berdasarkan pengamatan, isolat yang memiliki pencairan media

gelatin tertinggi yaitu bakteri dengan kode isolat A2. Selanjutnya, isolat A2

diambil sebagai sampel untuk diidentifikasi molekuler karena mempunyai

aktivitas proteolitik tertinggi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Salle (1967),

bahwa medium gelatin yang dihidrolisis oleh gelatinase akan kehilangan

solidifikasi. Semakin cair medium, aktivitas proteolitik akan semakin tinggi.

4.3 Hasil Identifikasi Molekuler 16S rRNA

4.3.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan metode kit isolasi DNA (Wizard Genomic DNA

Purification Kit from Promega). Hasil isolasi DNA isolat bakteri A2 yang diisolasi

dari akar mangrove Pidada Putih dapat dilihat pada Gambar 12.

40

Gambar 12. Hasil Isolasi DNA Isolat Bakteri A2

(M: DNA Marker; S: DNA Isolat Bakteri)

Berdasarkan Gambar 12, pita DNA isolat bakteri terseparasi diatas

wilayah 10000 bp. Hal ini menunjukkan bahwa terdeteksi adanya molekul dengan

ukuran lebih dari 10000 bp. Ukuran pita yang jelas dan tebal mengindikasikan

bahwa konsentrasi molekul yang terseparasi pada wilayah ini tinggi. Tertahannya

laju migrasi pada daerah 10000 bp mengindikasikan bahwa molekul tersebut

adalah molekul DNA kromosom bakteri, karena berdasarkan penelitian

Demerdash (2012), kromosom bakteri memiliki ukuran lebih dari 10000 bp, yakni

21000 bp-23000 bp. Faktor lain selain ukuran molekul yang menyebabkan DNA

kromosom tertahan diatas 10000 bp dan tidak jauh dari sumur gel adalah karena

konformasi DNA kromosom bakteri. DNA kromosom bakteri memiliki konformasi

sirkular yang menyebabkan molekul DNA susah melewati pori dalam agarosa.

41

Akibat konformasi tersebut, kromosom DNA memiliki laju migrasi yang rendah

dan tertahan di daerah diatas 10000 bp (Nuroniyah dan Putra, 2012).

4.3.2 Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri dilakukan

dengan mesin UV spektrofotometer. Tingkat kemurnian DNA menurut Muladno,

(2002), dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai 260 nm dan

280 nm pada sampel DNA. Nilai 260 merupakan nilai maksimal DNA dapat

menyerap cahaya. Nilai absorbansi pada panjang gelombang (A260) dapat

digunakan untuk memperkirakan konsentrasi DNA juga. Sedangkan nilai 280

merupakan nilai maksimal residu tirosin dapat menyerap cahaya. Nilai

absorbansi pada panjang gelombang (A280) dapat digunakan untuk indikasi

kontaminasi protein.Hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA dapat

dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Type Abs 260

Abs 280

260/280

Dsdna 13,14 17.46 1,75

Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm

dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA.Hasil dari pengukuran

kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri A2 pada perbandingan 280/260

mendekati 1,8 yaitu 1,75. Hal ini menandakan bahwa hasil isolasi DNA memiliki

tingkat kemurnian yang baik, karena menurut Clark dan Christoper (2001), DNA

murni yang bebas kontaminasi protein akan mempunyai nilai ratio λ 260/280

mendekati 1,8.

42

4.3.3 Hasil Amplifikasi Gen

Hasil dari amplifikasi gen dengan menggunakan elektroforesis gel

agarosa dapat dilihat pada Gambar 13.

Gambar 13. Hasil Elektroforesis Gel Agarosa

Hasil elektroforesis yang diperlihatkan pada Gambar 13 menunjukkan

proses PCR berhasil dilakukan dengan diperolehnya pita tunggal dengan ukuran

±1400 bp. Kondisi PCR yang tepat akan menyebabkan teramplifikasinya gen 16S

rRNA dengan baik sehingga diperoleh pita yang tunggal dan bahkan terdeteksi

pada gel elektroforesis. Hal ini sesuai dengan pernyataan Khosravinia et

al.(2007), DNA berhasil diisolasi dengan baik apabila tidak ada pita-pita lainnya

yang tampak pada gambar pada sampel. Elektroforesis DNA yang menghasilkan

pita tunggal pada sampel menunjukkan bahwa DNA mempunyai kualitas yang

baik. DNA yang dihasilkan murni tidak bercampur dengan RNA.

43

4.3.4 Pengurutan dan Pembacaan Sekuen DNA

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang digunakan

untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik secara cepat dalam kondisi in vitro

(Bartlett, 2003). Untuk amplikasi 16S rRNA bakteri gelatinolitik isolat, digunakan

pasangan primer 27F dan 1492R dengan urutan basa nukleotida sebagai berikut:

Primer forward 27F : 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ Primer reverse 1492R :

5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’.

Pembacaan sekuens DNA menjadi alat penting dan utama dalam biologi

molekular karena dapat mengetahui komposisi nukleotida dan asam amino suatu

gen, juga menganalisis kekerabatan dan jalur evolusinya (Albert et al., 1994).

Pembacaan sekuan ini dilakukan menggunakan software sequence scanner.

Hasil pembacaan ini berupa grafik menggulung sampai ujung. Hasil dari

pembacaan ini menunjukkan kualitas puncak-puncak yang cukup baik dan dapat

dibaca dengan jelas meski terdapat beberapa pemisahaan yang kurang jelas dan

bertumpuk. Hasil dari sekeunsing dapat dilihat pada Tabel 7.

44

Tabel 7.Pengurutan Sekuen Gen 16S rRNA

Sekuen 16S rRNA

>_F

GATCGGCCACACTGGGACTGACCTCGGCCCAGACTCCTACGGGAATATTGGACAAT

GAATCTTCCACTGAGCCAGAAATGCTGATGGAGCAACGACGGTCTTCTGATTAAGGT

TTTCTTTTCGTTGAAATCTGTTGTAAGGGAATAACACCTTGCTGATTTACTGGTTGTA

CCTTGACGGTACCTTATTAAAAACCCGCCGCTAACTACGTGCCTACAACCGGGCAGA

TCCTTAAGTGGAATTACTGGTCCGAAATTATTGGGCGTAGAGTCCGCGAATGGGATC

CTTTAACCCTGATGTCAAACCCCACGGCTCATCCGTGAATGGTCATTGAAAACTGGG

GGAATTGAGTGGAAATTACGAGAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGTTTAAATGCGAACA

GATTTGGAGGAACACCA

>_R

GCCTTAACCATCTTGGCACGTGGCTCTGAGGTTACCATCACCTACTTCTGGTGTTAC

CAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCG

GCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGACT

GCGATCCGAACTGAGAACGACTTTATGGGATTAGCTCCATCTCGCGAGTTGGCAAC

CGTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA

CTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCC

ACCTTAATGAGGGGAACTAAAATGACGGGGTGCGCTCGCTGCGCGACTTATCCCCA

CATCTCACGACACGAGCTGAGAACAACCATGCGCCACCTGTGAGTCATACCCCCCA

AAGGGAAACTACATTCCCTGGAAGGTCCACGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCT

TCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATT

CCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGACTGCTTAATGCGTTAGC

TGCGCCACTAAGGGGTGGAGGCCCCCTAACACTTATCAATCATCGTTAACGGCGGG

AATACCAGGGATCTAACCCGGTTGCTCCCACGCTTTGCGCCCAGTGTCAGTTAAGA

CCAGAGGTCGCCTTCGCACTGGTGTTCCTCCAATCTCTACGCATTTCCCGCTACAAT

GAAATCCACTTCCTCTTCTGACTCAAGTCGCCAGTTTCGATGACCTCCAGGTTGAGC

CGGGGCTTTCACATCAACTTAAGGACCCCTGCCGCGCTTACGCCAATATTCCAGACA

CGCTGCCCCTACGTATACCGCGGCTGCTGCACGAATTAGCCGGGCTTTTAGTAGGT

ACGTCAAGCACAACGATTACACTGTGCTGTTCTCCCTACAAAGAGTTTACAACCGAA

ACTTCTTCACCCGCGCATGCTGATCAGCTTCGCCATGGGAAAATCCAATGCGGCTC

CGAAGAATCTGACCGGTCCATTCCAGGGGGCGACACCTTCAAGCGGTACGAACTTC

TTGGGAGCTTACCTCCAATATCAATGGCCCGGGCATCTAATGGAGGCCAAATCCTCT

GTTTCCTTGAATAAAATTTATGTTTTTCCAGTTCCCAATTCCAATAATG

4.3.5 Penggabungan Hasil Sequencing Forward dan Reverse

Langkah selanjutnya adalah mengolah basa-basa tersebut menjadi fasta

format assembly. Dari format fasta assembly diperoleh 1.167 sekuen, kemudian

sekuen tersebut diunggah melalui Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

untuk mengetahui homolog atau kemiripannya dengan sekuen yang sudah

terdapat pada database GenBank. Hasil elektroferogram isolat A2 sekuen

forward dapat dilihat pada Lampiran 7 dan hasil elektroferogram isolat A2 sekuen

45

reverse dapat dilihat pada Lampiran 8. Hasil Reverse Complement dan Format

Fasta Assembly disajikan pada Tabel 8 berikut ini.

Tabel 8. Hasil Reverse Complement dan Format Fasta Assembly

Reverse Complement

>_RC CATTATTGGAATTGGGAACTGGAAAAACATAAATTTTATTCAAGGAAACAGAGGATTTGGCCTCCATTAGATGCCCGGGCCATTGATATTGGAGGTAAGCTCCCAAGAAGTTCGTACCGCTTGAAGGTGTCGCCCCCTGGAATGGACCGGTCAGATTCTTCGGAGCCGCATTGGATTTTCCCATGGCGAAGCTGATCAGCATGCGCGGGTGAAGAAGTTTCGGTTGTAAACTCTTTGTAGGGAGAACAGCACAGTGTAATCGTTGTGCTTGACGTACCTACTAAAAGCCCGGCTAATTCGTGCAGCAGCCGCGGTATACGTAGGGGCAGCGTGTCTGGAATATTGGCGTAAGCGCGGCAGGGGTCCTTAAGTTGATGTGAAAGCCCCGGCTCAACCTGGAGGTCATCGAAACTGGCGACTTGAGTCAGAAGAGGAAGTGGATTTCATTGTAGCGGGAAATGCGTAGAGATTGGAGGAACACCAGTGCGAAGGCGACCTCTGGTCTTAACTGACACTGGGCGCAAAGCGTGGGAGCAACCGGGTTAGATCCCTGGTATTCCCGCCGTTAACGATGATTGATAAGTGTTAGGGGGCCTCCACCCCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCAGTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTGGACCTTCCAGGGAATGTAGTTTCCCTTTGGGGGGTATGACTCACAGGTGGCGCATGGTTGTTCTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTGGGGATAAGTCGCGCAGCGAGCGCACCCCGTCATTTTAGTTCCCCTCATTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGATGGAGCTAATCCCATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGTAACACCAGAAGTAGGTGATGGTAACCTCAGAGCCACGTGCCAAGATGGTTAAGGC Format Fasta Assembly

>_FFA GATCGGCCACACTGGGACTGACCTCGGCCCAGACTCCTACGGGAATATTGGACAATGAATCTTCCACTGAGCCAGAAATGCTGATGGAGCAACGACGGTCTTCTGATTAAGGTTTTCTTTTCGTTGAAATCTGTTGTAAGGGAATAACACCTTGCTGATTTACTGGTTGTACCTTGACGGTACCTTATTAAAAACCCGCCGCTAACTACGTGCCTACAACCGGGCAGATCCTTAAGTGGAATTACTGGTCCGAAATTATTGGGCGTAGAGTCCGCGAATGGGATCCTTTAACCCTGATGTCAAACCCCACGGCTCATCCGTGAATGGTCATTGAAAACTGGGGGAATTGAGTGGAAATTACGAGAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGTTTAAATGCGAACAGATTTGGAGGAACACCAGTGCGAAGGCGACCTCTGGTCTTAACTGACACTGGGCGCAAAGCGTGGGAGCAACCGGGTTAGATCCCTGGTATTCCCGCCGTTAACGATGATTGATAAGTGTTAGGGGGCCTCCACCCCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCAGTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTGGACCTTCCAGGGAATGTAGTTTCCCTTTGGGGGGTATGACTCACAGGTGGCGCATGGTTGTTCTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTGGGGATAAGTCGCGCAGCGAGCGCACCCCGTCATTTTAGTTCCCCTCATTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGATGGAGCTAATCCCATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGTAACACCAGAAGTAGGTGATGGTAACCTCAGAGCCACGTGCCAAGATGGTTAAGGC

46

4.3.6 BLAST

Hasil sekuen gen penyandi 16S rRNA dari isolat A2 dilacak homologinya

terhadap sekuen 16S rRNA milik bakteri lainnya yang ada di dalam GenBank

melalui program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dengan alamat

situs http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Sekuen-sekuen 16S rRNA yang

didapat dari program BLAST disimpan dalam format FASTA. Berdasarkan hasil

konfirmasi BLAST isolat bakteri A2 menunjukkan identity sebesar 87%. Hal

tersebut menunjukkan bahwa isolat bakteri memiliki kemiripan dengan

Lysinibacillus fusiformis dan terdapat 13% yang dapat dikategorikan sebagai

strain yang berbeda, sehingga dapat diberikan identitas yang berbeda yaitu

Lysinibacillus fusiformis UB-U. Bakteri bisa dikatakan spesies baru apabila

memiliki kemiripan homologi basa nukleotida <70%.

Hal ini dikemukakan oleh Wayne (1987), dimana suatu spesies dapat

dikatakan memiliki hubungan dengan salah satu kelompok spesies yang telah

ada apabila mempunyai nilai homologi gen lebih besar dari 70% bila

dibandingkan dengan seluruh gen yang mengalami hibridisasi DNA-DNA. Nilai

total gen yang mengalami hibidrisasi DNA-DNA merupakan kunci utama dari

penentuan dan pembatasan hubungan kekerabatan spesies baru tersebut

dengan spesies yang telah ada. Semakin tinggi nilai identitasnya maka semakin

menunjukkan kemiripan dengan sekuen acuan Gen Bank. Hasil analisis BLAST

isolat dapat dilihat pada Tabel 9.

47

Tabel 9. Hasil Analisis BLAST Isolat A2

4.4 Filogenik Sekuen DNA

Hasil desain pohon filogenetik bakteri gelatinolitik Lysinibacillus fusiformis

strain UB-U ditampilkan pada Gambar 14.

Gambar 14. Pohon Filogenik bakteri Lysinibacillus fusiformis UB-U

Description Query Cover

E-value

Ident Accession ID

Lysinibacillus fusiformis strain LP01 R08 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus macroides strain SS­86 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus fusiformis strain CW203 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus boronitolerans strain 10a 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mkx­20 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus xylanilyticus strain C17 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mkx­29 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mkx­22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mixed culture J6­13 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp. hb42 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp. hb26 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. SS1.19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mkx­32 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. mkx­14 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Lysinibacillus sp. 313 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

98%

98%

97%

97%

98%

98%

97%

97%

97%

97%

97%

98%

98%

98%

97%

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

87%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

86%

KP419697.1 KX959971.1 KY689044.1 NR_041276.1 KU159208.1 KX832696.1 KU159213.1 KU159209.1 KR029250.1 KF863841.1 KF863826.1 KF863826.1 KU159215.1 KU159207.1 KT034466.1

48

Pada pohon filogenik memperlihatkan dua kelompok utama (Gambar 14).

Pada kelompok pertama dibagi menjadi 2 subcabang dan pada kelompok kedua

tidak terjadi percabangan yang diisi oleh Neisseria sicca 1458b. Lysinibacillus

fusiformis strain UB-U memiliki kekerabatan yang dekat dengan Lysinibacillus

boronitolerans strain DNP-20 nilai bootstrap sebesar 87% pada cabang

filogenetiknya yang artinya bakteri Lysinibacillus fusiformis strain UB-U. Hal ini

sesuai dengan pendapat Mount (2001), yang menyatakan bahwa nilai bootstrap

menunjukan kekerabatan yang dekat apabila memiliki nilai yang tinggi, yaitu lebih

dari 70% atau di atas 70.

4.5 Konfirmasi Pewarnaan Gram dan Morfologi Lysinibacillus fusiformis UB-U

Pewarnaan gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta

untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif (Rostinawati, 2008).

Berdasarkan hasil pewarnaan gram pada Lysinibacillus fusiformis UB-U ketika

diamati di bawah mikroskop menandakan bahwa bakteri tersebut merupakan

gram positif. Bakteri gram positif pada pewarnaan Gram berwarna ungu

disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan

meskipun diberi larutan pemucat aseton alcohol (Lay, 1994). Hasil pewarnaan

bakteri dapat dilihat pada Gambar 15.

Gambar 15. Pewarnaan Gram Lysinibacillus fusiformis UB-U (Perbesaran 1000x)

49

Klasifikasi Lysinibacillus fusiformis menurut Ahmed (2007), sebagai

berikut.

Domain : Bacteria Kingdom : Bacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Bacillales Famili : Bacillaceae Genus : Lysinibacillus Species : Lysinibacillus fusiformis

Lysinibacillus fusiformis merupakan bakteri gram positif yang berbentuk

batang, bersifat aerob obligat dan oksidase positif, dapat menghidrolisis kasein

dan gelatin. Organisme ini tumbuh terbaik di kisaran suhu 17-37 ºC, pada

kisaran pH 6-9,5 dan konsentrasi NaCl 2-7% (David et al., 2009).

5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini adalah terdapat isolat bakteri endofit terbaik

dari akar mangrove Pidada Putih (Sonneratia alba) yang mampu menghasilkan

enzim gelatinase,yaitu isolat bakteri A2 dengan identitas Lysinibacillus fusiformis

UB-U.

5.2 Saran

Saran yang dapat diberikan untuk penelitian selanjutnya adalah dilakukan

penambahan uji kuantitatif aktivitas enzim gelatinase dan untuk identifikasi

molekuler perlu melakukan uji tambahan identifikasi spesies secara biokimia (uji

microbact) agar lebih menguatkan hasil dari uji genotip (identifikasi molekuler).

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. 2007. Proposal of Lysinibacillus bronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. J. Syst Evol Microbiol. 57:1117–1125.

Aminullah, Rachmadiarti, F., Trimulyono, G. 2015. Isolasi dan Karakterisasi

Rhizobakteri pada Akar Rhizopora mucronata yang Terpapar Logam Berat Timbal (Pb). J. LenteraBio. 4 (1): 43-49.

Amrani, M, E., Debbab, A., Aly, A, H., Wray, V.,Dobretsov, S., Muller., Lin, Lai,

W, D., Proksch, P. Farinomalein derivatives from an unidentified endophytic fungus isolated from the mangrove plant Avicennia marina. 2012.Tetrahedron letter. 53 (49): 6721-6724.

Aris, M. 2011. Identifikasi Patogenitas Bakteri dan Pemanfaatan Gen 16S rRNa untuk Deteksi Penyakit Iceice pada Budidaya Rumput Laut. [Skripsi]. IPB. Bogor.

Balan, S. S., Nethaji, R., Sankar, S., Jayalakshmi, S. 2012. Production of

gelatinase enzyme from Bacillus spp isolated from the sediment sample of Porto Novo Coastal sites. Asian Pac J Trop Biomed. 1811-1816.

Bartlett, J.M., Stirling, D. 2003.A short history of the polymerase chain reaction.Methods Mol Biol. (226): 3-6.

Bengen, D.G. 2004. Ekosistem dan sumber daya alam pesisir dan laut sert prinsip pengelolaannya. Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Lautan. IPB. Bogor.

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. 2007. Biochemistry. Sixth Edition. W.H. Freeman and Company. New York.

Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitcell, L. G. 1998. Biologi Jilid I. Erlangga.

Jakarta. 438 hlm.

Cappuccino, J. G. & N. Sherman. 2002. Microbiology a Laboratory Manual. 6th Edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.491 hlm. . . 2005. Microbiology A Laboratory Manual. California : The Benjamin Comings Publishing Compani. Inc.

Champbell., Neil, A., Jane, B., dan Lawrence, G, M. 2002. Biologi Edisi V Jilid 1. Erlangga. Jakarta.

Clay, K. Fungal endophytes of grasses: a devensive mutualism between plants

and fungi.1988. Ecology. 69 (1): 10-16.

52

David, H., Paul,V.,dan Whitman, W.B. The Firmicutes. 2nd Edition. 2009. Dordrecht. Springer

Firdaus dan Sinda, L. 2003. Peranan kulit kayu buli Sonneratia sp, dalam fermentasi nira aren menjadi minuman beralkohol. Marina Chimica Akta. 5(1): 24-28

Hallaman, J. dan Berg, G. 2006. Spectrum and population dynamics of bacterial root endophytes. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag. Germany. J. Soil. Biol. 9: 15-31

Hallmann, J. Quadt-Hallmann, A., Mahaffee, WF. dan Kloepper, J. W. 1997

Bacterial Endophytes In Agricultural Crops. Can”. J. Microbiol. 43: 895-914.

Hastuti D, Sumpe I. 2007. Pengenalan dan proses pembuatan gelatin. Jurnal Ilmu Pertanian. 3(1): 39-46.

Herdiastuti dan Nuniek. 2009. Chitinase and Chitinolitic Microorganism: Isolation, Characterization and Potential, Indo. J. of Chem.9(1), 37- 47.

Hidayah, N dan Yulianti, T. 2008. Peranan Bakteri Endofit dalam Reaksi Ketahanan Tanaman Terhadap Patogen. Jurnal Pengendalian Hayati. 1(2): 1979-2190.

Huber, H., Hohn, M.J., Rachel, R., Fuchs, T., Wimmer, V.C., dan Stetter, K.O. 2002, A new phylum of Archaea represented by a nanosized hyperthermophilic symbiont.Nature.417 (6884): 63–7.

Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun S., Suhadi D. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. UGM. Yogyakarta.

Khosravinia, H., H. N. Narasimha Murthy, D. T. Parasad, and N. Pirany. 2007. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African J. of Biotech. 6 (4): 481-486.

Krych,V . K., Johnsonj,. L. dan Youstena, A. 1980. Deoxyribonucleic acid homologies among strains of Bacillus sphaericus. Int J Syst Evol Microbiol. (30): 476-484.

Lay, B.W. 1994. AnalisisMikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta. 168 hlm.

Madigan, M.T. 1997. Biology of Microorganism 8th Ed. New Jersey (US): Prentice Hall. 986 hlm.

Manilal, A., T. Tsalla, Z. Zerdo, G. Ameya, B. Merdekios and S.E. Jhon. 2016.

Evaluating the antibacterial and anticandidal potency of mangrove, Avicennia marina.Asian Pac J Trop Dis. 6 (2): 136-140.

Mamoribo, S., Arwam, C.Y.H. dan Yusuf, A. 2003. Pemanfaatan vegetasi mangrove oleh masyarakat kampung rayori di distrik supiori selatan Kabupaten Biak Numfor. Beccariana, 5(1): 43−51.

53

Melliawati R, Djohan AC, Yopi. 2015. Seleksi bakteri asam laktat sebagai penghasil enzim protease. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon. 1(2): 184-188

Milon, M. A., Muhit, M. A., Goshwami, D., Masud, M. M., Begum, B.Antioxidant, Cytotoxic and Antimicrobial Activity of Sonneratia AlbaBark. 2012. Int J Pharm Sci Res.3(7): 2233-2237.

Mount, D. W. 2001. Phylogenetic prediction. Bioinformatic, Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 247-248.

Murray, R.G.E., Holt, John G., 2001, The history of bergey’s manual, In Boone,

Castenholz and Garrity (Editors), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology2nd Edition, The archaea and the deeply branching and phototrophic bacteria. Springer. New York.1: 1-13

Nasir, M. 2017.Kemandirian Produk Enzim Indonesia. Kemenristek Dikti. https://www.ristekdikti.go.id/kemandirian-produk-enzim-indonesia/. Diakses tanggal 16 Oktober 2017.

Noor, Y.R. M. Khazali, dan I N.N. Suryadiputra. 2006. Panduan pengenalan Mangrove di Indonesia. Bogor. 227 hlm.

Nuroniyah, T., dan Surya R. P. 2012. Identifikasi Spesies Isolat Bakteri S1 dengan Metode Analisis Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA. Jurnal Teknik

Pomits. 1: 1-6.

Pelczar, M.J. and ChanE. C. S.. 1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.

. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Terjemahan Jilid 1. Unversitas Indonesia Press. Jakarta.

. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta. UI Press. Salim, E. 2002. Green company. Jakarta.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI Press. Jakarta. 472 hlm.

Priest, F. G., Goodfellow, M. Todd, C. 1988. A numerical classification of the genus Bacillus. J Gen Microbiol. (134): 1847–1882.

Puspayanti, N. M., Tellu, H.A.T., dan Suleman, S.M. 2013. Jenis-jenis tumbuhan mangrove di Desa Lebo Kecamatan Parigi. e-Jipbiol. 1: 1-9.

Putra, H. 2007. Aktivitas Anti Bakteri Metabolit Jamur Endofit dari Alyxia reinwardtii BI. dengan Metode Bioautografi. [Skripsi]. Unair. Surabaya.

Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian.2(3): 113-126.

54

Rahayu, S, Tanuwijaya, F., Suhartono, M.T., J.K. Hwang, dan Pyun, J.R. 2004. Study of Thermostable Chitinase Enzymes from Indonesia Bacillus K29-14. Microbiol and Biotech. 4: 647-652.

Resti, Z., Trimurti, H., Prima P.D., Nasrum. 2013. Skrining dan Identifikasi Isolat Bakteri Endofit untuk Mengendalikan Penyakit Hawar Daun Bakteri Pada Bawang Merah.J. HPT Tropika.13 (2): 167-178.

Rostinawati, T. 2008. Skrining dan Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim Kitinase dari Air Laut di Perairan Pantai Pondok Bali. Universitas Padjadjaran. Bandung.

Roy, K. S. Isolation and characterization of bacteria from waste water sample and

its PCR based identification through 16SrRNA. 2013. Disertasi. Uttar Pradesh.

Sai-Ut, S., Benjakul, S. Sumpavapol, P. 2013. Gelatinolytic Enzymes from Bacillus amyloliquefaciens Isolated from Fish Docks: Characteristics and Hydrolytic Activity. Food Sci. Biotechnol. 22(4): 1015-1021.

Sale, A. J. 1967. Fundamental principles of bacteorology. Edisi V. MerGraw Hill Book Company, Inc. New York. 812 hlm

Sambrook J, Fritsch E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Schulz, B. J. E. Boyle, C. J. C. dan Sieber, T. N. 2006. Microbial Root

Endophytes. Soil Biology. Springer. Jerman. Sharkey, D.J., Scalice, E.R., Christy, K.G., Atwood, S.M., Daiss, J.L. 1994.

Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for the Polymerase Chain Reaction, BioTechnology. 12(5): 506–509.

Simarmata, R., Lekatompessy.,S., dan Sukiman, H. 2007. Isolasi Mikroba Endofitik Dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura Procumbens) dan Analisis Potensinya Sebagai Antimikroba. Berk Penel Hayati. 13: 85-90.

Stanbury, P. F. dan Whitaker. 1984. Principles of Fermentation Technology. Pergamon Press, Ltd., Oxford.

Strobel, G.A., and B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiol. and Mol. Biology. 67(4):491-502.

Suhartono M, T. 2000. Eksplorasi Protease Bakteri Asal Indonesia untuk Aplikasi

Industri dan Riset Bioteknologi. Prosiding Seminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi II. Hlm 125-133.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. IPB. Bogor.

Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hidrokarbonoklastik Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari

55

Strain Terpilih. Laporan Penelitian Dosen Muda. Universitas Airlangga. Surabaya.

Tjitrosoepomo, Gembong. 2009. Taksonomi Tumbuhan. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.

Wang, W., X.Liu, Y.Xie, H. Zhang, W.Yu, Y.Xiong, W.Xie and X.Ma. 2006. Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation. Journal of Materials Chemistry. 16: 3252 – 3267

Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., and Lane, D.J., 1991, 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.Journal of Bacteriology, 173 (2): 697-703

Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia, Protein, Enzim dan Asam Nukleat. ITB. Bandung.

Yuwono, T., 2007, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi.

Jakarta. 246 hlm.