BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri berasal dari kata latin bacterium, untuk jamaknya bacteria yang artinya adalah

kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke

dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki

peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen

penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan

manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang

berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil

pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada coccus

dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum

hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro, 2005).

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri

itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka

dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang

paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak

kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu,

perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari

bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion

karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.

Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa

(Dwidjoseputro, 2005).

Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa,

pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif dan pewarnaan gram. Pewarnaan basa

adalah pewarnaan yang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah

pewarnaan yang tidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang

preparat bakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna yang

bersifat asam seperti tinta cina. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam

bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua

yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Hasil akhir dari pewarnaan gram

adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu/biru, sementara bakteri gram negatif

akan berwarna merah.

Oleh karena itu dilakukan percobaan untuk mengetahui teknik pewarnaan

mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

1.2 Tujuan Percobaan

a. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri.

b. Mengetahui fungsi dari pewarnaan bakteri.

c. Mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat

yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan

kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk

mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode

pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat

fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian

pengecatan.

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi

ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan

untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi

dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.

Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan

infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk

melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang

digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang

memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan

diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi

kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.

Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram

positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap

cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya

sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak

mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan

spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat

granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua

prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum

melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan

umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat

warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan

positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan

menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung

warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion

yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna

negatif (Trie, 2012).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna

basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan

memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan

memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak

digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan

sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan

dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat

(Dwidjoseputro, 1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme,

namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat

warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif

yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk

mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya

ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya

sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang

berumur 24 - 48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpangan

hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-

dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar

sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan

dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat

sebagai bakteri gram negatif.

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini

kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak

sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering

kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila

suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi

bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada

preparatnya.

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali

setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat

dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan

metanol. Fiksasi digunakan untuk:

1.      Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai

2.      Melekatkan bakteri pada glass objek

3.      Mematikan bakteri

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1. Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk

melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum

digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu

mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan

bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya

bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya

bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang

dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang

cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna

yang banyak digunakan adalah biru metilen dan ungu kristal.

2. Pewarnaan differensial

a. Pewarnaan gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan

spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram

negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi

nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram yang

mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara

pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan

gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan

gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi

atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena

itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak

mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong

bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies

tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui

memiliki sejumlah besar zat berlemak didalam dinding selnya sehingga

menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna

yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan

biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.

b. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam

konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi

zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses pemanasan, maka akan

menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh

peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut

bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk

mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium

tuberculosis .

3. Pewarnaan khusus

a. Pewarnaan Spora

Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik

pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling

banyak digunakan. Spora bakteri sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk

pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa

masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam

dimana cat  karbol-fukhsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin

asam Mycolic dari Mycobacterium.

b. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak

stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

c. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga

sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena

jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga

memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

4. Pewarnaan negatif

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar

belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan

transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan

ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan

yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu

bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.

Metode ini menggunakan tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam

seperti tinta cina. Pewarna asam memiliki negative charge kromogen, tidak akan

menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan

bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang

berwarna.

(Kesuma, 2013).

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 29 April 2013 pukul 16.00 – 18.30

WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkungan bertempat di Fakultas Teknik Universitas

Mulawarman Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat-alat

1. Pipet tetes

2. Jarum ose

3. Lampu bunsen

4. Cawan petri

5. Object glass

6. Mikroskop

7. Tabung reaksi

8. Gelas kimia 1000 ml

9. Botol semprot

10. Cover glass

11. Rak tabung reaksi

12. Botol semprot

13. Botol spray

14. Korek api

15. Sarung tangan

16. Masker

3.2.2 Bahan-bahan

1. Sabun cuci

2. Larutan zat warna crystal violet

3. Larutan zat warna tinta cina

4. Alkohol

5. Larutan lugol

6. Larutan zat warna safranin

7. Larutan malachite green

8. Aquades

9. Bakteri E. coli

10. Tisu

11. Kertas saring

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pewarnaan sederhana

1. Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu

dibersihkan lagi dengan tisu.

2. Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3. Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas kaca preparat.

4. Dikeringkan kaca preparat dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5. Difiksasi dengan dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

6. Didinginkan lalu diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes,

dan dibiarkan selama 1 atau 2 menit.

7. Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

8. Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

9. Diamati dengan menggunakan mikroskop.

10. Digambar bentuk bakteri.

3.3.2 Pewarnaan negatif

1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu

dibersihkan lagi dengan tisu.

2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4 Difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

5 Diteteskan larutan zat warna tinta cina diatas object glass hingga merata.

6. Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

7. Diamati dengan menggunakan mikroskop.

8. Digambar bentuk bakteri.

3.3.3 Pewarnaan gram

1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu

dibersihkan lagi dengan tisu.

2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5 Difiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen.

6 Didinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan

dibiarkan selama 1 menit.

7 Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

8 Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

9 Diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit.

10 Dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan diangin-anginkan.

11 Dicuci dengan alkohol selama 30 detik.

12 Diteteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes.

13 Dicuci dengan aquades.

14 Diamati dengan menggunakan mikroskop.

15 Digambar bentuk bakteri.

3.3.4 Perwarnaan spora

1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu

dibersihkan lagi dengan tisu.

2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5 Ditutup object glass dengan kertas saring.

6 Diteteskan malachite green sebanyak 2 atau 3 tetes.

7 Dilewatkan diatas api lampu bunsen hingga terlihat uap, jangan sampai zat warna

mendidih dan mengering.

8 Didiamkan 1 menit lalu dibuang kertas saring.

9 Dicuci dengan aquades dan dibiarkan selam 30 detik.

10 Diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik.

11 Difiksasi tanpa dipanaskan.

12 Diamati dengan menggunakan mikroskop.

13 Digambar bentuk bakteri.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Bakteri Yang Terbentuk

No Gambar Keterangan1. Pewarnaan Sederhana 1. Bakteri

Bentuk: basil (tongkat)

Warna: ungu

Perbesaran okuler: 10x

Perbesaran objektif: 40x

Perbesaran total: 400

2. Pewarnaan Negatif 1. Bakteri

Bentuk: coccus (bulat)

Warna: transparan

Perbesaran okuler: 10x

Perbesaran objektif: 40x

Perbesaran total: 400

3. Pewarnaan Gram 1. Bakteri

Bentuk: spirillum

Warna: merah

Perbesaran okuler: 10x

Perbesaran objektif: 40x

Perbesaran total: 400

4. Pewarnaan Spora 1. Spora bakteri

Warna: merah

Perbesaran okuler: 10x

Perbesaran objektif: 40x

Perbesaran total: 400

4.2 Pembahasan

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna

dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi

dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya

antara lain kristal violet, metylen blue, karbol, fuchsin, dan safranin (Trie, 2012).

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai,

dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan

negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat

warna yang tidak meresap kedalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga

kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna atau negatif (Trie,

2012).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri

gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna

crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri

gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol,

dan sewaktu diberi zat pewarna air fukhsin atau safranin akan tampak berwarna merah.

Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding

selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain crystal violet,

alkohol, safranin, dan iodine (Trie, 2012).

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan

safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya (Trie,

2012).

Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri

dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat

untuk melihat morfologi bakteri secara umum (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana

digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteri melainkan ke

dalam latar belakangnya (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri,

sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan

penambahan larutan pencuci (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite

green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada

sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Trie, 2012).

Crystal violet adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis

noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat-sifat anti

bakteri, jamur dan obat cacing. Crystal violet dipakai sebagai zat warna primer

dikarenakan mampu melekatkan bakteri pada kaca dan mencegah autolisis pada

sel,  membuat sel-sel lebih kuat atau keras,  mencegah mengkerutnya globula-globula

protein sel,  mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara

cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat (Trie,

2012).

Nigrosin (tinta cina) adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan

memanaskan campuran nitrobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah

sebagai pewarna untuk pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin

digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat

sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari

menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau

carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan

sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat

mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan  metode

biasa (Trie, 2012).

Lugol’s iodide, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan

iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan,

dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan pewarnaan dan tes medis. Fungsi larutan

lugol, yaitu meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri, untuk

memperjelas zat warna, dan mempersulit kelarutan zat warna (Trie, 2012).

Safranin adalah pewarna biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin

digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh

inti sel darah merah. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan. Safranin

biasanya memilki struktur kimia, juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku

dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin

tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung

campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam

kimia analitik. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan

pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna

pada mikroorganisme non target (Trie, 2012).

Alkohol yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel

bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan

terjadinya dua kemungkinan yaitu, mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu,

bakteri menjadi tidak berwarna (Kesuma, 2013).

Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan untuk melihat

bakteri batang pembentuk spora. Untuk membuat larutan malachite green dapat

digunakan bahan kimia dari malachite green oxalate (Kesuma, 2013).

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada

metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna ungu

setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak (Kesuma, 2013).

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding

selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma

organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme

gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram

positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25 – 50 nm)

sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogannya tipis (1 - 3 nm). Perbedaan ini

berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna

dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen

kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar

tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat

warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat

menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna

pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang

terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam

pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90%, dan larutan safranin.

Sifat bakteri terhadap pewarnaan gram merupakan sifat penting untuk membantu

determinasi suatu bakteri. (Kesuma, 2013).

Tabel Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

Sifat Gram positif Gram Negatif

Komposisi dinding sel Kandungan lipid Lipid tinggi

rendah

Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana

Ketahanan terhadap perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11 - 22%), peptidoglikan terdapat

didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,

tidak mengandung asam tekoat.

3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

6. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15 - 80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1 - 4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat

ringan. Mengandung asam tekoat.

3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

(Kesuma, 2013).

Mikroskop adalah alat yang di gunakan untuk melihat, atau mengenali benda-benda

renik yang terlihat kecil menjadi lebih besar dari aslinya.

Gambar 4.2 Mikroskop

Berikut adalah bagian-bagian mikroskop beserta fungsinya:

1. Lensa okuler, yaitu lensa yang dekat dengan mata pengamat lensa ini berfungsi

untuk membentuk bayangan maya, tegak, dan diperbesar dari lensa objektif.

2. Lensa objektif, lensa ini berada dekat pada objek yang diamati, lensa ini 

membentuk bayangan nyata, terbalik, dan diperbesar. Dimana lensa ini diatur oleh

revolver untuk menentukan perbesaran lensa objektif.

3. Tabung mikroskop, tabung ini berfungsi untuk mengatur fokus dan menghubungan

lensa objektif dengan lensa okuler.

4. Pemutar kasar (Makrometer), makrometer berfungsi untuk menaik turunkan tabung

mikroskop secara cepat.

5. Pemutar halus (Mikrometer), pengatur ini berfungsi untuk menaikkan dan

menurunkan mikroskop secara lambat, dan bentuknya lebih kecil daripada

makrometer.

6. Revolver, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara

memutarnya.

7. Reflektor, terdiri dari dua jenis cermin yaitu cermin datar dan cermin cekung.

Reflektor ini berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin kemeja objek

melalui lubang yang terdapat dimeja objek dan menuju mata pengamat. Cermin

datar digunakan ketika cahaya yang dibutuhkan terpenuhi, sedangkan jika kurang

cahaya maka menggunakan cermin cekung karena berfungsi untuk mengumpulkan

cahaya.

8. Diafragma, berfungsi untuk mengatur banyak sedikitnya cahaya yang masuk.

9. Kondesor, kondensor berfungsi untuk mengumpulkan cahaya yang masuk, alat ini

dapat putar dan di naik turunkan.

10. Meja mikroskop, berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati.

11. Penjepit kaca, penjepit ini berfungsi untuk menjepit kaca yang melapisi objek agar

tidak mudah bergeser.

12. Lengan mikroskop, berfungsi sebagai pegangang pada mikroskop.

13. Kaki mikroskop, berfungsi untuk menyangga atau menopang mikroskop.

14. Pengatur sudut, untuk mengatur sudut atau tegaknya mikroskop.

(Indriani, 2010).

Pada percobaan kali ini dilakukan beberapa jenis pewarnaan yaitu, pewarnaan

sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram, dan pewarnaan spora. Langkah pertama

adalah membersihkan object glass dengan alkohol agar bebas dari mikroba pengganggu,

lalu dibersihkan dengan aquades agar alkohol tidak menggangu proses pewarnaan

nantinya. Selanjutnya difiksasi, fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk

menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid

dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan

sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

Pada pewarnaan sederhana digunakan zat warna crystal violet. Dari percobaan yang

dilakukan pada pewarnaan sederhana didapatkan bakteri dengan bentuk basil dengan

menggunakan perbesaran 400. Pada pewarnaan negatif digunakan zat warna tinta cina.

Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan negatif didapatkan bakteri dengan

bentuk coccus yang tampak transparan dengan menggunakan perbesaran 400. Pada

pewarnaan gram digunakan dua zat warna yaitu crystal violet dan safranin. Crystal

violet ini merupakan zat warna utama dalam pewarnaan gram, dan safranin merupakan

zat warna kedua karena safranin digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah

kehilangan zat warna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Sedangkan lugol

digunakan untuk mengintensifkan warna utama atau warna dari crystal violet. Dan

alkohol yang merupakan larutan pencuci digunakan untuk melunturkan zat warna

utama. Pada perwarnaan spora digunakan zat warna malachite green karena spora

bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa. Untuk pewarnaan

endospora, perlu dilakukan pemanasan supaya zat warna malachite green  bisa masuk

ke dalam spora. Untuk itulah dilakukan pemanasan diatas api bunsen dengan ditutup

dengan kertas saring hingga terlihat uap. Pemanasan ini agar pori-pori bakteri membesar

sehingga zat warna malachite green dapat masuk dan dengan pencucian pori-pori

kembali mengecil menyebabkan zat warna malachite green tidak dapat dilepas

walaupun dilunturkan dengan alkohol, sedangkan pada badan bakteri zat warna

dilepaskan dan mengambil warna merah dari safranin. Pada percobaan ini didapatkan

spora yang seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya

warna merah dari safranin.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang

berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi

sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses

pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat

menyebabkan bakteri larut terbawa air.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

b. Fungsi dari pewarnaan bakteri adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk

bakteri, mengamati struktur dalam dan luar bakteri, dan reaksi terhadap pewarna

yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia bakteri dapat diketahui.

c. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu

setelah dicuci dengan alkohol pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif

akan mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sementara

bakteri gram negatif tidak.

5.2 Saran

Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya dilakukan jenis-jenis pewarnaan yang lebih

beragam, misalnya pewarnaan tahan asam dan pewarnaan flagel.

DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang. Djambatan.

2. Indriani, Sulistya. 2010. Bagian-Bagian Mikroskop dan Fungsinya.

http://sulistyaindriani.wordpress.com/2010/07/12/bagian-bagian-mikroskop-dan-

fungsinya.html, diakses pada tanggal 30 April pukul 20.15 WITA.

3. Kesuma, Widi Indra. 2013. Praktikum Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri.

http://widiindrakesuma.blogspot.com/2013/03/praktikum-mikrobiologi-

pewarnaan-bakteri.html, diakses pada tanggal 30 April 2013 pukul 19.23 WITA.

4. Pelczar, Michael. 1986. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakata. U dan D.

5. Trie, Ita. 2012. Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri.

http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html,

diakses tanggal 24 April 2013 pukul 16.53 WITA.