IDENTIFIKASI MOLEKULER HAMA LALAT BUAH PENDATANG BARU BERDASARAKAN GEN MITOKONDRIAL CYTOCHROME

C OXIDASE SUBUNIT I (COI) DI BALI

I Putu Sudiarta, SP., M.Si, Ph.D (0007117904)

Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, SP., M.Agr. (0015016802)

Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P.( 0009106204)

Hibah Unggulan Udayana 2016

Latar Belakang

• hama tanaman hortikultura isu nasional & pembatas perdagangan (trade barrier)

• Lalat buah dengan tingkat invasif yang tinggi, kemampuan penyebaran yang efisien & kemampuan beradaptasi pada lingkungan tropis dan subtropik

• Identifikasi secara morfologi telah banyak dilakukan

• Namun ciri morfologinya sangat mirip? Keakuratan diragukan?

• Maka perlu dilakukan identifikasi secara molekuler

Identifikasi molekuler

Struktur Gen Internal Transcribed Spacer region ITS1 pada DNA inti

Sumber: Pathogenic Fungi Database http://www.pfdb.net/

DNA ribosomal (rDNA) adalah daerah penyandi genom untuk

komponen RNA ribosom. Pada eukariot deret rDNA terletak pada

nukleus/inti dan mitokondria. Daerah rDNA dipisahkan antara satu

dengan yang lainnya oleh suatu pembatas yang disebut spacer

Mitocondria Citochrome Oxidase I (MT-CO1)

• Gen Cytochrome c oxidase

subunit I (MT-CO1)

merupakan reprensentatif dari

semua gen penyandi protein

DNA mitokondria.

Tujuan penelitian

• Mengetahui karakteristik morfologi lalat buah

pendatang baru yang ditemukan di Pulau Bali.

• Mengetahui karakteristik molekuler lalat buah

pendatang baru dengan menggunakan Gen ITS1

dan MT-CO1.

• Mengetahui keragaman genetik lalat buah

pendatang baru yang ditemukan di Pulau Bali

berdasarkan gen ITS1 dan MT-CO1.

• Mengetahui hasil analisis filogenetik lalat buah

pendatang baru yang ditemukan di pulau Bali

berdasarkan ITS1 dan MT-CO1.

Metode Penelitian

• Pemasangan

perangkap

• Identifikasi

morfologi

• Identifikasi

molekuler

• Similarity/

alignment

• Pohon filogeni

Identifikasi morfologi

• bentuk spot pada muka, warna mesonotum, ada

tidaknya pita kuning di kedua sisi lateral dan

tengah toraks, warna, pola dan jumlah rambut

pada skutelum, pola pada pembuluh sayap (costa

band), bentuk dan pola abdomen, serta warna dan

spot pada tungkai

• Sebagai pustaka acuan digunakan buku yang

berjudul ”Fruit Flies of Indonesia : Their

Identification, Pest Status and Pest Menegement”

yang dikeluarkan oleh Griffith University, Brisbane,

Australia dan Kementerian Pertanian RI tahun

2008

Identifikasi Molekuler

Ekstraksi DNA dan PCR

• Ekstraksi DNA dari sampel lalat buah menggunakan QiagenDNeasy® (Qiagen, Hilden, Germany) Blood and Tissue kits.

• PCR menggunakan primer yang didesain dari Gen Mitocondrial cytochrome C Oxidase I (COI) Fruit Fly

• Gen ITS1 yaitu baITS1f 5’ GGA AGG ATC ATT ATT GTG TTC C 3’ dan baITS1r 5’ ATG AGC CGA GTG ATC CAC C 3’ (Plant Health Australia, 2011). 790 – 820 bp

• Primer MT-CO1 Fruit Fly MT-CO1-F (FFMT-CO1-F)5’-GGA GCA TTA ATY GGR GAY G-3’ dan HCO 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA ATC A-3’ (Plant Health Australia, 2011), 658bp

• Elektroforesis dan Sekuensing

Produk PCR 5 μl (ditambah 2 μl loading

dye) dielektroforesis dalam gel agarose

2%. Elektroforesis dilakukan selama 30

menit pada 100 Volt. DNA yang telah

dielektroforesis kemudian divisualisasi

dengan UV transluminator. Sekuensing

dilakukan di Universitas Islam Negeri

Sunan Kalijaga Yogyakarta untuk dilakukan

sekuen nukleotida.

– Analisis Sekuen

Hasil sekuen dianalisis untuk membuat allignment kemudian digunakan untuk mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen B. bryoniae yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan Program Basic Local Alignment Tool (BLAST) (NCBI 2014).

– Tingkat similaritas sekuen dari Bali, papua dan maluku dianalisis dengan menggunakan program ClustalW

– Analisis Filogenetik

Data sekuen nukleotida kemudian dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5.05).

Hasil dan pembahasan

B. cucurbitae B. calumniata B. carambolae B. papayae

B. umbrosa B. albistrigata B. tau B. caudata

Identifikasi morfologi

• new exotic species of fruit fly in Bali B.

bryoniae

caput: spot pada wajah

berbentuk bulat tak beraturan

skutum berwarna hitam,

Scutellum berwarna kuning

Sayap dengan costal band

yang sangat tebal confluent

Microtrichia hanya menutupi setengah

bagian sudut second costal cell

(a,b) Caput : spot pada wajah

berbentuk oval agak besar,

(c,d) Skutum hitam kecuali

bagian posterior dan sekitar

prescutelar setae berwana

coklat kemerahan, pada

skutum terdapat strip kuning

pada kedua sisi lateral dan

pada bagian tengah tidak ada

strip kuning, (e,f) costal band

overlapping R2+3 dan

dengan jelas melebar di

bagian apeks sayap, cubital

streak yang meruncing (g,h)

Abdomen terga III – V

dengan band yang melintang

dan melebar dibagian lateral,

ceromae berwarna coklat-

orange terang.

Identifikasi molekuler

• Hasil PCR ITS-1

820 bp

M BbryITS BbryITS

1000bp

500 bp

Pohon filogeni

B. carambolae Malaysia

B. fuscitibia Indonesia

B. endiandra Australia

B. tryoni

B. invadens

BbryBaliITS

Ceratitis capitata

78

100

100

52

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

Pohon Filogeni B. bryoniae asal Bali dibandingkan dengan beberapa Bactrocera yang berasal

dari negara lain berdasarkan gen ITS1. Nomor aksesi B. endiandra Australia AF297564, B.

tryoni AF121159, B. carambolae Malaysia AF297560, B. fuscitibia Indonesia AF297565, B.

invadens KM453398 dan Ceratitis capitata ALD83767 sebagai pembanding luar spesies.

Pohon filogeni dikonstruksi menggunakan perangkat MEGA versi 6.06 (Algoritma UPGMA

dengan 1000 bootstrap method Replications).

Analisis filogenetik B. bryoniae berdasarnya gen ITS1 menunjukkan bahwa B.bryoniae berada

pada kelompok tersendiri berbeda kelompok dengan spesies B. endiandrae Australia, B.

tryoni, B. carambolae, B. fuscitibia, dan B. invadens. B.bryoniae berada pada kelompok yang

berbeda dengan lima spesies Bactrocera tersebut.

• Hasil PCR MT-OC-1

500bp

M K - K + Bryoni Bali

658 bp

Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa sekuen asam nukleat gen

MT-CO1 B. bryoniae Bali menunjukkan homologi (98,4%) dengan sekuen B,

bryoniae yang berasal dari Australia VAITC0073 dan Bbry76 sebesar 95,8%,

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

170 180 190 200

BbryCO1BALI ACTACCTCCT TCCCTTACTC TATTATTAGT GAGAAGTATA

JQ671139 Bbry76 Au ACTACCTCCT TCCCTTACAC TATTATTAGT GAGAAGTATA

JQ420911VAITC0073 Au ACTACCTCCT TCCCTTACAC TATTATTAGT GAGAAGTATA

Clustal Consensus ********** ******** * ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

210 220 230 240

BbryCO1BALI GTAGAAAATG GATCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACGCAC

JQ671139 Bbry76 Au GTAGAAAATG GAGCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACCCAC

JQ420911VAITC0073 Au GTAGAAAATG GAGCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACCCAC

Clustal Consensus ********** ** ******* ********** ****** ***

Perbandingan sekuen asam nukleat gen MT-CO1

spesies B. bryoniae Bali dan Australia.

KF659792 Bactrocera tryoni isolate 5 CHINA

KF659789 Bactrocera tryoni isolate 2 CHINA

JQ692673 Bactrocera kandiensis KENYA

KF659840 Bactrocera wuzhishana isolate 6 CHINA

BbryCOIBALI

JQ420911 Bactrocera bryoniae voucher VAITC0073 AUSTRALIA

JQ671139 Bactrocera bryoniae voucher Bbry76 AUSTRALIA

ALD83767 Ceratitis capitata

100

55

100

97

79

0.0 0.2 0.4 0.6

B. bryoniae asal Bali berada pada

kelompok monofiletik bersama dengan B.

bryoniae dari negara Australia dengan nilai

bootstrap 100

• B. Occipitalis

(berdasarkan

CO-1)

• On going

research

Kesimpulan

• Berdasarkan karakteristik morfologi

dan analisis Gen MT-CO1, B.

bryoniae Bali memiliki similaritas yang

tinggi dengan dua spesies B. bryoniae

asal Australia yaitu dengan JQ420911

VAITC0073 (98,4%) dan JQ671139

Bbry76 (95,8%).