1

PEWARNAAN GRAM

Modul Kulit dan Jaringan Penunjang 2010

SEKSI PENDIDIKAN 2009

Ade Ilyas Mukmin

Anggi Puspita Nalia Pohan

Dessy Framita

Dina elita

Karina Kalani Firdaus

Monika Besti Yolanda

Naela Himayati Afifah

Oktrian

Riska Wahyuningtyas

Rizka Ramadhani

Zahra Suhardi

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2010

2

Tentir Praktikum Pewarnaan Gram

Landasan Teori

Pewarnaan gram terdiri dari 4 komponen, yaitu:

- Zat warna primer/primary stain (kristal karbol ungu, metil ungu, atau Gentian

ungu)

- Mordant (Gram’s Iodine, atau cairan lugol)

- Decolorizer (etil alcohol 95%, aseton, atau campuran etanol dan aseton dengan

perbandingan 1:1)

- Zat warna kedua/counter stain (dilute carbol fuchsin, safranin, atau neutral red)

a. Prosedur:

Mikroba pada gelas alas ditutup/direndam dengan beberapa tetes zat warna primer. Gentian

ungu adalah campuran dari metal ungu dan kristal ungu. Zat warna primer mengubah

semua bakteri menjadi berwarna ungu. Setelah beberapa menit direndam dengan zat

warna tersebut, sediaan dicuci dengan air.

Kemudian, sediaan tersebut ditetesi beberapa tetes Gram’s Iodine atau cairan lugol dan

dibiarkan beberapa menit. Hal ini akan menyebabkan terjadinya pembentukan kompleks dye-

iodine di dalam sitoplasma. Gram’s iodine berperan sebagai mordant (perekat zat

warna). Sediaan kemudian dicuci lagi dengan air, lalu didekolorisasi di dalam etil alcohol

atau aseton. Campuran antara aseton dan etil alcohol (1:1) juga dapat digunakan untuk

dekolorisasi. Proses dekolorisasi cepat terjadi, sehingga tidak boleh lebih dari 30 detik.

Aseton adalah decolorizer yang sangat poten dan dapat digunakan hanya dalam waktu 2-3

detik. Campuran antara etanol dan aseton bekerja lebih lambat daripada aseton murni.

Dekolorisasi adalah bagian yang paling penting dalam pewarnaan gram dan kesalahan-

kesalahan dapat terjadi pada proses ini. Dekolorisasi yang terlalu lama dapat menyebabkan

sediaan tidak terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram positif yang seharusnya berwarna

ungu pun dapat terlihat berwarna pink. Sementara itu, dekolorisasi yang terlalu cepat dapat

menyebabkan sediaan terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram negatif yang seharusnya

3

berwarna merah/pink pun dapat terlihat seperti Gram positif (berwarna ungu). Setelah

dekolorisasi, sediaan langsung dicuci di dalam air.

Terakhir, sediaan ditetesi beberapa tetes zat warna kedua (counter stain), seperti dilute

carbol fuchsin, neutral red, atau safranin. Sediaan kemudian dicuci dengan air. Air yang

berlebihan dapat dikeringkan menggunakan kertas saring, kemudian dibiarkan sampai benar-

benar kering sebelum dilihat di bawah mikroskop.

Bakteri yang tetap mengikat kompleks dye-iodine primer dan tetap berwarna ungu disebut

Gram positif, sedangkan bakteri yang terdekolorisasi dan mengikat zat warna kedua

(pink/merah) disebut Gram negative.

Basic fuchsin (biasanya dalam bentuk larutan karbol fuchsin) dapat mewarnai bakteri Gram

negative lebih intens daripada safranin, sehingga lebih mudah dilihat. Beberapa bakteri yang

sulit diwarnai dengan safranin, seperti Haemophillus spp., Legionella spp, dan beberapa

bakteri anaerob, dapat langsung diwarnai oleh basic fuchsin.

b. Mekanisme reaksi Gram:

Berbagai teori telah diajukan untuk menjelaskan mengapa beberapa bakteri dapat

mempertahankan zat warna primer, dan beberapa lainnya tidak dapat. Teori seperti perbedaan

dalam pH sitoplasma (2 pada bakteri Gram positif, dan 3 pada bakteri Gram negative), serta

keberadaan Magnesium ribonukleat pada bakteri Gram positif belum dapat diterima secara

luas. Ketebalan dinding sel Gram positif dan kandungan lemak yang lebih banyak pada

dinding sel Gram negative merupakan alasan yang lebih dapat diterima untuk menjelaskan

reaksi pewarnaan Gram.

Diyakini bahwa kristal ungu yang

bermuatan positif masuk ke dalam sel

melalui dinding sel dan membrane sel,

dan terikat pada komponen-komponen

yang bermuatan negative di dalam sel.

Penambahan iodine yang bermuatan

negative (di dalam mordant/lugol) akan

mengikat zat warna bermuatan positif

yang tadi, dan membentuk kompleks

4

dye-iodine di dalam sel. Kristal ungu (heksametil-para-rosanilin klorida) berinteraksi dengan

larutan KI-I2 (lugol) melalui pertukaran anion untuk membentuk presipitat kimia. Anion

klorida yang kecil pada kristal ungu akan digantikan oleh iodida yang lebih besar, sehingga

kompleks yang terbentuk menjadi tidak larut dalam air.

Selama dekolorisasi, alcohol melarutkan lipid yang ada pada membrane luar bakteri gram

negatif dan membawa serta kompleks dye-iodine ke luar sel. Lapisan tipis peptidoglikan

tidak dapat mempertahankan kompleks dye-iodine tersebut. Kompleks dye-iodine tercuci dari

sel Gram negative bersama dengan membrane luar. Oleh karena itu, sel Gram negative dapat

langsung terdekolorisasi.

Sementara itu, sel Gram positif menjadi dehidrasi akibat pemberian alcohol, sehingga pori-

porinya tertutup akibat dinding sel yang menyusut selama dehidrasi. Kompleks dye-iodine

pun terjebak di dalam lapisan peptidoglikan yang tebal dan tidak dapat terdekolorisasi.

c. Tambahan

- Walaupun pewarnaan Gram ditujukan untuk pewarnaan bakteri, beberapa fungi

seperti Candida dan Cryptococcus juga dapat dideteksi dengan pewarnaan Gram, dan

bersifat Gram positif (berwarna ungu).

Meskipun demikian, untuk mendeteksi fungi tersebut biasanya menggunakan KOH

10%.

- Spora pada bakteri yang memilikinya (endospora) tampak berupa wilayah yang

jernih, tidak terwarnai.

Alat dan Bahan Pewarnaan Gram

Alat:

a. Gelas alas

b. Sengkelit (alat untuk mengambil mikroba)

c. Kertas saring

d. Pensil gelas

e. Pensil warna

f. Rak untuk pewarnaan

g. Bunsen/lampu spiritus

5

Bahan:

a. Kristal karbol ungu/Gentian ungu

b. Cairan Lugol

c. Etil alcohol 95%

d. Safranin

e. NaCl 0,9%

f. Biakan bakteri

Cara Kerja

1. Buat dua buah lingkaran pada gelas alas menggunakan pensil gelas.

Kemudian letakkan gelas alas tersebut pada meja (tidak boleh di atas kertas, karena

kertas berwarna putih, jadi cairannya tidak terlihat, sementara mejanya

berwarna hitam, jadi sedikit lebih terlihat).

Gelas alas diletakkan terbalik (lingkaran yang tadi dibuat harus menghadap ke

bawah, jadi tidak akan terkena biakan bakterinya).

2. Ambillah biakan bakteri, kemudian sebarkan pada salah satu lingkaran. Ambil biakan

bakteri lainnya, kemudian sebarkan pada lingkaran lain.

Cara mengambil biakan:

a. Gunakan sengkelit dengan tangan kanan, kemudian bakar sampai berwarna

merah.

b. Ambil tabung biakan dengan tangan kiri, kemudian kapas penutupnya digenggam

dengan jari manis dan kelingking tangan kanan (ibu jari, telunjuk, dan jari

tengah masih menggenggam sengkelit). Putar tabung biakan dengan tangan kiri

sambil menariknya, sehingga kapas penutup akan terlepas.

Kapas penutup tabung harus terus digenggan, jangan letakkan di atas meja.

c. Setelah tabung biakan terbuka, bakar sebentar atau lewatkan ujung tabung pada

api.

d. Masukkan sengkelit pada tabung untuk mengambil biakan.

o Jika biakannya dalam medium cair, maka sengkelit cukup dicelupkan,

kemudian dioleskan pada lingkaran di gelas alas.

o Jika biakannya dalam medium agar, maka kita harus membuat suspensi

(campuran bakteri dan larutan NaCl) terlebih dahulu.

6

Untuk membuat suspensi, ambillah tabung larutan NaCl dan oleskan larutan

tersebut pada lingkaran di gelas alas dengan prosedur yang sama. Kemudian,

ambillah tabung biakan (medium agar), dan dengan prosedur yang sama

oleskan biakan pada lingkaran yang sudah basah oleh larutan NaCl.

Hati-hati ketika memasukkan sengkelit ke dalam tabung biakan. Sengkelit

cukup dioleskan pada permukaan agar (jangan sampai ada agar yang

kebawa sengkelit).

e. Setelah bakteri dioleskan pada gelas alas, bakar ujung tabung biakan maupun

tabung NaCl, kemudian tutup kembali dengan kapas yang tadi. Lalu simpan

kembali tabung tersebut

f. Bakar juga sengkelit sampai berwarna merah, kemudian simpan sengkelit.

3. Keringkan bakteri di udara

4. Setelah kering, gunakan penjepit kayu untuk mengambil gelas alas, kemudian

lewatkan gelas alas tersebut di atas api, 2-3 kali. Hal ini dilakukan untuk

menempelkan bakteri pada gelas alas (untuk fiksasi).

Bagian yang ada bakterinya jangan terkena api secara langsung. Jadi yang

dibakar itu bagian bawahnya.

5. Teteskan Gentian ungu pada sediaan sampai seluruhnya terendam, dan biarkan selama

1 menit.

6. Cuci dengan air yang mengalir. Airnya jangan terlalu besar, nanti bakterinya bisa

kebawa air.

7. Teteskan cairan Lugol sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 1 menit,

kemudian cuci dengan air.

8. Masukkan sedian (celupkan) ke dalam gelas yang berisi alcohol. Sediaan dinaik-

turunkan (dicelup-celupkan) berkali-kali sampai tidak ada zat warna ungu yang

mengalir dari sediaan lagi.

(Di buku panduan praktikum sih kyk gitu, tp klo d sumber teori tidak boleh

melebihi 30 detik. Alkohol kan utk ngilangin warna ungunya (dekolorisasi), jd

klo kelamaan, yg gram positif warnanya jd kurang ungu. Trus klo kecepetan, yg

gram negative jd agak-agak ungu. Jd katanya hrus tpat 30 detik. Klo msih ada

ungu-ungunya, jangan dipaksa diilangin, soalnya mungkin itu bakterinya)

9. Cuci dengan air

10. Teteskan safranin sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 45 detik, kemudian

cuci dengan air

7

11. Keringkan dengan kertas saring (kertasnya cukup ditempelkan ke sediaan, jangan

digosok-gosokkan ke sediaan). Kemudian tunggu beberapa saat sampai benar-benar

kering.

12. Lihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dengan meneteskan minyak

emersi. (Seperti biasa, lihatnya dari perbesaran 4x dulu, trus 10, 40, baru 100.

Dari pengalaman praktikum kemaren, ada beberapa mikroskop yg perbesaran

40 nya gak keliatan, gak tau knapa. Jd klo dpt mikroskop yg kyk gtu, klo udh

keliatan yg perbesaran 10, langsung ke perbesaran 100 aja)

8

Hasil

Streptococcus sp.

9

Staphylococcus sp.

10

11

12

13

Candida albicans

Maaf ya kalo ada gambar yang tidak terlalu jelas, yang pasti itu emang di dapat dari

miroskop saat praktikum. Jadi harap maklum aja ya..

By : Ade Ilyas Mukmin