Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologipada Produk Farmasi dan Makanan

Marlia Singgih Wibowo

Jenis Uji

• Uji langsung• Teknik kultur• Metode Enumerasi• Metode Alternatif• Metode Cepat

Uji Langsung

• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik)

• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik)

• Metode pewarnaan• DEFT (Direct Epifluorescent Filter

Technique)

• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) : morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk koloni

• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua jenis mikroskop : optik dan fase kontras

• Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri

• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel disaring dengan filter, bakteridiwarnai dengan zat warna tertentu lalu dilihatdi bawah mikroskop epifluoresens

DEFT (Direct Epifluorescent FilterTechnique)

• Filter membran polikarbonat• Zat warna senyawa fluorokromatis yang

berfluoresensi setelah berikatan• Acridine orange :

Ikatan denan dsDNA : hijauIkatan dengan ssRNA : oranyeIkatan dengan sel hidup : kuningIkatan dengan sel mati : hijau terang

Teknik Kultur• Walaupun berbagai metode analisis

cepat dan sensitif telahdikembangkan untuk identifikasi dankarakterisasi mikroba patogen, teknik pembiakan mikroba di dalammedium mikrobiologi masihdiperlukan terutama untukkonfirmasi identitas. Media mikrobiologi yang sering digunakanumumnya adalah medium padatatau cair. Medium padat umumnyamengandung agar.

Kultur pada media agar• Tujuan Isolasi• Tujuan Determinasi• Tujuan

Penyimpanan• Tujuan

Pertumbuhan• Tujuan Produksi• Tujuan Analisis

Metode Enumerasi

• Plate Count : metode perhitunganmikroba yang ditumbuhkan di atascawan petri

• MPN Count (Most probable Number) : metode perhitungan relatifberdasarkan fenomena kekeruhan

• Analisis Fisikokimia : metodeperhitungan mikroba berdasarkankomponen sel atau metabolit yang dihasilkan

Metode Alternatif

• Dye-reduction Test• Electrical Methods• ATP Determination

Dye-reduction Test• Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna

(dye)• Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem

biologi yang aktif dan akan menghasilkanperubahan warna

• Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarnadan bentuk tereduksi tidak berwarna

• Contoh dye yang sering digunakan : metilenblue, resazurin, trifeniltetrazolium klorida

Electrical Methods

• Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan menyebabkanperubahan komposisi medium dan olehkarenanya akan merubah sifat elektriknya.

• Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi, kapasitans, dan impedansi

Penetapan ATP

• ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidupyang melakukan metabolisme

• Diukur melalui aktivitas enzim luciferasedan substrat luciferin menghasilkanpendaran cahaya (chemiluminesence)

Metode cepat

• Metode Imunokimia• Metode molekuler

Metode Imunokimia

• Prinsip analisis : berdasarkan reaksiAntigen-Antibodi

• Komponen sel atau metabolit selmikroba bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan pereaksi (suatu Abyang spesifik) menghasilkan kompleksAg-Ab

• Kompleks Ag-Ab divisualisasi denganberbagai cara yang dapat diukur(spektrofotometri spektofluorometri dll )

Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Antigen

Antibodi

KompleksAg-Ab

Konjugatenzim padaAg-Ab

Substrat

Produkberwarna

Reaksienzimatik

Jenis Metode Imunokimia

• EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)• RIA (Radio Immuno Assay)• IFA (Immuno Fluoresence Assay)• LIA (Luminescence Immuno Assay)

Metode Molekuler

• Cara Hibridisasi• Cara Amplifikasi

Teknik hibridisasi

• Proses denaturasi dsDNA menjadissDNA menggunakan pemanasan

• Kombinasi ssDNA tersebut dengansuatu segmen ssDNA lain yang telah diberi probe (label)

• Hibrid DNA yang telah mengandunglabel dapat dideteksi dengan berbagai

Teknik Hibridisasi

dsDNAdenaturasi

ssDNA dgn probe

ssDNA

Hibrid DNA berlabel

ssDNA

Teknik amplifikasi

• PCR (polymerase chain reaction) : reaksipolimerisasi berantai

• DNA target didenaturasi menggunakan panas• Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek)

yang komplemen dengan salah satu ujungssDNA

• Sintesis DNA yang diawali dari primer• Proses pengulangan 20 – 50 x

3’ 5’3’5’

Denaturasi pada 94 °C

3’5’

3’ 5’

3’ 5’

3’5’

Annealing primer pd 72°C

3’ 5’

3’5’Polimerisasipada 72 °C

3’5’

3’ 5’ dsDNA baru

dsDNA baru

Proses berulang

Denaturasi

Annealing

Polimerisasi

Proses setelah PCR

• Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat dideteksi

• Produk PCR dapat dideteksi denganelektroforesis

• Pita-pita DNA dibandingkan denganmarker DNA

Elektroforesis DNA

DNA marker

ProdukPCR

PCR Fingerprints of Replicates of an isolate of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of

Preservation with Mr Primer

©M. Ryan

L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in water , 12-16 cryopreserved, 17 control

Instrumen dan Bahan untukanalisis PCR

• DNA Thermal cycler• DNA target• Primer• DNA polimerase• Nukleotida• Larutan Mg 2+

• Alat Elektroforesis

Biochemical Methods: Enzymes

©M. Ryan

Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase, trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase, glucuronidase, proteases, fucosidase.

An APIZYM strip

Biochemical Methods: Metabolites

Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites

(Example of Patulin production by Penicillium spp.)