LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Senin, 10 Maret 2015

Kelompok I

Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB

Nama NPM

Popy Sarah Chairunnisa 260110130136

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

I. Tujuan

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak

tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan

(Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi

dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Pemanasan

Pemanasan bakteri tahan asam diperlukan untuk memuaikan dinding sel

bakteri agar zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri.

2. Penetrasi Zat Warna

Penembusan zat warna ke dalam sel bakteri.

3. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan differensial lebih dari satu

pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan

dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks yang

tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam.

4. Impermeabilitas Dinding Sel Bakteri Tahan Asam

Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap perwarnaan dan bahan

kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri

tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut

disebut bakteri tahan asam.

5. Teknik Aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi

bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptik digunakan sepanjang

percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan.

Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.

III. Teori Dasar

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.

Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di

identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut

berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro,

1998).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena

selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk

mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri

sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik

pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam

penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah

”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya

digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah

bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat

basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya

bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu

fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat

warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian

dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat

juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini

dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu

spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan

pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan

pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah

besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan

pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel

terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika

proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam

sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk

filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan

asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, ketika Mycobacteria diberi

warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan

dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan

Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan

asam, yaitu spesies Nicardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa

Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak

berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini

menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari

antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel

mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.

tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat

tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk

tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid,

protein, dan polisakarida (Thomas, 1999).

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang

atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8

minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia.

Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk,

serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri

batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk

kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera

setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh

alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara

umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan

mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi

antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang

berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media

nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan

7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media)

(Jawetz et al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk

menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh

lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan

pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk

patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada

bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil

tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu

yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi,

virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan

atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson,

Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau

ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis

sputum: Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun

pagi. Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu. Collection sputum:

sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam Sputum yang telah diperoleh

dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu. Teknik pewarnaan Ziehl-

Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam

alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu

carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan

fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan

warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk

membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.

Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol

fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam

alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian

dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori- pori dan menghentikan

pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak

tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri

tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri

tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

IV. Alat dan Bahan

Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca obyek

4. Kapas

5. kertas saring

6. Mikroskop majemuk

7. Ose

8. pembakar spirtus

Bahan

1. Suspensi bakteri saprofit.

2. Zat warna karbol fuksin dan biru metilen.

3. Asam alkohol (3% HCL dalam alkohol 95%).

4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.

5. minyak celup.

Gambar Alat

1. Bak Pewarna

2. kaca obyek

3. Kapas

4. Kertas Saring

5. Mikroskop Majemuk

6. Ose

7. Pembakar Spiritus

V. Prosedur

Pertama-tama disediakan alat dan bahan. Diambil kaca obyek yang bersih

dengan menggosok permukaan dengan kapas dan alkohol hingga kesat,

kemudian dibuat olesan dari suspensi bakteri secara aseptis didekat api.

Kemudian ditandai daerah olesan dengan spidol di permukaan bawah preparat.

Olesan bakteri digenangi dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit,

sambil dipanaskan di atas penangas air. Namun tidak terlalu panas, mendidih

atau kering. Setelah itu, zat wama yang berlebih dibuang, lalu dibilas dengan

air suling. Dibilas kembali dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik

atau sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Digenangi

olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, dibuang zat

warna yang berlebih, dan dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan

kertas saring. Diteteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu diperiksa di

bawah mikroskop. Hasil kemudian digambarkan.

VI. Data Pengamatan

VII. Pembahasan

Pada praktikum pewarnaan tahan asam ini, dilakukan teknik pewarnaan

tahan asam untuk bakteri Mycobacterium tuberculosis yang juga merupakan

bakteri gram positif. Bakteri tahan asam memiliki sel berlilin karena mengandung

sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai

dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan

impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan

encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi

dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.

Pewarnaan Mycobacteria apabila diberi warna oleh pewarnaan gram,

maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka

mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa

mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia,

Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium.

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk

filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan

asam, dan merupakan bakteri gram positif. Pada dinding sel mycobacteria, lemak

berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini

menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari

antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel

mycobacteria yang berperan dalam interaksi antara inang dan patogen,

menjadikan Mycobacterium tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam

makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH

optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga

lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida.

Penderita penyakit tuberkulosis dapat dideteksi dengan pengamatan

bakteri tahan asam dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan

Fluorochrom. Dilakukan degan pengambilan sputum (sekret paru-paru atau

ludah). Diambil 3 jenis sputum: Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh

penderita pada saat bangun pagi. Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada

saat itu. Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.

Mikobakteria kaya akan lipid, bahan dari lilin dan fosfatida. Lapisan lilin pada

dinding sel ini menyebabkan bakteri ini tahan terhadap keadaan di luar tubuh induk

semang. Bakteri dapat tahan berbulan-bulan di luar tubuh induk semang, jika

terbungkus eksudat, tinja, dalam cairan atau dalam jaringan organ tubuh yang

membusuk. Dalam sel, lipid secara meluas berikatan dengan protein dan polisakarida.

Muramil dipeptida (dari peptidoglikan) yang diperkaya dengan asam mikolat dapat

menyebabkan nekrosis kaseosa. Lipid pada beberapa perluasan bertanggung jawab

terhadap kecepatan asam, yang terganggu pada integritas dinding sel dan kehadiran

lipid tertentu. Kecepatan asam juga hilang setelah sonikasi sel mikobakteria

Karena bepotensi menularkan penyakit pada praktikan, maka prosedur

pewarnaan tidak dilakukan dan hanya dilakukan pengamatan melalui mikroskop.

Sesuai teori, prosedur dilakukan dengan mengoleskan suspensi bakteri

secara aseptis didekat api. Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewama

karbol fuksin selama 5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Namun

tidak terlalu panas, mendidih atau kering. Pada pemberian warna ini, BTA

bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang

dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Zat fenol inilah yang membantu pemasukan

zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan

adalah untuk melebarkan pori-pori lemak sehingga carbol fuchsin dapat masuk

sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna

pertama tidak mudah dilunturkan.

Setelah itu, zat warna yang berlebih dibuang, lalu dibilas dengan air suling.

Dibilas kembali dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik atau sampai

latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Digenangi olesan dengan

pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, dibuang zat warna yang berlebih,

dan dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. BTA akan

terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan

melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna.

Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan

asam akan berwarna biru. Sehingga apabila terdapat bakteri lain dalam sampel

akan terlihat di mikroskop dengan perbedaan warna.

Hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri tahan asam, namun tidak

adanya bakteri pembanding tidak tahan asam. Hal ini dapat terjadi karena suspensi

bakteri yang digunakan merupakan suspensi tungga yang hanya berisi bakteri

Mycobacterium tuberculosis. Namun pada pengamatan juga warna yang terlihat

adalah hijau kecoklatan yang seharusnya bewarna merah. Hal ini mungkin terjadi

apabila pewarna yang digunakan bukan pewarna karbol fuksin sehingga tidak

memantulkan warna merah seperti warna karbol fuksin.

VIII. Kesimpulan

Dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan

asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-

Neelsen) dapat diamati serta setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi

dalam prosedur tersebut dapat diamati.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons,

New York.

Dwidjoseputro. 2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Jawetz M; Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi Kedokteran edisi 23. Jakarta, Penerbit

Buku Kedokteran ECG.

Lay. 1994. Mikrobiologi Umum. Jakarta: Erlangga.

Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis. Tersedia

online di http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1044719/

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Senin, 10 Maret 2015

Kelompok I

Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB

Nama NPM

Popy Sarah Chairunnisa 260110130136

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

X. Tujuan

Mengamati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan

spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang

terjadi dałam prosedur tersebut.

XI. Prinsip

6. Pewarnaan Spora

Suatu metode pewarnaan deng

7. Zat pewarna

Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya

terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut ya

XII. Teori Dasar

Mikroorganisme yag ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.

Salah satu untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut

juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi

dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Volt, 1989).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena

selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk

mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri

sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik

pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam

penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2001).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah

”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya

digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana

karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna

yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen

kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan

bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan

penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat

warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.

sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri

seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas

bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2001)

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan

diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang

sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam

bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah

bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan

(Dwidjoseputro, 2001).

Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan basillah

yang dapat membentuk spora, akan tetapi tidak semua basil mampu berbuat

demikian. Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan beberapa spesies Clostridium

yang anaerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora,

dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel (Dwidjoseputro, 2001).

Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding tebal,

sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies Bacillus,

Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat

tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel vegetatif. Namun

pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma

baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora.

(Pelczar,1986)

Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang, hal ini bergantung pada

spesies. Endospora ada yang lebih kecil dan ada pula yang lebih besar daripada

diameter sel induk (Dwidjoseputro, 2001).

Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukannya

tidaklah sama bagi semua spesies. Sebagai contoh, beberapa spora adalah sentral

yaitu dibentuk di tengah-tengah sel, yang lain terminal yaitu dibentuk di ujung;

dan yang lain lagi subterminal yaitu di dekat ujung (Pelczar,1986).

Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi, jika keadaan medium memburuk,

zat-zat yang timbul sebagai pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor

luar lainnya merugikan. Tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora

meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat dicegah, jika selalu

diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Beberapa spesies bakteri

dapat kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh

lagi menjadi bakteri biasa apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula

air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora

menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung, tetapi

juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat tengah-tengah spora. Hal ini

merupakan ciri khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika kulit spora pecah di

tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada

kedua ujung bakteri. (Dwidjoseputro, 2001).

Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama

genus bacillus dan costridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora

dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada

kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan

misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan

untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan

Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri.

Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah

sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal ( letak spora diantara

ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2001).

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat

apusan preparat. Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi

sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat

diuapkan diatas air mendidih dengan tujuan untuk memperbesar pori-pori bakteri

agar pada saat pewarnaan dapat menembus dinding endospora dan dijaga jangan

sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan dari atas, yang

bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh bagian sel endospora.

Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang digunakan untuk melumuri

bagian warna dari sel yang lain dari pada endospora. Hasil uji bakteri Bacillus

spmenghasilkan bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada

penggunaan zat warna malachite green dan safranin dimana pada hasil pewarnaan

akan menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah pada sel vegatitifnya

(Lay, 1994).

XIII. Alat dan Bahan

Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca obyek

4. Kapas

5. kertas saring

6. Mikroskop majemuk

7. Ose

8. pembakar spirtus

Bahan

1. Biakan bakteri Bacillus subtilis.

2. NaCl fisiologis.

3. Zat warna karbol fiuksin dan biru metilen.

4. H2S04 1%

5. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.

6. minyak celup

Gambar Alat

XIV. Prosedur

Pertama-tama disiapkan alat dan bahan. Dibuat suspensi bakteri yang

terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. ditambahkan

korbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi tersebut. Dipanaskan campuran

tersebut dalam pemanas air bersuhu 800C selama 10 menit. Kemudian disediakan

kaca obyek yang telah dibersihkan dengan alkohol hingga kesat dan dibuat olesan

dari campuran tersebut, setelah itu ditandai dengan spidol di permukaan bawah

preparat. Digenangi olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu cuci dengan air

suling. Kemudian digenangi lagi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen

selama 5 menit, dibuang zat warna yang berlebih, dan dibilas dengan air suling,

lalu dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan sedikit minyak imersi pada

preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Kemudian hasilnya diamati dan

digambarkan.

XV. Data Pengamatan

XVI. Pembahasan

pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan spora pada bakteri

Bacillus subtilis. Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam

usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam

bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana

kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap

faktor luar yang tidak menguntungkan

Bacillus memiliki bentuk batang Gram positif pada kultur muda, motil

(reaksi nonmotil kadang terjadi), membentuk spora yang biasanya tahan

panas, aerob (beberapa spesies anaerob fakultatif), katalase positif dan

oksidasi bervariasi (Cowan, 1974). Bacillus dapat menjadi gram negatif

ketika memasuki fase pertumbuhan stasioner. Sebagian besar Bacillus

merupakan bakteri mesofil yang tumbuh dengan suhu optimal antara

3 C, meskipun ada beberapa yang termasuk golongan termo il dengan

suhu optimal pada suhu C

Sporulasi adalah suatu respon terhadap penurunan kadar nutrisi dalam

medium khususnya sumber karbon dan nitrogen. Pengaturan pembentukan

spora bersifat negatif karena sel membuat repressor dari senyawa yang

terkandung dalam medium untuk mencegah mulainya sporulasi. proses

pembentukan endospora pada B. subtilis membutuhkan beberapa jam. Pada

tahap I, terjadi perkembangan sel vegetatif yang ditandai dengan perubahan

struktur morfologi sel. Sel terbagi secara asimetris (tahap II) dan

menghasilkan dua bagian yaitu sel induk dan pre-spore. Kedua bagian ini

memiliki perkembangan yang berbeda. Tahap III dari sporulasi, peptidoglikan

pada septum terdegradasi dan pre-sporeditelan oleh sel induk, sehingga

membentuk sel dalam sel. Aktivitas sel induk dapat mempermudah sintesis

endospora dan membentuk korteks yang merupakan endapan dari suatu

lapisan (tahap VI+V). Hal ini diikuti oleh berakhirnya dehidrasi dan

pematangan endospora (tahap VI+VII). Akhirnya sel induk hancur pada saat

program sel mati, dan endospora terbebas ke lingkungan. Endospora akan

tetap dorman sampai berkecambah kembali pada kondisi yang sesuai

Praktikum dilakukan dengan metode pewarnaan klein dimana

dilakukan pewarnaan dengan karbol fuksin dan pewarna tandingan metilen

blue. Pertama-tama dibuat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri

dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. ditambahkan korbol fuksin sebanyak 1:1

ke dalam suspensi tersebut. Dipanaskan campuran tersebut dalam pemanas air

bersuhu 800C selama 10 menit. Kemudian disediakan kaca obyek yang telah

dibersihkan dengan alkohol hingga kesat dan dibuat olesan dari campuran

tersebut,. Digenangi olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu cuci

dengan air suling. Kemudian digenangi lagi olesan dengan pewarna tandingan

biru metilen selama 5 menit, dibuang zat warna yang berlebih, dan dibilas

dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan sedikit

minyak imersi pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Kemudian

hasilnya diamati dan digambarkan

Namun karena alasan singkatnya waktu, prosedur yang dilakukan

praktikan dimulai setelah pemanasan bakteri dengan karbol fuksin selesai,

dan prosedur sebelumnya telah dibantu oleh asisten.

Masuknya zat warna karbol fuksin dalam spora diakibatkan oleh

pemanasan yang berlangsung sehingga melonggarnya pori-pori sehingga zat

warna dapat masuk. Adanya molekul RNA dalam spora juga mengakibatkan

zat warna tidak keluar karena adanya ikatan kompleks zat warna – RNA,

ditambah lagi dengan adanya penambahan asam yang menutup kembali pori-

pori. Penambahan pewarna tandingan metilen blue mengakibatkan

terperangkapnya zat warna dalam sel bakteri sehingga perbedaan kontras

antara warna badan sel bakteri dengan sporanya dapat diamati.

Hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri Bacillus subtilisdengan

badan sel berbentuk basil bewarna biru dan adanya spora bewarna merah

didalam sel dengan posisi terminal. Namun tidak banyak bakteri yang

mengalami sporulasi sehingga tidak banyak spora yang dapat diamati.

Banyak faktor pembentukan spora pada bakteri yang sebelumnya telah

dituliskan. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi, jika keadaan medium

memburuk, zat-zat yang timbul sebagai pertukaran zat bertimbun-timbun dan

faktor-faktor luar lainnya merugikan. Tetapi pada beberapa spesies mampu

membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar seperti kondisi

kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan

kering. Kondisi-kondisi yang telah diberikan pada bakteri mungkin belum

menciptakan kondisi yang buruk bagi bakteri atau proses sporulasi yang

belum berjalan secara sempurna. Spora yang terbentuk telah membentuk

bakteri kembali dapat juga menjadi kemungkinan tidak tampaknya spora pada

bakteri karena kondisi pada tabung yang telah aman bagi bakteri tersebut.

Selain metode Klein, juga dapat dilakukan metode pewarnaan Wirtz dengan

pewarna Malachite green. Malachite green merupakan pewarna yang kuat yang

dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Semua spora bakteri mengandung asam

dupikolinat, yang mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri,

atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora. Dalam proses

pewarnaan, sifat senyawa inilah (asam dupikolinat) yang kemudian dimanfaatkan

untuk diwarnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau

malakit. Sedangkan menurut Pelczar (1986), selain subtansi di atas, dalam spora

bakteri juga terdapat kompleks Ca2+ dan asam dipikolinan peptidoglikan

XVII. Kesimpulan

Endospora bakteri dapat diamati dengan menggunakan prosedur pewarnaan

spora (pewarnaan Klein) dan setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi

dałam prosedur tersebut dapat dipahami

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2001.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia.

Gupte. 1990. Mikrobiologi Dasar.Jakarta : Penerbit Bina Rupa Aksara.

Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama.

Lay. 1994. Mikrobiologi Umum. Jakarta: Erlangga.

Margareth F. W. 1989. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Pelezar chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.