isolasi dan skrining bakteri endofit penghasil enzim l ...repository.ub.ac.id/4478/1/rizki nur...

ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM

L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha

SKRIPSI

Oleh :

RIZKI NUR FAUZIAH NIM. 135080300111064

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2017

Judul : ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L- ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha

Nama Mahasiswa : RIZKI NUR FAUZIAH

NIM : 135080300111064

Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan

PENGUJI PEMBIMBING:

Pembimbing 1 : Dr. Sc. ASEP AWALUDIN PRIHANTO, S.Pi, MP

Pembimbing 2 : Dr. Ir. HAPPY NURSYAM, MS

PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:

Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. ANIES CHAMIDAH, MS

Dosen Penguji 2 : Dr.Ir. HARDOKO, MS

Tanggal Ujian : 28 AGUSTUS 2017

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang saya tulis ini

dengan judul Isolasi dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-

Asparaginase dari Akar, Batang dan Daun Mangrove Exoecaria agalloca benar-

benar merupakan hasil karya saya sendiri, dan sepanjang pengetahuan saya

juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh

orang lain kecuali yang tertulis dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar

pustaka.

Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa laporan

skripsi ini hasil penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia untuk menerima

sanksi atas perbuatan tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.

Malang, Agustus 2017

Mahasiswa,

Rizki Nur Fauziah NIM. 135080300111064

UCAPAN TERIMAKASIH

Penyusunan penulisan laporan penelitian ini selesai karena adanya

bantuan dari berbagai pihak,maka dari itu penulis menyampaikan ucapan

terimakasih kepada:

1. Orang tua tercinta Moch. Djamil,S.ST, MT dan Dra. Nur Nadhiroh, M.Pd,

yang telah memberikan motivasi, dukungan,do’a, restu, dan ridho, sehingga

penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini dengan baik.

2. Dr.Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Dr. Ir. Happy Nursyam, MS

selaku dosen pembimbing dalam penulisan laporan skripsi yang senantiasa

selalu memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis.

3. Dr. Ir. Anies Chamidah dan Dr. Ir. Hardoko selaku dosen penguji pada

sidang skripsi yang telah memberikan masukan dan arahan pada penulisan

laporan skripsi.

4. Kakak dan adik tersayang Huril ‘In Afqiha Taubatin dan Muhammad Mukhlis

yang telah memberikan semangat, dukungan, dan nasehat selama penulisan

skripsi.

5. Teman-teman nan jauh Fauziah Hidayati, Nurma Azuhra, dan Immamatul

Khoiriah yang selalu memberikan motivasi,dukungan, dan semangat hingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

6. Sahabat-sahabat seperjuangan Febrianti Ambar Ningrum, Charta Chartusi

Lujeng N, Eka Rizky M, dan Titis Verdilah yang selalu memberikan

dukungan dan semangat agar skripsi ini dapat terselesaikan.

7. Saudara-saudara tersayang di Malang Laily, Ulid, Anggie, Mbak Nay, Mbak

Nana, Mbk Rine, dan Rina yang selalu menghibur disaat penulis jenuh, sedih

maupun senang dan senantiasa memberikan semangat hingga dapat

menyelesaikan skripsi.

8. Endyk Alvianto yang telah memberikan semangat, motivasi, nasehat, dan

yang selalu menerima keluh kesah penulis hingga skripsi ini dapat

terselesaikan dengan baik.

9. Teman-teman sebimbingan yang telah memberikan dukungan, dan

semangat yang dapat menjadikan motivasi penulis untuk dapat

menyelesaikan skripsi ini dengan baik.

10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sampaikan semua, yang telah

memberikan bantuan kepada penulis selama proses hingga skripsi ini dapat

terselesaikan.


Rizki Nur Fauziah

NIM. 135080300111064

ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria

agallocha

Rizki Nur Fauziah1), Asep Awaludin Prihanto2), Happy Nursyam3)

ABSTRAK

Enzim L-Asparaginase (L-Asparagin amidohydrolase) merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-Asparagine menjadi l-aspartat dan ammonia. L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan, bakteri, dan dalam serum tikus tertentu. L-Asparaginase tidak ditemukan pada manusia. Salah satu jenis tumbuhan yang memiliki potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove Excoecaria agalloca. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh bakteri endofit dari akar, batang, dan daun mangrove Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-Asparaginase dan mengetahui identitas bakteri berdasarkan uji Microbact system. Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif. Pada penelitian ini menggunakan sampel akar, batang, dan daun dari mangrove Excoecaria agalloca, yang diambil dari pantai Bajul Mati Malang. Sampel yang telah diambil kemudian dilakukan penanaman untuk mendapatkan isolat bakteri dengan cara dilakukan pengnceran dari 10-1 sampai 10-6 . Setelah didapatkan isolate bakteri maka akan dilakukan skrining dengan menggunakan media selektif L-asparaginase dan didapatkan hasil bakteri penghasil L-asparaginase. Bakteri yang memiliki aktifitas hidrolisis paling besar akan dilakukan uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Dari hasil isolasi bakteri endofit didapatkan 12 isolat bakteri yaitu daun 4 isolat, batang 4 isolat, dan akar 4 isolat. Dari 12 isolat tersebut terdapat 5 isolat yang positif menghasilkan enzim L-asparaginase yaitu dari D10-4 dan D10-5, serta dari B10-3, B10-4 dan B10-5. Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas penghasil L-asparaginase tertinggi adalah pada B10-3. B10-3

adalah bakteri gram positif yang memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil, berdiameter koloni 3,11 mm, dan menurut uji microbact system yang dilakukan bakteri tersebut adalah Bacillus subtilis. Kata Kunci : endofit, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis

ISOLATION AND SCREENING OF ENDOPHYTES BACTERIA WHICH PRODUCE L-ASPARAGINASE ENZYME FROM ROOT, STEM AND LEAF MANGROVES

Excoecaria agalloca

ABSTRACT

L-asparaginase enzyme (L-Asparagine amidohydrolase) is an enzyme that catalyzes and hydrolyses L-asparagine to L-aspartat and ammonia. L-asparaginase can be found in tissues of animals, plants, bacteria, and in rat serum. L-asparaginase can not be found in humans. One type of plant that has the potential source for producing l-asparaginase enzyme is the endophytes of mangrove Excoecaria agalloca. The purpose of this research was obtain bacteria endophytes from root, stem, and leaves of mangrove Excoecaria agalloca which capable of producing L-asparaginase enzyme and to identify the bacteria based on Microbact system test. The research method was descriptive. In this research used sampel roots, stems, and leaves from mangrove Excoecaria agalloca, taken from the beach of Bajul Mati Malang. Samples were taken and then plated to obtain

1) Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang 2) dan 3) Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang

isolates of bacteria by dilution from 10-1 to 10-6. Obtained the bacterial isolates will be screened using selective media L-asparaginase and showed bacteria producing L-asparaginase. Bacteria that have the most substantial hydrolysis activity will be conducted gram stain test and microbact system test. From the result of endophytic bacteria isolation, there were 12 isolates of 4 isolate leaves, 4 isolates stems, and 4 isolate roots. There were 5 isolates among 12 isolates which produced L-asparaginase enzyme is D10-4 and D10-5, and from B10-3, B10-4 and B10-5. Of the 5 isolates that have the highest L-asparaginase-producing activity are in B10-3. B10-3 is a gram-positive bacteria that has a basil cell shape with non motile motility, 3.11 mm colony diameter, and according to microbact system test the bacteria was Bacillus subtilis. Keywords : Endophytes, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis

KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT, atas limpahan

rahmat dan hidayah-Mu penulis dapat menyajikan Laporan Skripsi yang berjudul

Isolasi Dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-Asparaginase Dari Akar,

Batang, dan Daun Mangrove Excoecaria agallocha. Di dalam tulisan ini, disajikan

pokok-pokok bahasan yang meliputi cara mengisolasi bakteri hingga

menscreening bakteri yang dapat menghasilkan enzim L-Asparaginase dan

melakukan mutagenesis untuk mengetahui perubahan aktivitas enzim yang

didapatkan.

Sangat disadari bahwa dengan kekurangan dan keterbatasan yang

dimiliki penulis, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti,

tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis

mengharapkan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi yang

membutuhkan.


Rizki Nur Fauziah

NIM. 135080300111064

DAFTAR ISI

Halaman RINGKASAN ..................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii DAFTAR ISI ....................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiii 1. PENDAHULUAN ............................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang .......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 2 1.3 Tujuan Penelitian....................................................................................... 3 1.4 Kegunaan Penelitian ................................................................................. 3 1.5 Waktu dan Tempat .................................................................................... 3

2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................... Error! Bookmark not defined.4

2.1 Morfologi dan Klasifikasi Excoecaria agallocha ......................................... 4 2.2 Endofit Mangrove ...................................................................................... 5 2.3 Isolasi Mikroorganisme .............................................................................. 6 2.4 Enzim ........................................................................................................ 7 2.4.1 Pengertian Enzim ................................................................................... 7 2.4.2 Jenis Enzim ............................................................................................ 8 2.5 L-Asparaginase ........................................................................................ 9 2.6 Faktor –Faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim ............................... 10 2.7 Sumber Enzim L- Asparaginase ............................................................. 12 2.8 Aplikasi Enzim L- Asparaginase ............................................................. 12 2.9 Identifikasi Spesies Bakteri ..................................................................... 13

2.9.1 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram ...... 13 2.9.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact…………….15

3. METODE PENELITIAN ................................................................................. 17

3.1 Materi Penelitian...................................................................................... 17 3.1.1 Alat Penelitian ...................................................................................... 17 3.1.2 Bahan Penelitian .................................................................................. 17 3.2 Metode Penelitian .................................................................................... 17 3.3 Prosedur Penelitian ................................................................................. 18 3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Excoecaria agalloca ...... 18 3.3.2 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase)…………………..19 a. Preparasi Sampel ...................................................................................... 19 b. Pengenceran ............................................................................................. 19 c. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) .............................................. 20 d. Sterilisasi Alat dan Media .......................................................................... 21 e. Penanaman Sampel pada Media LBA ....................................................... 21 f. Isolasi Bakteri ............................................................................................. 22 g. Inokulasi pada Agar Miring ........................................................................ 22 h. Skirining Bakteri Pengahasil Enzim L-Asparaginase ................................. 23 3.3.3 Tahap 2 (Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact) ........... 24

a. Pewarnaan Gram ...................................................................................... 24 b. Uji Microbact System ................................................................................. 25

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 30

4.1 Isolasi Bakteri .......................................................................................... 30 4.2 Bakteri Penghasil L-Asparaginase ........................................................... 31 4.3 Isolasi Koloni ........................................................................................... 33 4.4 Identifikasi Bakteri ................................................................................... 34

4.4.1 Uji Pewarnaan Gram ..................................................................... 34 4.4.2 Uji Microbact System ..................................................................... 35

5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................... 44

5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 44 5.2 Saran ...................................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 45 LAMPIRAN ........................................................................................................ 50

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Kode sampel .................................................................................................. 20

2. Endofit yang menghasilkan isolat bakteri ....................................................... 31

3. Hasil Bakteri Endofit Penghasil L-Asparaginase ............................................ 32

4. Hasil Identifikasi dengan Microbact system .................................................... 36

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Daun Excoearia agalloca ................................................................................ 5

2. Mekanisme Reaksi Katalisis L-Asparaginase ................................................. 10

3. Struktur bakteri a) Gram Positif dan b) Gram Negatif…………………………..14

4. Tahapan pewarnaan Gram positif berwarna ungu hingga biru yang dikarenakan oleh warna kompleks dari kristal violet, dan sedangkan Gram negatif berwarna merah mudah dikarekan oleh warna safranin………………………………………..……………………………………..14

5. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati ................................ 19

6. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecaria agalloca, A.

D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5………………………………………31

7. Isolat murni dari bakteri B10-3 ....................................................................... 33

8. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3 ………………………………………35

9. Pengambilan sampel Excoecaria agalloca pada pantai Bajul Mati…………..50

10. Sampel Daun dan Batang dari Excoecaria agalloca .................................... 50

11. A.Pengenceran daun, B.Pengenceran batang, C.Pengenceran akan .......... 51

12. A. Isolat Bakteri B10-3 , B. Streak Kuadran Bakteri B10-3 .............................51

13. Isolat Bakteri pada Agar Miring .................................................................... 51

../Bismillah%20Kompre/laporan%20skripsi.docx#_Toc491811969







1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim L-Asparaginase (L-Asparagin amidohydrolase) merupakan enzim

yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-Asparagine menjadi l-aspartat dan

ammonia (Kishore et al., 2015). Enzim ini dapat dimanfaatkan untuk kesehatan

dan pangan. Pada kesehatan enzim ini dimanfaatkan untuk terapi leukemia, dan

pada pangan digunakan untuk memproduksi makanan yang bebas akrilamid.

Akrilamid merupakan suatu senyawa yang terbentuk dari reaksi maillard antara

L-asparagin dan gula pereduksi dalam makanan yang diproduksi dalam suhu

yang tinggi (± 120 °C) (Fuhr et al., 2006). Penambahan L-asparaginase pada

proses produksi makanan yang diolah dengan suhu tinggi akan mencegah

pembentukan akrilamid dengan cara mengkoversi asam amino L-asparagin

sebagai prekursornya menjadi bentuk asam amino lain yakni asam aspartat yang

pada umumnya terdapat dalam makanan (Antara, 2009).

L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan,

bakteri,dan dalam serum tikus tertentu. Tetapi L-Asparaginase tidak ditemukan

pada manusia (Muslim et al., 2015). Salah satu jenis tanaman yang memiliki

potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove.

Bagian dari endofit mangrove yang mampu menghasilkan mikroba endofit adalah

akar, batang, dan daun. Beberapa mikroba endofit yang dapat menghasilkan

enzim L-asparaginase dalam jumlah yang besar seperti E. coli, Erwinia cartova,

Enterobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Candida utilities, Bacillus

sp, dan Pisum sativum (El-Bessoumy et al., 2004). Mikroba endofit merupakan

mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan mampu untuk membentuk

suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa memberI efek negatif pada

tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang (Kasi et al., 2015).

2

Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi pada saat ini yang

lebih banyak dieksplorasi yaitu jamur-jamur endofit. Terdapat fakta menarik

tentang mikroba endofit yaitu kemampuannya untuk memproduksi senyawa-

senyawa bioaktif, senyawa bioaktif yang diproduksi terkadang sama dengan

inangnya ataupun berbeda dengan inangnya bahkan juga ada yang menyatakan

bahwa senyawa yang telah dihasilkan oleh mikroba endofit yaitu memiliki

aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas senyawa tumbuhan inangnya

(Sinaga et al., 2009).

Penelitian ini menggunakan mangrove Excoecaria agaloca yang diambil

dari Pantai Bajul Mati dengan sampel akar, batang, dan daun. Dari sampel

tersebut akan didapatkan bakteri endofit yang selanjutkan akan dilakukan

skrining enzim L-asparaginase. Hasil dari skrining bakteri penghasil enzim L-

asparaginase yang paling baik akan dilakukan uji pewarnaan gram dan uji

microbact system untuk mengetahui jenis spesies dari bakteri penghasil enzim L-

asparaginase.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan , maka rumusan

masalah dari penelitian ini adalah :

1. Apakah terdapat bakteri endofit dari akar, batang, dan daun mangrove

Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-

Asparaginase ?

2. Apakah spesies bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove

Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-Asparaginase

berdasarkan identifikasi pewarnaan gram dan uji microbact system ?

3

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove


Asparaginase.

2. Mengetahui spesies bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove


Asparaginase berdasarkan identifikasi pewarnaan gram dan uji

microbact system.

1.4 Kegunaan Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat berguna sebagai informasi

mengenai adanya bakteri penghasil enzim L-Asparaginase dari akar, batang, dan

daun mangrove.

1.5 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan melalui dua tahapan. Penelitian tahap pertama

yaitu isolasi dan skrining bakteri yang menghasilkan enzim L-Asparaginase yang

dilaksanakan di Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan dan Laboratorium

Parasit dan Penyakit Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas

Brawijaya Malang pada bulan November 2016 - Maret 2017. Penelitian tahap

kedua yaitu Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact di Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang pada bulan

Maret 2017.

4

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Morfologi dan Klasifikasi Excoecaria agallocha

Excoecaria agallocha merupakan salah satu spesies tumbuhan mangrove

yang memililiki habitus pohon dan semak. Tetapi di daerah Baluran yang ditemui

adalah habitus pohon. Memiliki batang berwarna abu-abu, berbentuk bulat,

memiliki getah yang dapat membuat iritasi mata dan kulit (Sartiono, 2007).

Adapun klasifikasi dari tumbuhan mangrove jenis Excoecaria agallocha

menurut Sofnowandi (2015), adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Malpighiales

Family : Euphorbiaceae

Subfamily : Euphorbioideae

Tribe : Hippomaneae

Subtribe : Hippomaninae

Genus : Excoecaria L.

Species : Excoecaria agallocha

Excoecaria agallocha adalah pohon yang merangas kecil yang memiliki

ketinggian mencapai 15 m. Kulit kayu berwarna abu-abu, halus, tetapi memiliki

bintil. Akar menjalar di sepanjang permukaan tanah, seringkali berbentuk kusut

dan ditutupi oleh lentisel. Batang, dahan dan daun memiliki getah yang berwarna

putih dan lengket, sehingga dapat mengiritasi kulit serta mata. Daunnya hijau tua

dan akan berubah menjadi merah bata sebelum rontok, pinggiran bergerigi

halus, memiliki 2 kelenjar pada pangkal daun. Bentuk daun elips, ujungnya

meruncing dengan ukuran 6,5 – 10,5 x 3,5 – 5 cm (Noor et al., 1999). Berikut

adalah gambar daun Excoearia agalloca :

5

2.2 Endofit Mangrove

Mangrove merupakan tumbuhan yang kawasan hidupnya di pesisir yang

pertumbuhannya dipengaruhi oleh pasang surut air laut. Mangrove dapat

didefinisikan sebagai sekumpulan tumbuhan yang didominasi oleh beberapa

spesies yang khas atau semak-semak yang mempunyai kemampuan untuk

tumbuh di perairan asin. Ekosistem mangrove merupakan ekosistem yang

berada pada wilayah intertidal, dimana pada wilayah tersebut terdapat interaksi

yang kuat antara perairan laut, payau, sungai dan terrestrial. Mangrove

menyebar di sepanjang pantai Asia, Afrika, Australia dan Amerika (Martuti,

2013).

Mangrove pada umumnya dibagi menjadi 4 zona, diantaranya yaitu

daerah terbuka, daerah tengah,daerah payau, dan daerah ke arah daratan.

Excoecaria agalloca dan Avecennia alba adalah jenis-jenis yang dominan pada

areal pantai yang sangat tergenang. Mangrove tengah terletak di belakang zona

mangrove terbuka yang banyak didominasi oleh jenis Rhizophora dan jenis

Bruguiera. Mangrove payau terletak di sepanjang sungai berair payau hingga

hampir tawar. Pada zona tersebut didominasi oleh jenis Nypa dan Sonneratia.

Mangrove daratan berada pada zona perairan payau hingga hampir tawar di

belakang jalur hijau mangrove yang sebenarnya. Jenis-jenis umum yang ditemui

Gambar 1. Daun Excoearia agalloca

6

adalah Ficus retusa, Nypa fruticans, Pandanus sp., Lumnitzera recemosa dan

Xylocarpus moluccensis. Pada sebenarnya zonasi tersebut tidak selalu bersifat

universal, karena masing-masing jenis mangrove memiliki karakteristik habitat

yang berbeda yang mampu mendukung kehidupannya (Noor et al., 1999).

Mikroba endofit merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan

tumbuhan dan mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan

tanpa member efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang

(Kasi et al., 2015). Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi pada

saat ini yang lebih banyak dieksplorasi yaitu jamur-jamur endofit. Terdapat fakta

menarik tentang mikroba endofit yaitu kemampuannya untuk memproduksi

senyawa-senyawa bioaktif, senyawa bioaktif yang diproduksi terkadang sama

dengan inangnya ataupun berbeda dengan inangnya bahkan juga ada yang

menyatakan bahwa senyawa yang telah dihasilkan oleh mikroba endofit yaitu

memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas senyawa tumbuhan

inangnya (Sinaga et al., 2009).

2.3 Isolasi Mikroorganisme

Bakteri dapat diisolasi dari berbagai jenis sumber seperti akar, batang,

daun, tanah, dan air. Bakteri yang tumbuh secara alami sebagian besar

merupakan koloni campuran, sehingga perlu dilakukan isolasi untuk

mendapatkan biakan yang murni. Menurut Hadioetomo (1995), terdapat tiga

teknik untuk mengisolasi bakteri yaitu :

1. Teknik Goresan (Streak Plate Method)

Pada teknik goresan yaitu mengisolasi bakteri dengan menggoreskan

suspesnsi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan media agar yang

terdapat didalam petridish yang telah steril. Setelah diinkubasi, pada bekas

7

goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah pada permukaan media yang

berasal dari satu biakan murni.

2. Teknik Tuang (Pour Plate Method)

Pada teknik tuang yaitu mengisolasi bakteri dengan cara menginokulasi

suspensi dalam bahan yang mengandung bakteri kedalam petridish steril,

setelah itu dilakukan penuangan media agar cair (suhu 50°C) dan diinkubasi.

Setelah diinkubasi, akan tumbuh koloni-koloni yang tersebar pada permukaan

media yang berasal dari satu biakan murni.

3. Teknik Sebaran (Spread Plate Method)

Pada teknik sebaran yaitu dengan cara menginokulasi suspensi bahan

yang mengandung bakteri pada sebuah media agar yang terdapat dalam

petridish steril dan dilakukan inkubasi. Setelah diinkubasi akan tumbuh koloni

yang terpisah pada permukaan media yang berasal dari satu biakan murni.

2.4 Enzim 2.4.1 Pengertian Enzim

Enzim merupakan biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam

amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim

berperan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Enzim juga merupakan

protein yang digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalis reaksi antara lain yaitu

konversi energi dan metabolisme pertahanan sel (Richana, 2004).

Enzim mampu bekerja terhadap zat atau substrat yang memiliki hubungan

atau kecocokan antara enzim dan substrat. Hubungan keduanya dapat terjadi

pada bagian atau tempat tertentu saja. Bagian atau tempat yang dapat

berhubungan tersebut dinamakan sebagai bagian aktif (active site). Hubungan

tersebut akan terjadi apabila bagian aktif memliki ruang yang tepat sehingga

dapat menampung substrat. Hubungan antara substrat dan enzim akan

membentuk kompleks enzim-substrat (Yuniarsih, 2012).

8

Enzim berfungsi sebagai katalis yang dapat digunakan untuk meningkatkan

atau mempercepat kecepatan reaksi kimia dengan cara menurunkan energi

aktivasinya. Selain itu, juga dapat dilakukan dengan meningkatkan suhu reaksi,

karena tingginya suhu akan mempercepat gerak molekul. Namun, tidak semua

penggunaan suhu itu baik dan tepat, karena tidak semua senyawa dapat tahan

terhadap suhu tinggi. Penggunaan suhu tinggi tersebut, selain dapat merusak

senyawa juga dapat mengakibatkan biaya proses yang lebih besar (Legninger,

1990).

2.4.2 Jenis Enzim

Menurut Meiyanto (2008), enzim-enzim dapat dikelompokkan menjadi 6

kelompok besar, tergantung dari jenis reaksi yang dikatalis yaitu sebagai berikut:

1. Oksidoreduktase, mengkatalis reaksi oksidasi dan reduksi dengan cara

pemindahan elektron. Contohnya : Dehidrogenase, Oksidase, Reduktse,dan

Katalase.

2. Transferase, reaksi pemindahan gugus fungsional (gugus metil atau gugus

fosfat). Contohya : Transaldolase dan Transketolase, Kinase, serta

Fosfomutase.

3. Hidrolase, reaksi hidrolisis yang melibatkan penambahan air (H2O).

Contohnya : Esterase, Glikosidase, Peptidase, Fosfatase, Amidase,

Deaminase, Dan Ribonuklease.

4. Liase, reaksi pemindahan gugus pada ikatan ganda atau sebaliknya.

Contohnya : Dekarboksilase, Aldolase, Hidratase, Dehidratase, dan Sintase.

5. Isomerase, reaksi pemindahan gugus dalam satu molekul yang akan

menghasilkan isomer. Contohnya : Rasemase, Epimerase, Isomerase, dan

Mutase.

9

6. Ligase, reaksi pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O, dan C-N oleh reaksi

kondensasi yang akan berkaitan dengan penguraian ATP. Contohnya :

Sintetase dan Karboksilase.

L-Asparaginase termasuk dalam kelompok enzim hidrolase karena enzim

L-Asparaginase merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-

Asparagine menjadi l-aspartat dan ammonia (El-Nanggar et al., 2014).

2.5 L-Asparaginase

L-asparaginase (L-asparagin amidohidrolase) merupakan enzim yang

mampu untuk mengkatalisis proses hidrolisa L-asparagin menjadi L-aspartat dan

ammonia (Kishore et al., 2015). Asam aspartat yang selanjutnya akan masuk

dalam siklus asam sitrat yang akan menjadi pemeran penting dalam suatu

metabolisme dari asam amino (Hendriksen et al., 2009). Substrat ataupun produk

yang didapatkan dari hasil reaksi tersebut akan berperan penting dalam

metabolisme semua organismee, mulai dari bakteri hingga mamalia. Jumlah L-

asparagin dalam tanaman yang berlebihan akan disimpan dan akan digunakan

pada transport nitrogen sebagai biosintesis protein (Borek dan Jaskolski, 2001).

Dalam teknologi pangan enzim L-asparaginase dapat digunakan untuk

mengurangi akrilamida yang terkandung dalam bahan pangan. Akrilamida

tersebut dapat bersifat karsinogen pada tubuh konsumen (Ciesarova et al.,

2006). Adapun mekanisme reaksi hidrolisis dan reaksi katalisis L-asparaginase

dapat dilihat pada gambar berikut :

10

Gambar 2. Mekanisme Reaksi Katalisis L-AsparaginaseSumber : El-Bessoumy et al. (2004)

2.6 Faktor –Faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim

Menurut Murray (2003), aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa

faktor, yaitu :

1. pH

pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena memiliki sifat

ionik pada gugus karboksil dan gugus amino yang mudah untuk dipengaruhi oleh

pH. Hal tersebut dapat menyebabkan konfermasi dan fungsi katalitik enzim dapat

berubah. Enzim memiliki pH optimum yang khas yaitu pH yang dapat

menyebabkan aktivitas maksimal.

2. Suhu

Reaksi kimia sangat dipengaruhi oleh suhu, maka reaksi yang akan

dikatalis oleh enzim juga akan peka terhadap suhu. Terdapat kisaran suhu

tertentu yang sesuai dengan jenis masing-masing enzim. Kecepatan reaksi akan

meningkat ketika suhu dinaikkan.

L-asparaginase Beta-acyl-enzyme intermediete

Aspartic acid

11

3. Waktu Inkubasi

Aktivitas enzim akan dipengarui oleh lamanya waktu inkubasi. Waktu

yang diperlukan enzim untuk berikatan dengan substrat hingga menghasilkan

produk dapat disebut waktu inkubasi enzimatis. Waktu inkubasi enzimatis akan

sebanding dengan produk yang akan dihasilkan. Waktu inkubasi yang lama akan

menyebabkan banyaknya enzim yang berikatan dengan substrat sehingga

semakin banyak produk yang dihasilkan. Apabila enzim sudah jenuh dengan

substrat maka lama waktu inkubasi tidak mempengaruhinya lagi.

4. Konsentrasi Enzim

Kecepatan reaksi akan bergantung pada tingkat konsentrasi enzim yang

akan berperan sebagai pengaktifan dalam melakukan suatu reaksi. Pada reaksi

enzimatis, kecepatan reaksi akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.

Maka tingginya konsentrasi enzim akan semakin cepat reaksi berlangsung.

5. Konsentrasi Substrat

Peningkatan konsentrasi substrat akan menyebabkan kecepatan reaksi

yang meningkat, tetapi pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya

akan meningkatkan kecepatan reaksi sedemikian kecil.

2.7 Sumber Enzim L- Asparaginase

L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan,

bakteri,dan dalam serum tikus tertentu. Tetapi L-Asparaginase tidak ditemukan

pada manusia (Muslim et al., 2015). Salah satu jenis tanaman yang memiliki

potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove.

Mikroba endofit merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan

mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa member

efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang (Kasi et al., 2015).

12

Mikroba yang dapat menghasilkan enzim L-Asparaginase diantaranya

adalah Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas sutzeri, Erwinia sp., dan Capsicum annum (Mungi et al., 2014).

Enzim L-Asparaginase juga dapat ditemukan pada mikroorganisme eukariotik

seperti pada ragi dan jamur. Enzim ini dapat digunakan untuk terapi limfositik

leukemia dan jenis kanker lain yang ada pada manusia (Makky et al., 2013).

2.8 Aplikasi Enzim L- Asparaginase

Potensi enzim L-Asparaginase yang dihasilkan oleh bakteri E.coli

merupakan enzim yang efektif sebagai agen antitumor. Hal tersebut telah

dilakukan uji coba pada kelinci percobaan yang telah diberi perlakuan leukemia

limfoblastik akut dan limfosarkoma. Hasil yang didapatkan adalah enzim L-

Asparaginase tersebut mampu mengobati secara efektif leukemia limfoblastik

akut dan limfosarkoma tersebut. L-Asparaginase mampu untuk menghambat

sistesis protein dalam sel T dengan cara mengkonversi L-asparagin menjadi L-

aspartat dan ammonia. L-asparagin juga merupakan asam amino ensisal yang

dibutuhkan oleh tubuh namun tidak terdapat didalam tubuh (Jayam dan Kannan,

2014).

L- Asparaginane juga dapat diaplikasi dalam industri makanan yaitu untuk

mengurangi pembentukan akrilamida pada bahan pangan. Akrilamida tersebut

merupakan karsinogen yang terdapat pada bahan pangan yang berbahan dasar

tepung. Akrilamida akan terbentuk ketika bahan pangan tersebut dilakukan

proses penggorengan dan pada proses inilah terdapat asam amino asparagin

yang akan berubah menjadi akrilamida proses tersebut dinamakan reaksi

Maillard. Reaksi ini akan bertanggung jawab untuk membuat suatu produk

pangan yang dilakukan proses penggorengan menjadi berwarna kecoklatan.

Dengan ditambahkannya enzim L-asparaginase pada pangan sebelum dilakukan

13

proses penggorengan maka akan menggurangi secara signifikan proses

terbentuknya akrilamida. Hal tersebut dikarenakan karena asam amino asparagin

akan menjadi asam aspartat dan ammonium bukan menjadi akrilamida lagi

( Jayam dan Kannan, 2014).

2.9 Identifikasi Spesies Bakteri2.9.1 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram

Identifikasi suatu mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara

pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram pada suatu mikroorganisme dapat

dikelompokkan menjadi dua, yaitu gram-positif dan gram-negatif berdasarkan

reaksi atau sifat mikroorganisme terhadap cat yang diberikan. Reaksi tersebut

ditentukan oleh komposisi dinding selnya (Nikaido, 1996).

Bakteri gram negatif lebih resisten terhadap obat-obatan dibandingkan

dengan bakteri gram positf. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri

tersebut adalah perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri gram positif

susunan dinding sel lebih sederhana terdiri dari 2 lapis namun memiliki

lapisanpeptioglikan yang tebal, sementara untuk bakteri gram negatif lebih

kompleks dan terdiri dari 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Lay, 1994).

Gambar 3. Struktur bakteri a) Gram Positif dan b) Gram Negatif

Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet

sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri

14

gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan

alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak

berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan

struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).

Gambar 4. Tahapan pewarnaan Gram positif berwarna ungu hingga biru yang dikarenakan oleh warna kompleks dari kristal violet, dan sedangkan

Gram negatif berwarna merah mudah dikarekan oleh warna safranin.

2.9.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact

Pengidentifikasian spesies mikroorganisme yaitu dengan cara

menganalisa kemapuan metabolisme dengan menggunakan metode uji biokimia.

Uji biokimia tersebut meliputi kemampuan mikroorganisme dalam menggunakan

bagian dari beberapa jenis sumber karbon dan senyawa lainnya yang terdapat

pada tubuhnya. Uji biokimia ini beragam dan semakin banyak jenis senyawa

pengujian yang dilakukan maka akan dapat menghasilkan identifikasi

mikroorgasime secara spesifik hingga tingkat spesiesnya (Brock et al., 1978).

Uji secara fisiologis dapat menggunakan Microbact Identification System,

pada uji ini digunakan untuk mengetahui karakteristik fisiologis dari bakteri gram

positif atau bakteri gram negatif, sehingga dapat diketahui genus dan jenis

bakterinya. Format yang digunakan pada uji ini dalam bentuk test-strip atau

microplate sederhana, dengan hasil yang jelas terlihat sebagai reaksi-reaksi

15

warna berbeda yang dapat diintepretasikan menggunakan Microbact (Arrizal et

al., 2013).

Kit Microbact 12E dan Microbact 12B merupakan identifikasi sitem

komersial yang digunakan untuk bakteri secara umum, bakteri gram positif, dan

bakteri gram negatif golongan enterobacter. Microbact 12E untuk bakteri gram

negatif dan Microbct 12B untuk bakteri gram positif. Pada uji ini terdiri dari

sebanyak 12 substrat biokimia yang berbeda uji ini akan menggunakan

Microbact. Pengujian dengan menggunakan Microbact akan mempermudah

untuk melakukan identifikasi suatu mikroorganisme. Microbact memiliki sistem

yang telah dirancang sedemikian rupa untuk mengidentifikasi mikroorganisme

dengan komposisi substrat dan peraksi yang telah distandarisasi. Pengujian

dengan manggunakan Microbact akan memiliki beberapa ketentuan sebelum

dilakukan pengujian, yaitu sampel isolat yang akan diujikan harus merupakan

isolat yang telah dimurnikan dan dilarutkan kedalam garam fisiologis

(Murtiningsih, 1997).

Prinsip kerja dari Microbact adalah dengan mereaksikan sejumlah

suspense isolat kedalam sumur-sumur yang telah berisi sumber karbon dan

senyawa-senyawa biokimia lain yang berjumlahkan 12 jenis. Suspensi bakteri

yang dilarutkan ke dalam garam fisiologis akan ditambahkan ke dalam masing-

masing 12 sumur uji biokimia yang telah tersedia. Setelag dilakukan inkubasi

selama18-24 jam pada suhu 37oC reagen yang sesuai akan ditambhkan dan

perubahan warna pada setiap sumur yang berbeda akan dicatat. Evaluasi hasil

dapat dilihat melalui sumur-sumur Microbact apakah positif atau negatif dengan

cara membandingkan dengan tabel warna dan hasil akan ditulis pada formulir

Patient Record. Angka-angka oktal yang telah didapat dari penjumlahan reaksi

positif saja dari tiap-tiap kelompok (3 sumur didapatkan 1 angka oktal). Nama

16

bakteri dapat dilihat dengan menggunakan komputer berdasarkan dengan angka

oktal yang telah didapatkan (Murtiningsih, 1997).

17

3. METODE PENELITIAN

3.1 Materi Penelitian3.1.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi beaker glass, erlenmeyer,

gelas ukur, autoklaf, inkubator, pH-meter, timbangan digital, neraca analitik,

cawan petri, mikro pipet, pengaduk magnet (stirer), lemari pendingin, freezer,

mortar dan alu, spatula bahan, pipet volume, pipet serologis, pipet tetes, bola

hisap, tabung reaksi, rak tabung reaksi, bunsen, loop ose, corong kaca, sprayer,

washing bottle, kompor, panci, laminar air flow, hot plate, blue tip, yellow tip,

vortex mixer, botol sampel dan nampan.

3.1.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain, sampel endofit

mangrove Excoecaria agalloca (batang, akar, daun), aquades, yeast exstract,

pepton, NaCl, agar bakteriologi, D-glucose, L-asparagin, Na2HPO4, KH2HPO4,

MgSO4.7H2O, CaCl2, NaOH, HCl, bromothymol blue (BTB), alkohol 70 %, spirtus,

tali benang, kapas, aluminuium foil, plastik wrap, tusuk gigi, penggaris 30 cm,

kertas label, spidol permanen, sarung tangan, masker, dan tissue.

3.2 Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif. Metode

deskriptif eksploratif merupakan metode yang menggambarkan tentang suatu

keadaan atau kejadian. Dalam penelitian yang menggunakan metode deskriptif

hanya akan menggambarkan keadaan objek atau persoalannya dan tidak

dimaksudkan untuk mengambil kesimpulan yang berlaku untuk umum. Penelitian

secara deskriptif akan mengkamulasi data dasar, dan tidak menerangkan atau

mengetest hipotesis (Suryabrata, 1983).

18

Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan. Tahap pertama yaitu isolasi

dan skrining bakteri penghasil enzim L-asparaginase. Tahap kedua yaitu

Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact. Hasil penelitian dipaparkan

secara deskriptif berdasarkan tahapan-tahapan penelitian yang dilakukan.

Sedangkan hasil pengujian aktivitas enzim L-asparaginase dipaparkan secara

kuantitatif.

3.3 Prosedur Penelitian3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Excoecaria agalloca (Prihanto et al., 2011)

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel yang berasal

dari batang pohon mangrove jenis Excoecaria agalloca yang berasal dari pantai

Bajul Mati Malang. Sampel daun, batang, dan akar diambil dari pohon mangrove

Excoecaria agalloca dengan cara memotong bagian daun beberapa lembar dan

batang yang memiliki ukuran tidak terlalu besar, kemudian dipotong ±10 cm dan

dimasukkan ke dalam wadah sampel. Sampel yang telah diambil dibawa menuju

Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan Universitas Brawijaya Malang dan

disimpan pada suhu 4°C hingga sampel akan digunakan.

Pantai Bajul Mati merupakan pantai di pesisir selatan pulau Jawa yang

bertempat di Desa Gajahrejo, Kecamatan Gedangan, Kabupaten Malang, Jawa

Timur. Memiliki jarak sekitar 58 km dari kota Malang. Letak geografis pantai Bajul

Mati pada 8o25’52.6” S dan 112o38’07.8” E. Peta pengambilan sampel pada

pantai Bajul Mati dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 5. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati Gambar 1. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati

19

3.3.2 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase)a. Preparasi Sampel (Yulvizar, 2013)

Pertama yang dilakukan pada penelitian tahap satu ini adalah preparasi

sampel. Sampel yang digunakan dari tanaman magrove Excoecaria agalloca

adalah bagian dari batang, akar dan daun. Semua sampel yang berbeda tersebut

ditumbuk dan dihaluskan menggunakan mortal dan alu. Setelah halus, ditimbang

menggunakan timbangan digital sebanyak 1 gram.

b. Pengenceran (Darmayasa, 2008)

Pengenceran dilakukan dari 10-1 sampai 10-6. Pengenceran dilakukan

bertujuan untuk mengurangi kepadatan bakteri ketika dilakukan penanaman agar

bakteri yang tumbuh dapat mudah diambil. Sampel sebanyak 1 gram dilarutkan

pada 9 ml NaFis steril yang telah terdapat pada tabung reaksi dan didapatkan

pengenceran tingkat 10-1, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dengan

cara mengambil 1 ml larutan dari tabung 10-1 ke tabung lain untuk mendapatkan

pengenceran 10-2 begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran sebanyak

10-6. Adapun kode sampel yang digunakan adalah pada tabel berikut :

Gambar 2. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati

20

Tabel 1. Kode sampel

Kode sampel Keterangan

A (D10-4)B (D10-5)C (B10-4)D (B10-3)E (D10-3)F (B10-6)G (B10-5)H (A10-3)I (A10-4)J (A10-5)K (A10-6)L (D10-6)

Daun pengenceran 10-4


Batang pengenceran 10-4





Akar pengenceran 10-3





c. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) (Kurniasari, 2005)

Pertama semua bahan yang diperlukan adalah yeast extract 0,5 %, NaCl

1 %, pepton 1 %, dan agar bakteriologi 2 %. Pertama-tama yang dilakukan

adalah persiapan bahan yang akan digunakan. Cawan yang digunakan

sebanyak 12 cawan yang tiap cawanya diasumsikan berisi 20 ml media.

Sehingga dibutuhkan 12 cawan x 20 ml = 240 ml media LB. Sehingga

pembuatan agar dibuat sebanyak 250 ml. Kemudian masukkan akuades 125 ml

dan masukkan bahan 1,2 gram yeast extract, 2,5 gram NaCl, 2,5 gram pepton,

dan 5 gram agar bakteriologi ke dalam erlenmayer 1000 ml dan dihomogenkan

menggunakan magnetic stirrer setelah homogen kemudian tambahkan 125 ml

akuades dan homogenkan kembali. Hal ini bertujuan agar media yang dibuat

dapat homogen dan tidak menggumpal pada dasar erlenmayer. Kemudian media

yang sudah di homogenkan ditutup kapas dan dilapisi lagi dengan alufo dan di

sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit

dengan tekanan 1 atm.

21

d. Sterilisasi Alat dan Media (Mayanti, 2013)

Semua alat yang akan disterilisasi harus dalam keadaan bersih dan

kemudian dibungkus dengan menggunkan kertas dan memasukkan kedalam

autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Untuk media

dilakukan penghomogenan media dengan menggunakan magnetic stirrer dan

kemudian direbus terlebih dahulu selama 15 menit untuk lebih menghomogenkan

media. Setelah dilakukan perebusan kemudian dilakukan sterilisasi pada autoklaf

suhu 121oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Sedangkan untuk alat-alat

yang tidak tahan panas tinggi cukup dilakukan sterilisasi dengan menggunakan

alkohol 70 %.

e. Penanaman Sampel pada Media LBA (Kharisma dan Abdul, 2012)

Setelah media yang telah di sterilisasi diletakan ke dalam LAF (Laminer

Air Flow) yang sudah disinari UV selama kurang lebih 30 menit agar kondisi LAF

lebih aseptis. Media dibiarkan hingga menjadi hangat kuku sehingga tidak terlalu

panas. Media yang sudah hangat kuku kemudian dituang pada cawan petri dan

diasumsikan setiap cawan di berikan 20 ml media. Kemudian media ditunggu

hingga padat. Setelah dingin dan media telah padat, sampel pengenceran

ditanam pada media LBA dari pengenceran 10-3 sampai 10-6 secara duplo

sebanyak 200 µl pada tiap cawanya. Cawan yang telah dilakukan penggoresan

bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik wrap yang bertujuan untuk

meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutnya media yang telah

ditanam diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.

f. Isolasi Bakteri (Pastra et al., 2012)

Setelah diinkubasi bakteri yang berkoloni baik dan tidak spreader diisolasi

kembali pada media yang baru dengan menggunakan metode gores 3 kuadran

dan diinkubasi dengan suhu 37 0C selama 24 jam. Tujuan dari metode ini adalah

22

untuk mendapatkan koloni yang murni sehingga proses identifikasi nanti akan

jauh lebih mudah dilakukan. Pada tahap ini dilakukan dengan cara membagi

media cawan menjadi 3 bagian.

Goresan pada media dilakukan 3 kali dengan membentuk pola zig-zag.

Jarum ose ditempelkan pada sumber isolat dan kemudian digoreskan secara zig-

zag rapat pada media baru dibagian pertama. Lalu, jarum ose di fiksasi bunsen

dan digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi kedua namun

tidak serapat goresan pertama dan begitu pula pada sisi ke tiga goresan dibuat

renggang. Pada metode ini, goresan sisi pertama diharapkan koloni tumbuh

padat dan berhimpitan , sedangkan pada goresan sisi kedua koloni mulai tampak

jarang dan begitu pula selanjutnya. Sehingga didapatkan koloni yang tumbuh

secara terpisah dari koloni lain atau disebut dengan isolat murni. Cawan yang

telah dilakukan penggoresan bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik

wrap yang bertujuan untuk meminimalisir adanya kontaminasi dari luar.

Selanjutya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.

g. Inokulasi pada Agar Miring (Rakhmawati, 2012)

Hasil dari isolat murni yang didapatkan dari isolasi strik kemudian

dilakukan inokulasi pada tabung reaksi yang berisi media LBA berbentuk agar

miring. Inokulasi dilakukan dengan cara memanaskan jarum ose pada bunsen

hingga memerah kemudian dibiarkan sejenak hingga sedikit dingin. Selanjutnya

jarum ose digunakan untuk mengambil isolat murni (bakteri yang terpisah dari

koloninya) dan digoreskan secara zig-zag pada agar miring. Isolat bakteri yang

dipilih merupakan isolat yang berwarna putih kekuningan, berbentuk bulat

dengan tepian tidak rata dan membentuk elevansi yang datar serta terpisah dari

koloni yang lain. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas

secara rapat dan di wrap menggunkan plastik wrap yang bertujuan untuk

23

meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutya diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37 0C.

h. Skirining Bakteri Pengahasil Enzim L-Asparaginase (Gulati et al., 1997)

Skrining atau seleksi bakteri penghasil enzim L-Asparaginase dilakukan

dengan cara menanam isolat murni bakteri yang telah didapat pada agar miring.

Media selektif yang digunakan adalah media L-Asparaginase . Bahan-bahan

yang digunakan dalam pembuatan media ini adalah 6 gram/liter Na2HPO4, 2

gram/liter KH2PO4, 0.5 gram/liter NaCl, 20 gram/liter L-Asparagine, 2 gram/liter

glucose, 0,2 gram/liter MgSO4, 0,005 gram/liter CaCl2, agar 2 % dan

bromothymol blue (BTB) sebanyak 0,007 %. Selanjutnya, pH diatur menjadi 5,5

menggunakan pH meter dengan ditambahkan HCl sehingga media bersifat asam

dan BTB berubah warnah menjadi kuning. Penambahan BTB bertujuan sebagai

indikator warna.

Media yang telah dihomogenkan kemudian disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 121 0C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm.

Selanjutnya media yang telah disterilisasi di diamkan pada Laminar Air Flow

(LAF) hingga hangat kuku, kemudian media yang telah hangat kuku dituang

kedalam cawan ditunggu media hingga padat dan dingin. Setelah media padat

kemudian cawan dibalik, hal ini bertujuan agar uap yang terdapat pada tutup

cawan tidak turun pada media, cawan yang telah dibalik kemudian dibagi

menjadi 12 bagian. Isolat bakteri yang didapat sebelumnya pada agar miring

ditanam dengan menggunakan tusuk gigi yang telah disterilkan pada media

selektif, dengan cara digoreskan secara vertikal pada masing-masing bagian

cawan dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 37 0C dan diamati setiap 24 jam

sekali dan dicatat perkembanganya. Lalu, didapatkan bakteri yang menghasilkan

enzim L-Asparaginase terbaik dan siap diidentifikasi.

24

3.3.3 Tahap 2 (Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact)a. Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1995)

Tahap awal adalah pengambilan isolat murni dengan menggunakan jarum

ose yang sebelumnya dipanaskan terlebih dahulu pada bunsen. Selanjutnya satu

ose bakteri diletakkan pada preparat dan dibuat pewarnaan. Langkah ini

dilakukan sebanyak 3 kali sehingga pada setiap preparat terdapat 3 kali

pewarnaan yang diberi kode yang berbeda. Sebelum diberikan pewarnaan,

preparat diberi akuades terlebih dahulu agar mempermudah pemberian

pewarnaan pada preparat. Hasil pewarnaan yang didapat di blower sampai

kering sehingga dapat mempermudah proses pewarnaan gram. Preparat yang

telah kering difiksasi agar bakteri pada preparat mati tetapi tidak merusak struktur

selnya. Kemudian ditetesi kristal ungu dan ditunggu satu menit. Pemberian kristal

ungu adalah sebagai pewarna primer. Setelah ditunggu 1 menit preparat dibilas

untung mencuci sisa kristal ungu yang ada. Lalu diberi iodium untuk memperkuat

warna dan didiamkan kembali satu menit dan dibilas. Kemudian diberi alkohol 70

% untuk melarutkan lemak dan dibilas denga air untuk menghilangkan sisa

alkohol yang tidak terpakai. Tahap berikutnya adalah pemberian safranin sebagai

pewarna sekunder dan dibiarkan selama 30 menit dan dibilas dengan air dan

ditetesi minyak imersi untuk memperjelas indeks bias, preparat yang telah

diwarnai kemudia diamati degan mikroskop.

b. Uji Microbact System (Murtiningsih, 1997)

Uji microbact system adalah uji yang digunakan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme. Pengujian ini bergantung pada hasil uji oksidase yang dilakukan

sebelumnya. Apabila hasil oksidasenya positif maka pengujian dilakukan dengan

menggunakan microbact 24E, dan jika hasil yang didapat negatif maka akan

menggunakan microbact 12E. Sistem ini adalah sistem mikro-substrat standar

25

yang dirancang untuk mensimulasikan substrat biokimia konvensional yang

digunakan untuk mengidentifikasi basil gram negatif (Murtiningsih, 1997).

Tahapan pada uji ini pertama isolat murni di sentrifuge dengan kecepatan 3000

rpm selama 15 menit. Dari hasil sentrifuge didapatkan supernatan dan pelet

namun yang digunakan hanya bagian yang pelet saja. Kemudian pelet yang

dihasilkan diberi Nafis sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan pada sumur

Microbact 24E atau 12E tergantung kepada hasil oksidasenya sebanyak 0,1 ml

dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0C. Evaluasi hasilnya dapat

dilihat pada sumur microbact, apakah hasilnya positif atau negatif dengan cara

membandingkan tabel warna dan hasilnya akan ditulis pada formulir Patient

Record. Angka-angka oktal didapat dari penjumlahan reaksi positif saja, dari tiap-

tiap kelompok. Dari total ini selanjutnya dapat diketahui spesies bakteri yang

dimaksud dengan memasukkan data kedalam software komputer (Ballows et al.,

1991).

Identifikasi mikroorganisme menggunakan Microbact System ini terdiri

dari beberapa uji yaitu uji oksidase, motilitas, nitrat, lisin, ornitin, H2S, glukosa,

manitol, sitrat, indol, urease,V-P, sitrat, TDA, gelatin, malonase, intisitol, sorbitol,

rhamnosa, sukrosa, lactosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.

Untuk penjelasan dari tiap uji dapat dijabarkan sebagai berikut:

- Uji Motilitas (Tittsler, 1996 dan Presscott, 2002)

Uji motilitas biasanya digunakan sebagai uji untuk membedakan

mikroorganisme berdasarkan matilitasnya, yaitu adalah salah satu ciri dari

mahluk hidup atau mikroorganisme yan mempunyai alat gerak sederhana yang

berupa flagel atau cilia. Bakteri menggunakan energi yang mereka dapat dari

ATP untuk bergerak. ATP diuraikan oleh koenzim ATP-ase dan membentuk fosfo

anorganik. Cara kerja pengujian ini adalah dengan menanam isolat pada media

26

NA tegak dan ditusukkan sedalam 5 mm, kemudian diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37 0C.

- Uji Oksidase (Lay, 1994)

Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya sitokrom oksidase yang

dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Pertama, biakan ditumbuhkan

pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 0C. Kemudian

ditambahkan reagen uji oksidase yang terdiri dari campuran 1 % larutan α-naftol

dan 1 % larutan-p-fenilendiamin oksalat pada koloni bakteri dan selanjutnya

didiamkan selama 30 menit. Hasil uji dinyatakan postif apabila berwarna hitam.

- Uji Nitrat (Wedhastri, 2002)

Penggunaan uji nitrat adalah untuk menguji kemampuan mikroorganisme

yang dapat tumbuh pada media yang mengandung pepton sebagai sumber

nitrogen. Cara kerja dari pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media

yang mengandung KNO3, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C.

Setelah itu ditambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa-naftilamin, dan

dilihat reaksinya. Pada umumnya, pada medium agar milk, isolat akan tumbuh

berbentuk bulat, dengan warna yang beragam dan besar diameter yang beragam

pula.

- Uji Ornitin (Wahyunio, 2011)

Pada pengujian ditahap ini kita menggukan media MIO untuk dapat

mengetahui reaksi terhadap ornitin, dapat juga digunakan untuk megetahui ada

atau tidaknya pergerakan bakteri yang diuji serta kemampuan bakteri tersebut

dalam penghasilan indol.

- Uji H2S (Didje et al., 2006)

Uji H2S biasa digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme

dalam menghidrolisis logam berat yang terdapat pada media biakan. Hasil uji

dinyatakan positif apabila terjadinya pembentukan warna hitam pada media.

27

Cara kerja yang dilakukan adalah dengan menanam isolat pada media TSIA

(Triple Sugar Iron Agar).

- Uji Urease (Ramdany, 2008)

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat

menghidrolisis atau mendegradasi urea dengan enzim urease. Isolat pertama di

tumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa bakteri mampu

menghasilkan enzim urease yang daoan menguraikan urea menjadi amonium

dan CO2. Uji ini dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari warna

merah jingga menjadi merah ungu. Apabila telah terjadi perubahan warna maka,

penguraian urea telah terjadi.

- Uji Indol (Ramdany, 2008)

Uji indol adalah uji untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme unutk

mmbentuk lapisan cincin yang memiliki warna merah muda pada permukaan

biakan dengan penambahan larutan kovacs. Selain itu, Norman (2008) juga

menyatakan bahwa uji ini mampu menunjukan mampu atau tidaknya suatu

bakteri untul menghidrolisis triptofan dengan memanfaatkan enzim triftophanase.

Cara kerja dari pengujian ini adalah dengan menumbuhkan isolat bakteri pada

media yang mengandung triptofan dan menginkubasi biakan tersebut selama 48

jam pada suhu 37 0C. Kemudian dilakukan penambahan larutan reagen yang

mengandung paradimetil aminobenzal dehida.

- Uji V-P (Ramdany, 2008)

Uji V-P (Vogues-Proskauer) digunakan untuk menguji kemampuan bakteri

atau mikroorganisme untuk bereaksi dengan asetonin dan oksigen yang

menghasilkan fermentasi akhir berupa asetil metil karbinol. Cara kerja dari

pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa

dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C. Lalu, dilakukan penambahan

reagen KOH 40 % dan 15 tetes larutan alpha naphtol.

28

- Uji Gelatin (Ramdany, 2008)

Uji gelatin digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme

dalam mencairkan gelatin. Cara kerja dari uji ini adalah dengan cara menusukan

isolat bakteri kedalam media semi pada yang mengandung nutrient kaldu dan

gelatin dan kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati. Gelatin yang telah

mencair setelah diinkubasi kemudia diletakkan kedalam lemari es selama 30

menit. Apabila bakteri dapat mencerna gelatin maka, media semi padat gelatin

tersebut akan tetap berbentuk cair, apabila bakteri tidak mampu mencerna

gelatin, maka media akan menjadi beku.

- Uji Sitrat (Ramdany, 2008)

Uji sitrat ini biasanya dilakukan untuk mengetahui dan menguji apakah

bakteri atau mkiroorganismee mampu memfermentasikan asam sitrat sebagai

sumber karbon satu-satunya pada media. Biasanya terjadinya fermentasi asam

sitrat terjadi dengan terjadinya perubahan warna pada media menjadi biru perusi

yang dinyatakan dengan hasil yang positif (+). Apabila tidak terjadi perubahan

warna maka, hasil yang didapatkan adalah negatif (-). Bakteri yang mengalami

perubahan menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim sitrat yang

merupakan enzim yang spesifik pembawa sitrat menuju kedalam sel.

- Uji Lisin (Wayan, 2007)

Uji lisin biasanya digunakan untuk mengetahui reaksi bakteri terhadap

asam amino, dan selain itu pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah

bakteri yang diperiksa akan membetuk asam sulfida dan terjadi perubahan pH

media.

- Uji Arginin (Ramdany, 2008)

Pada pengujian arginin cara kerja yang dilakukan hampir sama dengan

kerja uji lisin. Pengujian ini dilakukan unutk mengetahui reaksi apakah yang

terjadi pada bakteri terhadap asam amino yang lebih kompleks. Apabila uji ini

29

dinyatakan positif (+) maka bakteri mampu bereaksi dengan asam amino, dan

apabila bakteri mendapatkan hasil negatif (-) maka, bakteri tidak mampu bereaksi

dengan asam amino kompleks.

- Uji Gula-gula (Tedja, 2007)

Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu

mikroorganisme dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang

akan disertai dengan adanya pembentukan asam maupun gas yang meliputi uji :

glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, galaktosa dan maltosa.

30

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Bakteri

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan bahwa bakteri yang diisolasi

dari endofit mangrove Excoecaria agalloca mampu tumbuh dan berkembang biak

pada media uji yaitu pada media LBA (Luria bertani agar). Bakteri yang tumbuh

tersebut didapatkan dari pengenceran 10-3 - 10-6 yang telah ditanam dari endofit

mangrove Excoecaria agalloca (daun, batang, dan akar) yang telah ditumbuk

dan ditanam pada media LBA (Luria bertani agar), untuk dilakukan inkubasi

selama 24 jam. Setelah dilakukan inkubasi maka akan tumbuh koloni bakteri

yang kemudian dilakukan pemurnian koloni dengan menggunakan metode

streak kuadran. Setelah dilakukan streak kuadran kemudian dilakukan inokulasi

bakteri pada agar miring yang selanjutnya untuk dilakukan uji aktivitas L-

asparaginase. Menurut Kismiati et al. (2009), streak kuadaran dilakukan untuk

memisahkan bakteri satu dengan bakteri yang lain yang berbeda spesies pada

satu habitat yang sama. Dari penanaman yang dilakukan didapatkan 12 isolat

bakteri yang akan dilakukan untuk skrining bakteri penghasil enzim L-

Asparaginase. Isolat bakteri yang terpilih merupakan isolat yang berwarna putih

kekuningan, berbentuk bulat dengan tepian tidak rata dan membentuk elevansi

yang datar serta terpisah dari koloni yang lain. Hal tersebut sesuai dengan

pernytaan Prihanta (2008), bahwa bakteri endofit adalah bakteri yang memiliki

bentuk bulat (circulair), berwarna putih kekuningan, dan terpisah antara satu

sama lain.

Setelah didapatkan 12 isolat bakteri hasil dari pengenceran maka

dilakukan pemurnian bakteri dengan melakukan strik 3 kuadran pada media LBA

dan kemudian dilakukan inokulasi pada agar miring dan jumlah isolat dapat

dilihat pada Tabel 2.

31

Tabel 1. Endofit yang menghasilkan isolat bakteriJenis Endofit Jumlah IsolatDaun 4Batang 4Akar 4Total 12

4.2 Bakteri Penghasil L-Asparaginase

Dari 12 isolat bakteri yang didapatkan dilakukan uji skrining bakteri

penghasil L-Asparaginase dengan menggunakan media selektif L-Asparaginase.

Gambar hasil dari skrining yang telah dilakukan dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 1. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecariaagalloca, A. D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5.

Dari gambar diatas dapat diasumsikan pada tabel 2 yaitu menyatakan

bahwa bakteri endofit yang mampu untuk menghasilkan zona aktivitas enzim L-

asparaginase adalah bakteri pada D10-4 dengan lebar zona aktivitas 0,9 cm,

pada D10-5 dengan lebar zona aktivitas 0,8 cm, pada B10-4 dengan lebar zona

aktivitas 1 cm, pada B10-3 dengan lebar zona aktivitas 1,5 cm, dan pada B10-5

dengan lebar zona 1,2 cm.

32

Tabel 2. Hasil Bakteri Endofit Penghasil L-AsparaginaseKode Sampel Zona Aktivitas EnzimD10-3 -D10-4 +D10-5 +D10-6 -B10-3 ++B10-4 +B10-5 +B10-6 -A10-3 -A10-4 -A10-5 -A10-6 -

Keterangan :+++ : Zona Aktivitas Enzim Besar (2,5 – 3,4 cm)++ : Zona Aktivitas Enzim Sedang (1,5 – 2,4 cm)+ : Zona Aktivitas Enzim Kecil ( 0,5 – 1,4 cm)- : Tidak Ada Zona Aktivitas Enzim

Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas enzim L-asparaginase paling

baik adalah pada sampel B10-3 dilihat dari lebar zona berwarna biru yang telah

terbentuk pada sekitar koloni yang tumbuh. Selanjutnya akan dilakukan isolasi

dan kultur kembali untuk dilakukan uji microbact system dan pewarnaan gram.

Adanya perubahan warna pada media uji adalah terjadinya aktivitas

enzim L-asparaginase yang merubah L-asparagin menjadi asam aspartat dan

ammonia. Perubahan warna pada media uji juga disebabkan karena adanya

perubahan media yang menjadi basa (Gulati et al., 1997). Bromotymol blue

(BTB) digunakan sebagai indikator perubahan warna pada suatu media, apabila

media tersebut bersifat asam maka dengan ditambahkan dengan BTB akan

berubah warna menjadi kuning dan sebaliknya ketika media bersifat basa maka

akan berubah warna menjadi biru. BTB juga merupakan indicator warna yang

lebih menonjol dibandingkan dengan menggunakan indikator warna phenol red.

Hal tersebut dikarenakan BTB mampu memberikan kontras warna yang tajam

(biru tua pada pH basa) dan juga mampu untuk memberikan warna yang lebih

jelas pada zona yang terhidrolisis, sehingga efektif untuk menjadi indikator

33

perubahan warna pada media tumbuh mikroorganisme penghasil enzim L-

asparaginase (Mahajan et al., 2013).

4.3 Isolasi Koloni

Isolasi koloni dilakukan untuk mendapatkan isolat murni yang selanjutnya

akan digunakan untuk uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Isolat yang

akan diuji adalah isolat yang memiliki aktivitas L-asparaginase yang baik, yaitu

isolat B10-3 . Isolat murni yang telah didapatkan akan dilakukan uji pewarnaan

gram dan uji microbact system. Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis

dan spesies dari bakteri yang telah didapatkan.

Pada proses uji tersebut isolat yang telah murni ditanam pada media

TCBSA (Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar) dengan menggunakan cawan petri.

Adapun hasil isolat yang tumbuh pada media tersebut memiliki karakteristik

berwarna krem, dengan diameter koloni 3,11 mm, berbentuk bulat, tepi koloni

tidak rata, elevansi koloni datar, dan konsistensi koloni basah. Hasil isolat

tersebut dapat dilihat pada gambar 7.

4.4 Identifikasi Bakteri

Identifikasi bakteri merupakan tahapan terakhir pada penelitian ini.

Identifikasi ini dilakukan dengan uji pewarnaan gram dan uji microbact system

Gambar 2. Isolat murni dari bakteri B10-3

34

yang bertujuan untuk mengetahui sifat gram dan sifat biokimia pada bakteri yang

telah didapatkan, sehingga dapat ditentukan jenis serta spesiesnya.

4.4.1 Uji Pewarnaan Gram

Uji pewarnaan gram dilakukan untik mengetahu sel bakteri dari

pewarnaan dan bentuk dari bakteri, tergolong dalam bakteri gram positif atau

gram negatif. Apabila sel bakteri berwarna ungu maka termasuk bakteri gram

positif karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat kristal warna ungu-violet,

sedangkan apabila bakteri tersebut berwarna merah maka termasuk dalam

bakteri gram negative karena bakteri mengikat zat warna sekunder yaitu safranin.

Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet

sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri

gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan

alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak

berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan

struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).

Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut

termasuk dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu.

Bakteri tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki

diameter koloni 3,11 mm. Adapun gambar bakteri dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 3. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3

35

4.4.2 Uji Microbact System

Setelah dilakukan uji pewarnaan gram dan diketahui bahwa isolat bakteri

merupakan jenis bakteri gram positif, maka dilakukan tahap identifikasi bakteri

dengan menggunakan microbact system. Sebelum dilakukan uji microbact

system dilakukan terlebih dahulu uji oksidase, apabila uji oksidase yang telah

dilakukan hasilnya positif maka menggunakan microbact 24E, dan apabila hasil

dari uji oksidase tersebut negatif maka menggunakan microbact 12E

(Murtiningsih,1997).

Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut

memiliki uji oksidase positif, sehingga pada uji microbact system ini

menggunakan microbact 24E. Pada uji tersebut akan dilakukan uji meliputi uji

motilitas, oksidase, spora, nitrat,lysine, ornithin, H2S, glukosa, manitol, xylosa,

ONPG, indole, V-P, sitrat, TDA, gelatin, moalonat, inositol, rhammnosa, sukrosa,

laktosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin,arginin, katalase, koagulase,

hemolisa, starch hydrolysis, casein hydrolysis. Dengan hasil identifikasi yang

menyebutkan bahwa bakteri B10-3 adalah spesies Bacillus subtilis. Adapun hasil

identifikasi dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 3. Hasil Identifikasi dengan Microbact systemNo. Uji Biokimia Penelitian Bergey’s Rohmah (2017)1 Spora + + +2 Oksidase + + +3 Motilitas - + +4 Nitrat + + -5 Lysin - Tidak diuji -6 Ornithin - Tidak diuji -7 H2S - Tidak diuji -8 Glukosa + + +9 Manitol + + +10 Xylosa + + +11 ONPG + Tidak diuji +12 Indole - Tidak diuji -13 Urease - Tidak diuji -14 V-P + Tidak diuji +15 Sitrat - + -16 TDA - Tidak diuji -

36

No. Uji Biokimia Penelitian Bergey’s Rohmah (2017)17 Gelatin - + -18 Malonat - Tidak diuji -19 Inositol - Tidak diuji -20 Rhamnosa - Tidak diuji -21 Sukrosa - + -22 Lactosa - - -23 Arabinosa + + +24 Adonitol - Tidak diuji -25 Raffinosa - Tidak diuji -26 Salicin - Tidak diuji -27 Katalase + + +28 Arginin - Tidak diuji -29 Koagulase - Tidak diuji -30 Beta Hemolisa + Tidak diuji +

31Uji sensitive Novobiosin

- Tidak diuji-

32 Starch hydrolysis + + +33 Casein hydrolysis + + +

Dari hasil yang didapatkan pada Tabel 4, dapat dijelaskan sebagai

berikut:

a. Uji Fermentasi Gula

Berdasarkan hasil identifikasi bakteri dengan menggunakan uji microbact

24E, maka isolat bakteri B10-3 termasuk dalam spesies Bacillus subtilis.

Adapaun fermentasi gula-gula yang dihasilkan bernilai positif adalah glukosa,

manitol, xylosa, dan arabinosa. Sedangkan yang bernilai negatif adalah malonat,

inositol, rhamnosa, sukrosa, laktosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.

Menurut Yousef dan Clastrom (2003), umumnya bakteri menggunakan sumber

karbon dari gula-gula yang paling sederhana untuk fermentasi. Tidak adanya

sumber gula sederhana akan membuat bakteri memanfaatkan sumber gula

kompleks untuk difermentasi. Hal tersebut dapat dilihat bahwa kemampuan isolat

B10-3 dapat memfermentasi komponen gula glukosa, manitol, xylosa, dan

arabinosa.

37

b. Uji Karakteristik Biokimia

- Spora

Hasil dari pewarnaan endospora adalah positif. Pewarnaan endospora

tersebut dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya pembentukan endospora

pada bakteri. Endospora dapat dihasilkan oleh bakteri yang mampu untuk

bertahan hidup pada lingkungan yang kurang menguntungkan, misalkan pada

lingkungan yang panas, asam dan asin bakteri yang memiliki endospora dapat

bertahan hidup dan bertumbuhkembang pada lingkungan tersebut dalam jangka

waktu yang cukup lama (Travis, 2007).

Endospora merupakan struktur intraseluler yang akan terbentuk apabila

kondisi lingkungan tidak memungkinkan untuk keberlangsungan hidup sel

vegetatif bakteri. Endospora memiliki tingkat resistensi yang tinggi pada saat

kekurangan nutrient, tahan pada suhu tinggi, radiasi sinar UV, pembekuan,

kekeringan, serta terkena bajan kimia (Cappuccino dan Sherman, 2005).

- Oksidase

Hasil dari oksidase adalah positif. Dengan hasil oksidase yang positif

maka akan menentukan reagen kit yang digunakan. Karena oksidasenya positif

maka menggunakan reagen kit 24E. Tujuan dari adanya uji ini adalah untuk

mengakumulasi energi pada mikroba yang akan diuji. Oksidase pada umumnya

akan dilakan pada respirasi aerob dan menghasilkan CO2 dan H2O.

- Motilitas

Hasil dari motilitas adalah negatif. Uji ini berperan untuk mengetahui

terjadinya pergerakan pada bakteri. Menurut Volk (1988), kemampuan suatu

bakteri untuk bergerak disebut dengan motilitas. Bakteri yang mampu bergerak

disebut dengan motil dan bakteri yang tidak bergerak disebut immotile. Hal ini

disebabkan karena adanya alat motorik cambuk yang disebut dengan flagella

sehingga sel bakteri dapat bergerak pada media cair.

38

- Nitrat

Hasil dari uji nitrat adalah positif. Dengan ditandai adanya perubahan

warna medium menjadi warna merah bata. Nitrat merupakan senyawa yang

potensial untuk menggantikan peran oksigen sebagai akseptor hydrogen pada

saat pembentukan energi (Cappuccino dan Sherman, 2005).

- Lysin

Hasil dari lysine adalah negatif. Dengan ditandai adanya perubahan

warna menjadi kuning. Pemecahan lisin oleh enzim dekarboksilase akan

menghasilkan karbondioksida yang akan berperan pada pembentukan dinding

sel dan proses metabolisme sel pada mikroorganisme (Cappuccino dan

Sherman, 2005).

- Ornithin

Hasil dari ornithin adalah negatif. Dengan ditandai adanya perubahan

warna menjadi kuning. Hal tersebut menunjukan bahwa isolat bakteri tidak

mampu dalam menguraikan gugus karboksil dari ornithin.

- H2S

Hasil dari H2S adalah negatif. H2S yang dilepaskan akan berikatan

dengan Fe3+ dari ferrous ammonium sulfat pada media SIM agar akan berikatan

danmembentk endapan ferrous berwarna hitam, endapan tersebut dapat terlihat

disepanjang inokulasi dan menunjukkan bahwa adanya reaksi positif, adapun

sebaliknya jika tidak terjadi perubahan apapun pada media, maka menunjukkan

reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 2005).

- ONPG

Hasil dari ONPG positif, ditandai dengan adanya perubahan warna

menjadi kuning. Reaksi yang terjadi yaitu hidrolisis o-nitrofenil-β-d-

galactopyranoside (ONPG) melalui β-galactosidase.

39

- Indol

Hasil dari indol adalah negatif, hal tersebut berarti bahwa bakteri tidak

dapat menghasilkan indol yang akan tampak seperti cincin berwarna merah pada

proses reaksi deaminasi dan asam piruvat yang akan dimanfaatkan pada saat

proses fermentasi. Uji indol bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan bakteri

dalam menghasilkan indoldengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe,

2011). Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase akan menghidrolisis

tryptophan menjadi indol, piruvat dan ammonia. Dengan demikian dapat

digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, yaitu sebuah tes yang dirancang

untuk membedakan antara anggota keluarga dari Enterobacteriaceae (Farmer et

al., 1985).

- Urease

Hasil uji urease adalah negatif, hal ini ditunjukkan karena tidak adanya

perubahan warna pada media uji. Uji urease dilakukan untuk mengidentifikasi

mikrorganismee yang mampu untuk menghidrolisis urea yang dapat

menghasilkan ammonia dan karbondioksida. Urea yang akan dihidrolisis oleh

mikroorganisme yang memiliki positif urease akan menjadi ammonia dan dapat

mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari orange

menjadi merah muda (Leboffe, 2011).

- V-P

Hasil dari V-P adalah positif, hal ini ditunjukkan dengan adanya

perubahan warna menjadi merah muda. Uji V-P dilakukan untuk mendeteksi

acetion dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan

alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu Viges Proskauer yang telah

diinokulasi dengan bakteri. Uji ini bergantung terhadapt tingkat pencernaan

glukosa menjadi acetymethylcarbinol. Apabila glukosa pecah, maka akan

bereaksi dengan alpha-naftol dan kalium hidroksida untuk membentuk warna

40

merah muda. Alpha-naftol dan kalium hidroksida merupakanbahan kimia yang

dapat mendeteksi adanya acetoin (Sridhar, 2006).

- Sitrat

Hasil uji menunjukkanbahwa sitrat adalah negatif, hal tersebut

dikarenakan tidak adanya perubahan warna. Uji sitrat dilakukan untuk

mendeteksi tingkat kemampuan suatu organisme untuk memanfaatkan sitrat

sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan

sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, dan akan menghasilkan

karbondioksida yang akan digabungkan dengan natrium dan air untuk

membentuk natrium karbonat yang merupakan produk alkaline yang membuat

perubahan warna dari hijau menjadi biru dan menunjukkan tes positif

(Sridhar,2006).

- TDA

Hasil dari uji TDA adalah negatif, karena tidak adanya perubahan warna.

Hasil negatif juga dikarenakan bakteri tidak memiliki enzim tryptophan

deaminase, sehingga tidak dapat membentuk asam indolepiruvate dari

tryptophan yang menghasilkan warna coklat dengan adanya ion ferric dari TDA

reagent.

- Katalase

Hasil uji katalase adalah positif. Hal tersebut dapat diartikan bahwa

bakteri tersebut mampu untuk menghasilkan enzim katalase. Uji ini dilakukan

untuk mengetahui kemampuan isolat dalam menghasilkan enzim katalase dan

memiliki toleransi terhadap oksigen. Menurut Brooks et al. (2005), enzim katalase

merupakan enzim yang dapat mengkatalis secara langsung konversi hydrogen

proksida (H2O2) yang bersifat toksik pada sel bakteri menjadi air (H2O) dan

oksigen (O2).

41

Uji katalase dilakukan dengan cara member 1-2 tetes H2O2, pada kultur

bakteri uji yang memiliki umur 24 jam. Adanya reaksi positif pada uji katalase ini

akan ditunjukan dengan terbentuknya gelembung-gelembung. Gelembung

tersebut berarti terdapat pembentukan gas O2 pada bakteri uji. Dengan

terbentuknya gas dapat diartikan bahwa bakteri Bacillus subtilis merupakan

bakteri aerob. Menurut Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Sevent

Edition oleh Breed et al. (1957), dikatakan bahwa bakteri Bacillus subtilis

merupakan bakteri aerob, dengan strain anaerob fakultafif. Bakteri tersebut akan

tumbuh sedikit apabila glucose broth dalam keadaan anaerob. Untuk kultur yang

memiliki umur 14 hari akan memiliki pH 5,5 atau lebih.

Mikroorganisme yang terdapat pada tanaman mampu memproduksi

berbagai metabolit sekunder yang memiliki kemampuan sebagai antibakteri.

Sumber daya mikroorganisme tersebut dikenal dengan mikroba endofit. Mikroba

endofit merupakan mikroorganisme yang sebagian atau seluruh siklus hidupnya

berada pada jaringan tumbuhan (batang, cabang, ataupun ranting), yang

keduanya dapat menjalin hubungan yang saling menguntungkan (Kumala et al.,

2006).

4.4.3 Bacillus subtilis

Klasifikasi Bacillus subtilis Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

(1957) :

Kingdom : ProcaryotaeDivisi : BacteriaClass : SchizomycetesOrdo : EubacterialesFamili : BaciliaceaeGenus : BacillusSpesies : Bacillus subtilis

Dari hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut termasuk

dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu. Bakteri

42

tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki diameter

koloni 3,11 mm. Memiliki reaksi oksidase dan katalase positif. Dengan warna

koloni krem dan berbentuk bulat. Memiliki tepi koloni yang tidak rata, elevansi

koloni datar, dan konsistensi koloni basah.

Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif, memiliki bentuk batang yang

membentuk rantai, terdapat beberapa spesies aerob obligat dan juga anaerob

fakultatif, memiliki endospora sebagai struktur yang mampu bertahan pada

kondisi lingkungan yang tidak mendukung. Suhu optimum pada pertumbuhan

Bacillus subtilis adalah 30-37°C, dengan suhu minimum 18°C dan maksimum

43°D (Korsten dan Cook, 1996).

Pada Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, edisi ke-2 (2004),

disebutkan bahwa sel Bacillus subtilis berukuran 1 x 3,4 µm, berbentuk batang

dan tersusun menjadi rantai yang panjang. Dengan memiliki spora yang terletak

pada tengah sel, tidak bergerak dan memiliki flagella (Jawetz et al., 1996).

Pada GRAS Notice (GRN) No. 649 dijelaskan bahwa Bacillus subtilis

adalah bakteri non-patogen dan non-tosik yang merupakan bakteri gram positif

dan memiliki karakteristik yang baik serta banyak digunakan pada produksi food-

grade enzyme. Bacillus subtilis merupakan mikroorganisme saprophytic yang

dapat ditemukan dimana-mana, biasanya dapat ditemukan di air, tanah, udara,

dan residu pada tanaman yang membusuk.

43

5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka dapat diambil

kesimpulan bahwa terdapat isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan enzim

L-asparaginase dari akar, batang, dan daun mangrove Excoecaria agalloca adalah

isolat D10-4, D10-5, B10-3, B10-4 dan B10-5.

Isolat B10-3 adalah bakteri gram positif dan menurut uji microbact system

yang telah dilakukan bakteri tersebut adalah spesies Bacillus subtilis.

5.2 Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka disarankan untuk

melakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan uji secara genotip dengan

identifikasi molekular gen penyandi 16S r-RNA.

44

DAFTAR PUSTAKA

Antara, N.S. 2009. Mengurangu Pembentukan Akrilamida dengan MenggunakanEnzim dan Mikroba pada Produk Pangan. FTP. UNUD.

Arrizal, S., Rachmadiarti, F., dan Yuliani. 2013. Identifikasi Rhizobakteri padaSemanggi (Marsilea crenata Presl.) yang Terpapar Logam Berat Timbal (Pb).Lent. Bio. 2(1):165-169.

Ballows, A. Butnick, S. and Loyd, J. R. 1991. Manual of Clinical Micorbiology.Washington DC. Press.

Borek, D., dan Jaskolski, M. 2001. Sequence Analysis of Enzymes withAsparaginase Activity. 48(2): 893-902.

Breed, R.S., Murray, E.G.D., dan Smith, N.R. 1957. Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology Seventh Edition. The Williams and WilkinsCompany. 620-621 hlm.

Brock, T.D and Brock, K.M. 1978. Basic Microbiology with Application. 2nd edition.New Jersey : Prentice Hall.

Brooks, G.F., Butel, J.S., dan Morse, S.A. 2005. Mikrobiologi Kedokteran Jilid I.Jakarta: Salemba Medika.

Cappuccino, J. .G dan Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. TheBenjamin/Cumming Publish. USA: 458.

Ciesarova, Z., Kiss, E., dan Boegl, P. 2006. Impact of L-asparaginase on AcrylamideContent In Potato Products. J. Food Nutr Res. 45(1): 141-146.

Darmayasa, I.B.G. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pendegradari Lipid (Lemak)pada Beberapa Tempat Pembuangan Limbah Estuari DAM Denpasar. J.Bumi Lestari. 8(1): 122-127.

Didje, N. Dan Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Farmasi.Universitas Hassanudin. Makasar.

El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J. 2004. Pruduction, Isolation, andPurification of L-Asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 usingSolid-state Fermentation. J. Biochem and Mol Bio. 4(37): 387-393.

El-Naggar, N.E., El-Ewasy. S., and El-Shweihy. N.M. 2014. Microbial L-Asparaginase as a Potential Therapeutic Agent for the Treatment of AcuteLymphoblastic Leukimia : The Pros and Cons. Int J. Phrm.10(4): 1811-7775.

Farmer, J. J., Clin, J., dan Micro, J. 1985. Biochemical Identificatiom of New Speciesand Biogroups of Enterobacteriaceae Isolatd from Clinical Specimens. J.ClinMicro. 21(1): 46-76.

45

Gulati, R., Saxena, R.K., dan Gupta, R. 1997. A Rapid Plate Assay for Screening L-Asparaginase Producing Micro-Organismes. Lett Appl. Micro. 24(1): 23-26.

Hadioetomo, R.S. 1995. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT. Gramedia. Jakarta.

Hendriksen, H. V., Kornbrust, B. A., Ostergaard, P.R., dan Stringer, M.A. 2009.Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range ofFood Products using an Asparaginase from Aspergillus oryzae. J. Agri.andFood Chem. 57(10): 4168-4176.

Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi ke-20. Penerbit Buku Kedokteran : Jakarta.

Jayam, D. G. and Kannan,S. 2014. The Various Sources of L-Asparaginase. Int. J.Rec Sci Res. 5(2): 34-346.

Kasi, Y.A., Posangi, J., Wowor, P.M., dan Bara, R. 2015. Uji Efek Antibakteri JamurEndofit Daun Mangrove Avecennia marina Terhadap Bakteri UjiStaphylococcus aureus dan Shigella sysenteriae. J. e-Bm. 3(1): 112-117.

Kharisma dan Abdul. 2012. Aktivitas Asam Proteolitik Bakteri Asam Laktat dalamFermentasi Susu Kedelai. UGM: Yogyakarta.

Kishore, V., Nishita, K.P., and Manonmani, H.K. 2015. Cloning, Expression andCharacterization og L-Asparaginase from Pseudomonas fluorescens forLarge Scale Production in E. coli BL21. Spring 3 Bio 5(1):975-981.

Kismiyati., Subekti, S., Yusuf, R.W.N., dan Kusdarwati, R. 2009. Isolasi danIdentifikasi Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Mas Koki (Carassiusauratus) Akibat Interfasi Ekoparasit Argulus sp. J. Ilm Per dan Kel. 1(2):129-134.

Korsten, L dan Cook, N. 1996. Optimizing Culturing Condition for Bacillus Subtilis. SAfri Avoc Grow Assosi Yb. 19 (1): 54-58.

Kumala, S., Fransisca, S., dan Priyo, W. 2006. Aktivitas Antimikroba MetabolitBioaktif Mikroba Endofitik Tanaman Trengguli (Casska fistula L.). J. FarmInd. 3(2): 97-102.

Kurniasari, R.M. 2005. Pengaruh Logam Berat Terhadap PertumbuhanMikroorganisme Pendegradari Minyak Diesel. SKRIPSI. Bogor: IPB.

Lay, B. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada: Jakarta.

Leboffe, M.J. dan Pierce, B.E. 2011. A Photographic Atlas for The MicrobiologyLaboratory. 4Th Edition. Morton Publishing Company. USA.

Lehninger, A. L. 1990. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa Dr. Ir. MaggyThenawidjaja. Bandung: Erlangga.

46

Mahajan, R.V.,Saran, S., Saxena, R.K., dan Srivastava, A.K. 2013. A Rapid,Efficientand Sensitive Plate Assay for Detection and Screening of L-Asparaginase-producing Microorganismes. FEMS Microbiol Lett. 1-5 hlm.

Makky, E.A., Ong, J.J., Karim, M.R., and Lee, C.M. 2013. Production andOptimization of L-Asparaginase by Bacillus sp. KK2S4 from Corn Cob. Afr J.Biotechnol. 12(19): 2654-2658.

Martuti,N.K.T.2013. Keanekaragaman Mangrove di Wilayah Tapak, Tugurejo,Semarang. J. MIPA. 36(2): 123-130.

Mayati, B. 2013. Identifikasi Keragaman Bakteri pada Comeal Seed PengolahanLimbah Cair Cat. IPB: Bogor.

Meiyanto, E. 2008. Efek Kemopreventif Ekstrak Etanolik Gynura procumbens (Lour.)Merr Pada Karsinogenesis Kanker Payudara Tikus. Maj Fari Ind. 18(3): 154-161.

Mungi, H., Carvalho, R., Ilegar, S., Ratnamala, G.M., and Priya, V.G.S. 2014.Optimization of L-Asparaginas Production from Pseudomonas fluorescens byResponse Surface Methodology. Int J. Cur Microbiol Appl Sci. 3(11): 350-362.

Murray, P. 2003. Isolation,Purification and Charaterization of The XylanaseProduced by Arthobacter sp. National Institute of Oceanography. DonaPaula.

Murtiningsih. 1997. Evaluation Of The SerobactTM And MicrobactTM System For TheDetection And Identification Of Listeria Spp. Department of Food Scienceand Technology, The university of New South Wales, Sydney, NWS,Australia.

Muslim, S.N., Al-Kadmy, I.M.S., Hussein, N.H., Ali, A.N.M., and Dwaish, A.S. 2015.Enhancement of the Activity and Stability of L-Asparaginase Food AdditivePurified from Acinetobacter baumannii as Anticarcinogenic in ProcessedFoods. Int J. Adv Chem Engg and Bio Sci. 2(1): 1349-1507.

Nikaido, H. 1996. Outer Membrane In: Escherichia coli and Salmonella lyphimurium:Cellular and Molecular Biology. American Society of Microbiology Press.

Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari DaerahBekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. J.Natur Ind. 6(2): 67-74.

Noor, Y.R., Khazali, M., dan Suryadiputra, I.N.N. 1999. Panduan PengenalanMangrove di Indonesia. Wetlands International Indonesia Programme: Bogor.

Norman, P. 2008. Asam Indol Asetat yang Dihasilkan Azosprillium sp. J. AgroBiogen. 3(2): 66-72.

47

Pastra, D. A., Melki., dan Surbakti, H. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosisdengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari PerairanPulau Tegal Lampung. Masp J. 4(1): 77-82.

Presscott. 2002. Laboratory Excercise In Microbiology. The Mac-Graw HillCompanies. New York.

Prihanto, A. A., Firdaus, M., dan Nurdiani, R. 2011. Endophytic Fungi Isolatt from(Rhyzopora mucronata) and Its Antibacterial Activity on Staphylococcusaureus and Escherichia coli. J. Food Sci Engineer. 1(1): 386-389.

Rakhmawati, A. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. FMIPA. Yogyakarta: UNY.

Ramdany. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolitycus Dengan Metode BiologiSecara PCR. J. Sain Tek Farm. 13(1): 1-7.

Richana,N., Lestina, P., dan Irawadi,T.T. 2004. Karakterisasi Lignoselulosa DariLimbah Tanaman Pangan dan Pemanfaatannya Untuk Pertumbuhan BakteriRXA III-5 Penghasil Xilanase. J. Pen Pert Tanam Pangan. 23(3): 171-176.

Rohmah, N. S. 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Berpotensi sebagai AgenBioremediasi Timbal (Pb) dari Lumpur Lapindo. Skripsi. UIN : Malang.

Safnowandi. 2015. Struktur Komunitas Mangrove Di Teluk Poton Bako SebagaiBuku Panduan Untuk Pemantapan Konsep Ekosistem Pada guru BiologiSMA Di Kabupaten Lombok Timur. J. Ilmi IKIP Mataram. 2(1): 2355-2358.

Sartiono, A. 2007. Profil Mangrove Taman Nasional Baluran. FMIPA ITS : Surabaya.

Sinaga, E., Noverita., dan Fitria, D. 2009. Daya Antibakteri Jamur Endofit yangDiisolasi dari Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galangal Sw.). J, FarmInd. 4(4): 161-170.

Sridhar, R. P.N. 2006. Polymerase Chain Reaction (PCR). Dept. Of Microbiology.JJMMC. Davangere.

Suryabrata, S. 1983. Metodologi Penelitian Ilmiah. Raja Grafindo. Jakarta.

Tedja, I. 2007. Seleksi Galur-galur Bradyrhizobium japanicum Resisten LogamBerat. Laporan Penelitian KB VI. FMIPA IPB. Bogor.

Tittsler, M. 1996. Introduction to Soil Microbiology. 2 ed. Willey Eastern Limited, NewDelhi.

Volk, S. 1988. Mikrobiologi Dasar. Erlangga: Jakarta.

Wahyunio. 2011. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta.

Wayan, dan Qomariah. 2007. Isolasi dan Identifikasi E.coli. Bali J. 52 hlm.

48

Wedhastri, S. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacterspp. Pengahsil Faktor Tumbuhdan Penghambat Nitrogen dari Tanah Masam. J. Ilmu Tanah dan Lingk. 3(1):45-51.

Yousef, A.E dan Clastrom, C. 2003. Food Microbiology (A Laboratory Manual).Wiley-interscience, John Wiley and Sons, Inc. Ohiostate University : USA.

Yulvizar, C. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.Biospecies. 6(2): 1-7.

Yuniarsih, M. 2012. Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari n-HeksanaBuah Ketapang (Terminalia catappa) sebagai Inhibitor α-Glukosidase danPenapisan Fitokimia dari Fraksi Teraktif. UI: Depok.

isolasi dan skrining bakteri endofit penghasil enzim l ...repository.ub.ac.id/4478/1/rizki nur...

Documents