1. JUDUL PRAKTIKUM

BAKTERI HASIL DIAGNOSA - UJI BIOKIMIAWI

2. TUJUAN PRAKTIKUM

Untuk mengetahui dan mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu,

sehingga membantu dalam menentukan validitas hasil isolasi bakteri rongga mulut

yang telah dilaksanakan pada praktikum sebelumnya.

3. LANDASAN TEORI

Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa yang

ada dalam sistem hidup, Sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari biomolekul. Untuk

dapat mempertahankan hidup, sel-sel mengalami metabolisme (reaksi pada sel).

Dalam metabolisme sel menyerap energi dari makanan atau nutrisinya, energi ini

digunakan untuk membentuk biomolekul penyusun sel (Lehninger, 1995).

Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel.

Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil

(mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa

kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan

kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan

industri. Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel,

dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi

dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks

(Colome, 2001). Aktivitas metabolisme tidak lepas dari adanya enzim. berdasarkan

tempat bekerjanya bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim selain bersifat

anabolik dapat juga bersifat katabolik. Sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang

disekresikan ke luar sel dan berdifusi kedalam media. sebagian besar eksoenzim

bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan molekul kompleks

menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana. molekul molekul yang

lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel

(Murray, 2005).

1

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimiawi biasanya dilihat dari interaksi

metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen reagen kimia. kemampuan bakteri

menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energinya dapat

digunakan untuk identifikasi (Pelczar,2008). Identifikasi bakteri dapat dilakukan

dengan beberapa uji antara lain uji dalam melakukan fermentasi, uji oksidase,

produksi katalase, uji motilase (Lim, 1998).

Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan

untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi

melalui sifat - sifat fisiologinya. Proses biokimia erat kaitannya dengan metabolisme

sel, yakni selama reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi

maupun yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk

kegiatan selular, seperti pergerakan. Suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya

berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia

dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya. Ciri fisiologi ataupun

biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen

bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang

berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pegamatan fisiologis yang memadai

mengenai kandungan organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak

mungkin dilakukan. Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti

bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik maupun biokimia. Mikroorganisme dapat

tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat

dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang dapat

menghasilkan perubahan warna reagen (Cowan, 2004).

Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi

bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji

MRVP, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H2S dan lain-lain. Salah satu uji yaitu adalah

uji hidrolisis urea. Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen

penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang mana dengan karakter

2

tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup

disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994).

Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk

koloni, warna, tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar

miring. Sedangkan morfologi sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang

sudah diwarnai dibawah mikroskop dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram dan

kemampuan membentuk spora dari bakteri tersebut (Pelczar & Chan, 2008).

KLASIFIKASI UJI BIOKIMIA

1. Uji Fermentasi

Uji Fermentasi dilakukan untuk melihat apakah bakteri mengurai suatu

karbohidrat tertentu menjadi asam. Karbohidrat digunakan oleh bakteri sebagai

sumber energi yang penting. Suatu enzim bakteri hanya dapat bereaksi dengan

satu karbohidrat tertentu seperti : glukosa, sukrosa, manitol, laktosa dan

sebagainya. Suatu bakteri bisa mempunyai banyak enzim sehingga dapat

melakukan fermentasi berbagai karbohidrat.

2. Uji Tsia (Triple Sugar Iron Agar)

Uji Tsia digunakan untuk melihat apakah bakteri memfermentasi Dextrose

(Glukosa,), Laktosa atau Sacharosa (Sukrosa). Uji ini juga digunakan untuk

melihat lebih jauh genus dalam kelompok Enterobacteriaceae , genus ini

seluruhnya merupakan basil gram negatif yang dapat memfermentasikan gula

menjadi asam.

3. Uji Katalase

Uji Katalase digunakan untuk melihat produksi katalase oleh bakteri. Katalase

adalah enzim yang dapat mengkatalisis hidrogen peroksida (H2O2) →

melepaskan oksigen bebas, biasanya untuk membedakan genus Streptococcus

dan Staphylococcus. Staphylococcus menunjukkan katalase positif dan

Streptococcus negatif.

4. Uji Koagulase

3

Uji Koagulase digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggumpalkan

plasma oleh enzim koagulase.

5. Uji Indole

Uji Indole digunakan untuk melihat kemampuan bakteri memproduksi indole dari

tryptophane (asam amino) karena mempunyai enzim Tryptophanase.

6. Uji VP (Vogeas-Proskauer)

Uji VP digunakan untuk mendeteksi kemampuan bakteri membentuk acetyl-

methyl-carbinol dari glukosa.

7. Uji Sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat untuk

sumber karbon dalam membangkitkan energi.

8. Uji Motility

Uji Motility digunakan untuk melihat pergerakan bakteri.

9. Uji Urease

Uji Urease digunakan untuk melihat adanya enzim urease pada bakteri.

4. ALAT DAN BAHAN

a. Tabung reaksi

b. Ose

c. Rak tabung

d. Brander Spiritus

e. Inkubator

f. Alkohol

g. Sampel media agar dari hasil praktikum

h. Korek

i. Tissue

4

5. PROSEDUR KERJA

a. Uji fermentasi

1. Inokulasikan suspensi bakteri sebanyak masing-masing 1 sengkelit ke

dalam media gula-gula. Hati-hati dalam pengocokan, jangan sampai

menimbulkan gas karena akan menghasilkan reaksi positif palsu.

2. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu 35-37∘C.

3. Setelah di inkubasi, amati perubahan warna yang terjadi.

b. Uji Voges Proskauer (VP)

1. Inokulasikan suspensi bakteri sebanyak 1 ose ke dalam media yang

telah disediakan.

2. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu 35-37∘C.

3. Setelah di inkubasi, tuangkan ½ bagian ke dalam tabung reaksi yang

bersih, beri label MR.

4. Teteskan pereaksi merah metil 6-8 tetes ke dalam tabung tersebut.

Hasil positif apabila berwarna merah.

5. Untuk voges proskauer, teteskan pereaksi Barrits A 12 tetes dan

pereaksi Barrits B sebanyak 4 tetes ke dalam tabung ½ dari sisa dan

beri label VP. Biarkan selama 15 menit.

c. Uji Sitrat

1. Inokulasikan suspensi bakteri sebanyak 1 ose dengan cara gores pada

perbenihan agar Simmon’s Citrate.

2. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu 35-37 ∘C.

3. Amati hasilnya, hasil positif apabila terjadi warna biru.

d. Uji Motil Indol Urea (MIU)

1. Inokulasikan suspensi bakteri sebanyak 1 ose lalu media ditusuk

2. Inkubasikan media selama 18-24 jam

3. Amati hasilnya.

5

6. PEMBAHASAN

1. Uji TSIA

Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan kuman untuk

memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat

yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang

menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam

suasana asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa

berada di bagian lereng. Selain menggunakan media TSIA dapat pula

digunakan media KIA (Kligers Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA

hanya berisi 2 macam karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa. Interpretasi hasil,

hanya memfermentasi glukosa: Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning

(bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa).

Memfermentasi semua karbohidrat: bila pada dasar (butt) media berwarna

kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam).

Tidak memfermentasi semua karbohidrat: bila pada dasar (butt) media

berwarna merah (bersifat basa) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat

basa). Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang

dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga dapat

digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat apakah kuman

memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus S).

Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman

memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S

akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung

dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap (Buchanan,

2003).

Pada hasil praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil uji TSIA, agar

berwarna kuning. Artinya agar memfermentasi semua karbohidrat karena

dasar dan lerengnya berwarna kuning.

6

2. Uji Sitrat

Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah

untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.

Pada media Simons sitrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila

bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah

menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil: negatif (-),

tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri

ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa

sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan sitrat sebagai salah

satu/satu-satunya sumber karbon. Positif (+), terjadinya perubahan warna media

dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan sitrat sebagai salah

satu/satu-satunya sumber karbon (Ratna, 2012).

Pada hasil praktikum yang dilakukan didapat hasil uji sitrat positif, karena

terjadi perubahan warna pada media dari hijau menjadi biru.

7

3. UJI FERMENTASI

Pada hasil praktikum yang dilakukan menunjukkan media gula yang

terdiri dari glukose, laktose, maltose, dan sakarosa menununjukkan adanya

perubahan warna medium menjadi kuning. Terjadi perubahan warna media

dari merah menjadi kuning. Didalam media gula hasilnya adalah asam, positif

dan adanya gas. Media gula terjadi perubahan warna media dari medium

menjadi kuning berarti kuman memfermentasi gula membentuk asam dan gas.

Gas yang diperhitungan minimal 10% dari tinggi tabung durham (Adam,

2001). Hal ini berarti sesuai dengan teori yaitu bakteri tersebut membentuk

asam dari hasil fermentasi terhadap karbohidrat sehingga menghasilkan warna

kuning.

8

a b c

Keterangan : (a) media glukose, (b) media laktose, (c) media maltose, (d)

media sakarose.

4. Uji VP

Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Interpretasi hasil:

negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan

a naphtol 5% dan KOH 40%. Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi

merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil akhir

fermentasi bakteri adalah asetil metil karbinol (asetoin) (Colome, 2001).

9

Pada hasil praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil negatif dan

ditunjukkan warna tetap kuning. Hal ini dikarenakan oleh bakteri membentuk basa

dari fermentasi Voges Proskauer. Komposisi dari medium Voges-Proskauer adalah

media kaldu yang mengandung pepton, buffer, dan glukosa. Dari kandungan inilah

mengapa bakteri tidak dapat mengurai Voges-Proskauer untuk proses

metabolismenya. (Cappuccino, 2000).

5. Uji Motil Indol Urea (MIU)

Pergerakan bakteri ditunjukan dengan adanya penyebaran koloni di sekitar

tusukan. Reaksi urea positif ditunjukkan perubahan warna media menjadi merah

muda. Reaksi indol positif ditunjukkan dengan penambahan pereaksi kovac yang

kemudian akan menghasilkan cincin merah di atas permukaan, dan menunjukan

negatif jika menghasilkan cincin jingga di atas permukaan.

Pada praktikum uji miu didapatkan hasil yang positif karena hasil

menunjukkan perubahan warna menjadi merah muda, terlihat adanya penyebaran

koloni disekitar tusukan, dan terdapat cincin berwarna merah di atas permukaan.

10

7. KESIMPULAN

Berdasarkan dari hasil praktikum yang telah di dapatkan bahwa dalam uji

biokimia yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dapat dilihat bahwa tiap

jenis bakteri dapat mengekspresikan atau menunjukkan karakternya tersendiri

jika dilakukan berbagai macam uji.

8. DAFTAR PUSTAKA

Adam, MR. 2001. Microbiology of Fermented Food. Elsivier Applied Science

Publisher, Ltd. New York.

Anonim. 2010. Identification of Enterobacteriacea. London: Health Protection

Pelczar. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang.

Buchanan,RE. & Gibbons,NE .2003. Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology. The William & Wilkins Company Baltimore.USA.

Cappuccino, JG. & Sherman, N. 2000. Microbiology: A Laboratory Manual. The

Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc. California.

Colome, JS. Et al. 2001. Laboratory Exercises in Microbiology. West Publishing

Company.New York.

11

Cowan, ST. 2004. Manual for the Identification of Medical Fungi. Cambridge

University Press. London.

Fardiaz dan Srikandi. 2002. Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka

Utama. Jakarta.

Volk dan Wheeler. 1993, Mikrobiologi Dasar, Erlangga: Jakarta.

Lim. 1998. Microbiology: a Laboratory Manual.Adison-Wesley Publishing

company: California.

Murray. 2005. Buku Ajar Mikrobiologi. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta

Pelczar, Michael J. dan Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi, Jakarta : UI

– Press.

Ratna, Siri. 2012. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur dasar

Laboratorium. PT Gramedia,Jakarta.

12