uin syarif hidayatullah jakarta isolasi...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

EKSTRAK KAPANG ENDOFIT DARI DAUN SALAM

[Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] TERHADAP

BAKTERI Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

DAN Staphylococcus aureus

SKRIPSI

RAHMAT GEVANO

NIM: 1112102000031

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

MARET 2017

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

EKSTRAK KAPANG ENDOFIT DARI DAUN SALAM

[Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] TERHADAP

BAKTERI Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

DAN Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RAHMAT GEVANO

NIM: 1112102000031

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

MARET 2017

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SENDIRI,

DAN SEMUA SUMBER YANG DIKUTIP MAUPUN DIRUJUK

TELAH SAYA NYATAKAN DENGAN BENAR

Nama : Rahmat Gevano

NIM : 1112102000031

Tanda tangan :

Tanggal : 2 Maret 2017

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING


NIM : 1112102000031

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi dan uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

dari Daun Salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.]

Terhadap Bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

dan Staphylococcus aureus

Disetujui oleh

Pembimbing 1 Pembimbing 2

Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.sc, Apt Eka Putri, M.si., Apt

NIP.130702177 NIP.197905172009122002

Mengetahui ,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Dr. Nurmelis, M.Si.Apt

NIP.197404302005012003

v

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh :


NIM : 1112102000031


Judul Skripsi : Isolasi dan uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

dari Daun Salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.]

Terhadap Bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

dan Staphylococcus aureus

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada

Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan,

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

Dewan Penguji

Pembimbing I : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.sc, Apt

Pembimbing II : Eka Putri, M.si., Apt

Penguji I : Puteri Amelia, M. Farm., Apt

Penguji II : Hendri Aldrat, PhD., Apt

Ditetapkan di : Ciputat

Tanggal : 2 Maret 2017

vi

ABSTRAK


NIM : 1112102000031


Judul : Isolasi dan uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

Daun salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] Terhadap

bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan

Staphylococcus aureus

Daun salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] merupakan salah satu tanaman

yang banyak ditemui di indonesia dan memiliki kandungan minyak atsiri, tanin, dan

flavonoid. Ekstrak daun salam dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri. Kapang

endofit adalah kapang yang hidup pada jaringan tumbuhan dan memiliki

kemampuan senyawa yang mirip atau menghasilkan aktivitas sama seperti

inangnya. Tujuan dari penelitiaan ini adalah untuk mengisolasi kapang endofit pada

daun salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] dan menguji aktivitas

ekstraknya sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923

dengan menggunakan metode difusi cakram. Tahapan dalam penelitian ini adalah

isolasi kapang endofit, karakterisasi kapang endofit, pemurnian kapang endofit,

identifikasi bakteri uji, fermentasi kapang endofit, ekstraksi kapang endofit dan uji

aktivitas ekstrak kapang endofit. Kapang endofit yang dihasilkan dari proses isolasi

sebanyak 5 isolat. Isolat kapang endofit difermentasi statis selama 21 hari dengan

medium PDY (Potato Dextrose Agar), kemudian dilakukan ekstraksi kapang

endofit dengan metode maserasi menggunakan metanol dan ekstraksi media cair

kapang endofit dengan metode partisi, dan ekstraknya digunakan untuk uji aktivitas

antibakteri dengan menggunakan metode difusi cakram. Dari 20 fraksi ekstrak

kapang endofit yang didapatkan, hanya fraksi air dan etil asetat DSM 1B, dan fraksi

air DSM 2B yang menunjukan aktivitas antimikroba.

Kata kunci : Antibakteri, daun salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.], difusi

cakram, ekstrak kapang endofit, kapang endofit

vii

ABSTRACT


NIM : 1112102000031


Judul : Endophyte fungi extract antibacterial activity test from bay

leaves [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] on

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and

Staphylococcus aureus bacteria

Bay leaves [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] is a plant than can be easily

found in indonesia and containing such compund like essential oil, tannin, and

flavonoid. Bay leaves extract was reported have antibacterial activity. Fungi

endophyte is a fungi that can live on plant tissues and have ability to produce

compund that have simialiar activity with its host. The purpose of this research is

to isolate the endophyte fungi from bay leaves and [Syzygium polyanthum (Wight)

Walp.] and test its extract activity as antibacterial on Escherichia coli ATCC 25922,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923

bacteria using disc diffusion method. The steps used in this research was including

isolation, characterization, purification, bacteria identification, endophyte fungi

fermentation, extraction and its extract antibacterial activity test. 5 fungi endhopyte

isolate successfully isolated. These isolate then fermented for 21 days in PDY

(Potato Dextrose Agar) medium. Then, endophytic fungi was extracted by

maceration method using methanol and the liquid medium was extracted with

partition method, and the extract is used for antibacterial activity test usung disc

diffusion method. From 20 endophytic fungi extract fractions obtained, only water

and ethyl acetate fraction of DSM 1B and water fraction of DSM 2B shows

antimicrobial activity against bacteria tested.

Key words : Antibacterial, disc diffusion, Bay leaves [Syzygium polyanthum

(Wight) Walp.], endophyete fungi, endophyete fungi extract

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim

Alhamdulillah, segala puji syukur selalu terpanjatkan atas segala nikmat,

karunia, dan ilmu yang bermanfaat yang diberikan oleh Allah Subhanahuwata’ala,

sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini.

Shalawat sertasalam senantiasa tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW,

beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir nanti semoga kita

mendapat syafaat dari beliau. Aamiinyaarabbal ‘alamin.

Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit dari

Daun Salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.] Terhadap Bakteri Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus” ini disusun untuk

memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi di program studi

farmasi, fakultas kedokteran dan ilmu kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Selama proses penyusunan dan penulisan laporan ini, penulis mendapatkan

begitu banyak bantuan dari berbagai pihak yang telah meluangkan waktunya,

mendidik dan membimbing, dan mendoakan yang terbaik kepada penulis. Maka

pada kesempatan kali ini, penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya

dan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes., selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.sc, Apt dan Ibu Eka Putri, M.Si., Apt., Sebagai

pembimbing 1 dan pembimbing 2 yang dengan sabar senantiasa meluangkan

waktu dan pikirannya untuk membimbing dan mendidik penulis

4. Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.sc, Apt selaku dosen pembimbing akademik yang

setia membimbing dan memberikan arahan selama kuliah.

5. Bapak dan ibu dosen program studi farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

memberikan ilmunya kepada penulis.

ix

6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Gevisioner dan ibunda Dessi Rahmawati

yang selalu memberikan doa, ,dukungan moril maupun material dan selalu

memberi semangat dikala penulis sedang kesulitan. Semoga Allah SWT

membalasnya memberikan rezeki yang berlimpah serta keselamatan dunia dan

akhirat

7. Diri penulis sendiri yang tidak disangka-sangka rupanya bisa juga

menyelesaikan skripsi.

8. Uzumaki Naruto dan Uchiha Sasuke, yang selalu menemani hari-hari penulis

dengan kisahnya yang menarik sejak penulis duduk di sekolah dasar sampai

penulis akhirnya bisa menyelesaikan skripsi ini.

9. Teman-teman seperjuangan Mahasiswa/i S1 Farmasi UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta angkatan 2012 Yang selalu penuh kebersamaan dan berjuang bersama.

10. Teman-teman penelitiaan endofit Adia, Fadil, Lilis, Eha, Okin, Wida, Zulfa,

Gunawan, Dimut, yang bersama-sama dalam melakukan penelitian baik suka

maupun duka. Terutama Fadil dan Gunawan yang selalu bersama-sama dalam

melakukan uji aktivitas antibakteri selama sebulan penuh.

11. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis selama ini yang tidak bisa

penulis sebut satu per satu.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala

bantuan dan dukungannya kepada penulis. Penulis menyadari bahwa dalam

penulisan skripsi ini masih banyak kelemahan dan kekurangan. Maka dari itu,

segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan kritik dan saran pembaca agar

lebih sempurnanya skripsi ini.

Jakarta, Maret 2017

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 1112102000031


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya dengan judul:

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG

ENDOFIT DARI DAUN SALAM [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.]

TERHADAP BAKTERI Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan

Staphylococcus aureus

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai Undang-Undang Hak Cipta. Demikian

persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada tanggal : 2 Maret 2017

Yang menyatakan,

(Rahmat Gevano)

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ......................................... iii

HALAMAN PERTUJUAN PEMBIMBING ............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... v

ABSTRAK .................................................................................................... vi

ABSTRACT .................................................................................................. vii

KATA PENGANTAR .................................................................................. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............. x

DAFTAR ISI ................................................................................................. xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xv

BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................................... 4

1.3 Hipotesis ......................................................................................... 4

1.4 Tujuan Penelitian ............................................................................ 4

1.5 Manfaat Penelitian .......................................................................... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 5

2.1 Kapang Endofit ............................................................................... 5

2.2 Metabolit Sekunder Kapang Endofit .............................................. 6

2.3 Fermentasi ...................................................................................... 7

2.4 Daun Salam (Syzygium polyanthum Wight) ................................... 10

2.4.1 Klasifikasi Tanaman .............................................................. 10

2.4.2 Nama Daerah ......................................................................... 11

2.4.3 Deskripsi Tanaman ................................................................ 11

2.4.4 Tempat Tumbuh ..................................................................... 12

2.4.5 Kandungan Kimia .................................................................. 12

2.4.6 Kegunaaan Tradisional .......................................................... 12

2.5 Bakteri Uji ...................................................................................... 12

2.5.1 Escherichia coli ..................................................................... 12

2.5.2 Pseudomonas aeruginosa ...................................................... 13

2.5.3 Staphylococcus aureus ........................................................... 14

2.6 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri ............ 14

2.7 Antibakteri ...................................................................................... 15

2.8 Uji Aktivitas Antibakteri ................................................................ 16

BAB 3 METODE PENELITIAN ................................................................ 18

3.1 Tempat dan Waktu.......................................................................... 18

3.2 Alat ................................................................................................. 18

3.3 Bahan .............................................................................................. 18

xii

3.3.1 Tanaman Uji .......................................................................... 18

3.3.2 Bahan Kimia .......................................................................... 19

3.3.3 Medium .................................................................................. 19

3.3.4 Bakteri Uji .............................................................................. 19

3.4 Prosedur Penelitian ......................................................................... 19

3.4.1 Pembuatan Medium Isolasi, Media Peremajaan,

dan Medium Pemeliharaan ................................................... 19

3.4.2 Pembuatan Medium Perbanyakan ........................................ 20

3.4.3 Pembuatan Medium Fermentasi ........................................... 20

3.4.4 Pembuatan Medium Pengujian Aktivitas Antibakteri .......... 20

3.4.5 Isolasi Kapang Endofit ......................................................... 21

3.4.6 Pengamatan Morfologi Kapang Endofit .............................. 22

3.4.7 Fermentasi ............................................................................ 22

3.4.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi ................................................... 23

3.4.9 Peremajaan Bakteri Uji ........................................................ 23

3.4.10 Uji Aktivitas Antibakteri ...................................................... 23

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 26

4.1 Hasil Determinasi Tanaman ........................................................... 26

4.2 Penyiapan Sampel .......................................................................... 26

4.3 Hasil Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit ................................. 28

4.4 Hasil karakterisasi isolat kapang endofit ........................................ 30

4.4.1 Isolat DSM 1B ....................................................................... 31

4.4.2 Isolat DSM 2B ....................................................................... 32

4.4.3 Isolat DSM 3A ....................................................................... 33

4.4.4 Isolat DSS 3A ........................................................................ 34

4.4.5 Isolat DSS 3B ......................................................................... 35

4.5 Ekstraksi Hasil Fermentasi ............................................................. 36

4.6 Hasil Identifikasi Bakteri Uji .......................................................... 38

4.7 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri ....................................................... 39

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 44

5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 44

5.2 Saran .............................................................................................. 44

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 45

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Pohon salam ............................................................................. 10

Gambar 2.2 Daun salam ............................................................................... 10

Gambar 2.3 Daun salam dan tangkai .......................................................... 10

Gambar 4.1 Sampel daun salam ................................................................... 27

Gambar 4.2 Isolat DSM 1B tampak depan dan belakang ............................ 31

Gambar 4.3 Hasil pengamatan isolat DSM 1B pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali ................................................................ 31

Gambar 4.4 Isolat DSM 2B tampak depan dan belakang ............................ 32

Gambar 4.5 Hasil pengamatan isolat DSM 2B pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali ................................................................ 32

Gambar 4.6 Isolat DSM 3A tampak depan dan belakang ............................ 33

Gambar 4.7 Hasil pengamatan isolat DSM 3A pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali ................................................................ 33

Gambar 4.8 Isolat DSS 3A tampak depan dan belakang ............................. 34

Gambar 4.9 Hasil pengamatan isolat DSS 3A pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali ................................................................ 34

Gambar 4.10 Isolat DSS 3B tampak depan dan belakang ............................. 35

Gambar 4.11 Hasil pengamatan isolat DSS 3B pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali ................................................................ 35

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Hasil Isolasi Kapang Endofit Daun Salam .................................... 29

Tabel 4.2 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi metanol ............................... 37

Tabel 4.3 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi n-heksan ............................. 37

Tabel 4.4 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi etil asetat ............................ 37

Tabel 4.5 Hasil uji kemurnian bakteri secara mikroskopik ........................... 39

Tabel 4.6 Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji ......................... 40

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan tahapan penelitian .......................................................... 49

Lampiran 2. Tahapan isolasi kapang endofit ................................................ 50

Lampiran 3. Tahapan pemurnian .................................................................. 51

Lampiran 4. Pengamatan morfologi kapang ................................................. 52

Lampiran 5. Fermentasi ............................................................................... 53

Lampiran 6. Ekstraksi kapang endofit .......................................................... 54

Lampiran 7. Pembuatan inokulum bakteri .................................................... 55

Lampiran 8. Pembuatan suspensi bakteri ...................................................... 56

Lampiran 9. Uji aktivitas antibakteri ............................................................ 57

Lampiran 10.Tanaman sampel ....................................................................... 58

Lampiran 11.Surat hasil determinasi sampel ................................................. 59

Lampiran 12.Hasil fermentasi ........................................................................ 60

Lampiran 13.Ekstrak kental hasil evaporasi .................................................. 61

Lampiran 14.Fraksi air ................................................................................... 62

Lampiran 15.Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji

Eschericia coli .......................................................................... 63

Lampiran 16.Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji

Pseudomonas aeruginosa ........................................................ 64

Lampiran 17.Hasil uji aktivitas anti bakteri terhadap bakteri uji

Staphylococcus aureus .............................................................. 65

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman merupakan salah satu sumber daya alam yang memiliki

banyak manfaat dalam kelangsungan hidup manusia, khususnya dalam

bidang kesehatan. Hal ini didukung dengan penyataan Radji (2005) yang

mengatakan bahwa tanaman merupakan salah satu sumber daya alam yang

digunakan untuk pengobatan dan mempertahankan kesehatan masyarakat.

WHO (World health Organization) juga mengeluarkan pernyataan yang

mengungkapkan bahwa saat ini sekitar 80% jumlah dari penduduk dunia

masih menggunakan obat-obatan tradisional yang berasal dari tanaman

(Radji, 2005).

Masyarakat di Indonesia sendiri masih banyak yang menggunakan

tanaman sebagai sumber obat- obatan tradisional, contohnya penggunaan

daun jarak untuk mengobati panas dalam, dan daun sirih untuk mengobati

batuk dan panas (Sudirga, 2012). Banyaknya penggunaan tanaman sebagai

obat-obatan tradisional ini dikarenakan adanya faktor Indonesia sebagai

salah satu negara yang memiliki keanekaragaman hayati sangat besar di

dunia.

Keanekaragaman hayati yang besar ini seharusnya dapat

dimanfaatkan untuk pengembangan obat-obatan khususnya obat-obatan

yang berasal dari tanaman. Penggunanaan tanaman sebagai bahan baku

obat-obatan didasarkan kepada kemampuan tanaman untuk memproduksi

metabolit sekunder yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat dari

berbagai penyakit (Radji, 2005).

Penyakit yang menyerang manusia sekarang banyak yang

disebabkan oleh bakteri patogen dan dibutuhkan antibiotik untuk mengatasi

penyakit-penyakit yang disebabkan oleh bakteri tersebut, akan tetapi

efektifitas dari penggunaan antibiotik di seluruh dunia saat ini sedang

mengalami krisis karena cepatnya laju perkembangan resistensi bakteri

2


tehadap antibiotik. Perkembangan resistensi bakteri terhadap antibiotik ini

disebabkan karena adanya penyalahgunaan dan pemakaian antibiotik yang

berlebihan serta karena kurangnya pengembangan antibiotik baru oleh

industri farmasi dikarenakan oleh berbagai macam faktor seperti faktor

ekonomi (Ventola, 2015). Oleh karena itu, salah satu langkah yang dapat

dilakukan untuk menghadapi krisis efektifitas antibiotik ini, dapat dilakukan

dengan pengembangan antibiotik baru seperti dengan cara penemuan isolat

mikroba endofit baru maupun dengan sintesis kimia.

Sampai saat ini, sudah banyak cara yang dilakukan untuk

memperoleh sumber daya yang dapat digunakan sebagai bahan baku

antibiotik baru, salah satu cara tersebut adalah dengan mengeksplorasi

mikroba endofit. Mikroba endofit memiliki potensi sebagai bahan baku

obat-obatan karena kemampuannya memproduksi metabolit sekunder yang

sama ataupun mirip dengan tanaman inangnya. Mikroba ini biasanya dapat

ditemui ditanaman dalam bentuk bakteri maupun fungi (Alvin, Miller, &

Neilan, 2014).

Penggunaan mikroba endofit baru sebagai alternatif untuk

memperoleh sumber daya untuk bahan baku obat juga memiliki manfaat

terhadap alam karena sifatnya yang ramah lingkungan. Hal ini disebabkan

untuk mengisolasi suatu mikroba endofit hanya dibutuhkan sampel tanaman

yang sedikit dan tidak perlu sampai menebang inangnya yang terkadang

membutuhkan waktu bertahun-tahun untuk tumbuh kembali (Radji, 2005).

Indonesia memiliki banyak tanaman yang memiliki potensi sebagai

bahan baku untuk antibiotik, salah satu tanaman tersebut adalah tanaman

salam. Tanaman salam adalah tanaman herbal yang memiliki potensi

sebagai bahan baku antibiotik, hal ini diperkuat dengan adanya penelitian

yang hasilnya menunjukan bahwa ekstrak etanol, ekstrak etil asetat dan

ekstrak campuran (etanol;etil asetat) dari daun tanaman salam memiliki

aktivitas anti bakteri terhadap bakteri Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa dan Staphylococcus aureus (Murhadi, Suharyono, & Susilawati,

2007).

3


Alasan penggunaan daun pada penelitian ini disebabkan karena daun

salam banyak digunakan di masyarakat secara tradisional baik untuk bumbu

dapur maupun mengobati gangguan pada sistem pencernaan (Nuratmi,

Winarno, & Sundari, 1999). Pada penelitian sebelumnya juga sudah terbukti

bahwa hasil ekstrak etanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak campuran

(etanol;etil asetat) dari daun tanaman salam memiliki aktivitas antibakteri

terhadap bakteri yang akan diujikan. Sehingga sesuai teori, seharusnya

kapang endofit yang dihasilkan oleh daun salam seharusnya memiliki

aktivitas sama dengan inangnya.

Pemilihan bakteri uji juga didasarkan pada penelitian sebelumnya

yang membuktikan bahwa ekstrak dari daun salam memiliki aktivitas

antibakteri terhadap bakteri uji Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

dan Staphylococcus aureus.Sehingga penelitian ini ingin membuktikan

apakah ekstrak dari kapang endofit dari daun salam ini juga memiliki

aktivitas antibakteri pada ketiga bakteri uji tersebut.

Sampai saat ini belum ada laporan penelitian mengenai aktivitas

antibakteri dari ekstrak kapang endofit yang diisolasi dari daun salam. Oleh

karena itu penelitian ini dilakukan bertujuan untuk memperoleh ekstrak

yang memiliki aktivitas antibakteri dari kapang endofit yang berasal dari

daun salam terhadap bakteri uji Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

dan Staphylococcus aureus, karena berdasarkan teori seharusnya mikroba

endofit seperti bakteri dan jamur dapat menghasilkan metabolit sekunder

yang memiliki aktivitas sama atau mirip dengan inangnya.

4


1.2 Rumusan Masalah

Apakah kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman salam

dapat menghasilkan ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap

bakteri uji Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus

aureus.

1.3 Hipotesis

Kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman salam dapat

menghasilkan ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri

uji Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.

1.4 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi kapang endofit yang

terdapat pada daun tanaman salam dan mengetahui aktivitas ekstraknya

sebagai antibakteri terhadap bakteri uji Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.

1.5 Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritik

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan pengetahuan

baru mengenai ilmu mikrobiologi khususnya kapang endofit.

2. Manfaat metodologik

Metodologi yang digunakan untuk penelitian ini diharapkan dapat

dikembangkan untuk pencarian senyawa antibakteri yang berasal dari

kapang endofit.

3. Manfaat aplikatif

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi baru untuk

penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas kapang endofit.

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang Endofit

Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang biasanya

berbentuk bakteri maupun fungi dan menghabiskan siklus hidupnya dengan

berkoloni secara inter/intra seluler didalam jaringan tanaman yang sehat

tanpa menimbulkan gejala munculnya penyakit dan interaksi yang terjadi

antara mikroba endofit dengan sel inangnya adalah simbiosis mutualisme,

dimana mikroba endofit mendapatkan nutrisi dan memberikan perlindungan

terhadap tanaman inangnya. Sedangkan pada tanaman inang akan terjadi

peningkatan sistem imun seiring dengan terjadinya produksi atau

pengeluaran metabolit oleh mikroba endofit (Tan & Zou, 2001).

Hampir seluruh tanaman yang sudah diujikan memiliki paling tidak

satu jenis mikroba endofit. Mikroba endofit ini memiliki kemampuan untuk

menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas sama atau mirip

dengan yang diproduksi oleh inangnya (Alvin et al., 2014). Salah satu

contoh mikroba endofit yang sering ditemukan pada jaringan tanaman

adalah fungi. Jenis fungi yang ditemukan dapat berupa kapang maupun

khamir.

Kapang (Mold) merupakan kelompok mikroorganisme eukariotik

yang tergolong dalam fungi berfilamen dan multiseluler. Kapang memiliki

beberapa ciri spesifik, yaitu mempunyai inti sel, memproduksi spora, tidak

mempunyai klorofil sehingga tidak dapat melakukan fotosintesis, dan dapat

berkembang biak dengan baik secara seksual maupun aseksual. Sedangkan

khamir (Yeast) merupakan mikroorganisme eukariotik uniseluler,

mempunyai kemampuan untuk membentuk pseudomiselium maupun

miselium sejati dan dapat bereproduksi baik secara seksual maupun

aseksual (Pelczar & Chan, 1986) (Gandjar, Sjamsuridzal, & Oetari, 2006).

Secara makroskopik khamir terlihat lebih mirip dengan bakteri karena

miseliumnya tidak terlihat sejelas miselium yang dimiliki oleh kapang,

6


sehingga hal ini mempermudah dalam pemisahan antara kapang dan khamir

(Gandjar et al., 2006)

Kapang dapat diisolasi dari semua jaringan tanaman, akan tetapi

harus dilakukan seleksi serta skrining yang ketat untuk mengidentifikasi

aktivitas biologis apa yang dihasilkan oleh metabolit sekunder dari kapang

tersebut. Suatu jaringan tanaman pada bagian tertentu dapat mempunyai

kapang endofit tertentu pula yang berbeda dengan jaringan pada bagian

tanaman lainnya. Adanya perbedaan antara kapang endofit disuatu organ

tanaman dengan bagian organ yang lain disebabkan karena adanya

mekanisme adaptasi dari endofit terhadap mikroekologi dan kondisi

fisiologis yang spesifik dari masing-masing tanaman inang (Wahyudi,

2003).

2.2 Metabolit Sekunder Kapang Endofit

Mikroba endofit memiliki kemampuan untuk memproduksi

senyawa bioaktif yang sama dengan inangnya maupun senyawa yang tidak

sama tapi memiliki aktivitas yang mirip dengan senyawa yang bioaktif yang

diproduksi inangnya, bahkan senyawa yang dihasilkan juga sering kali

memiliki aktivitas yang lebih besar jika dibandingkan dengan aktivitas

senyawa tumbuhan inangnya (Sinaga, Noverita, & Fitria, 2009). Senyawa

metabolit sekunder yang mampu dihasilkan oleh mikroba endofit antara lain

seperti alkaloid, terpenoid, steroid, flavonoid, kuinon, dan fenol. Yang mana

senyawa-senyawa tersebut mempunyai potensi yang besar sebagai senyawa

aktif (Prihatiningtias, Widyastuti, & Wahyuono, 2005).

Fungi endofit seperti kapang dan khamir banyak ditemukan

memiliki kemampuan untuk memproduksi senyawa yang memiliki sifat

antibiotik yang aktif melawan bakteri maupun fungi yang bersifat patogenik

terhadap manusia, tumbuhan, maupun hewan. Selain menghasilkan

senyawa yang bersifat anti bakteri, fungi endofit juga menhasilkan senyawa

7


yang memiliki aktivitas antiviral seperti Cytonic acid A & B

(Prihatiningtias et al., 2005)

2.3 Fermentasi

Fermentasi berasal dari kata fervere (Latin), yang artinya

mendidihkan. Istilah fermentasi sekarang digunakan untuk proses

penguraian metabolik senyawa organik oleh mikroorganisme yang

menghasilkan energi dan umumnya berlangsung pada keadaan anaerob

dengan pembebasan gas (Kumala, 2014).

Menurut Kumala (2014) berdasarkan media, fermentasi dapat

dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Fermentasi media padat

Fermentasi media padat merupakan fermentasi yang dilakukan

dengan menggunakan substrat tidak larut dan tidak mengandung

air bebas, tetapi cukup mengandung air yang diperlukan untuk

pertumbuhan dan perkembangan mikroba. Pada fermentasi ini

mikroorganisme ditumbuhkan pada permukaan media padat,

sehingga juga dapat disebut sebagai fermentasi permukaan.

Fermentasi media padat dapat digunakan untuk produksi enzim

dan asam organik yang menggunakan kapang.

2. Fermentasi media cair

Fermentasi media cair merupakan fermentasi yang biasanya

dilakukan dengan substrat yang larut atau tersuspensi dalam fase

cair. Fermentasi ini juga disebut dengan fermentasi media kultur

terendam yang umumnya memerlukan aerasi dan agitasi. Pada

fermentasi ini yang biasanya digunakan sebagai inokulum adalah

bakteri, kapang, dan khamir.

8


Berdasarkan metode, fermentasi juga terbagi dua, yaitu:

1. Fermentasi metode goyang

Metode fermentasi goyang merupakan metode fermentasi yang

pada prosesnya menggunakan alat pengocok rotary atau orbital,

dan reciprocating. Di antara kedua alat pengocok tersebut, alat

pengocok rotary lebih sering digunakan. Pada alat rotary, kultur

berputar didalam labu pada kecepatan 120 rpm. Sementara itu,

pada mesin pengocok reciprocating, kultur bergerak ulang-alik,

ke depan dan ke belakang yang dapat menyebabkan percikan

medium yang merupakan kelemahan dari pemakaian

reciprocating ini. Wadah yang biasanya digunakan pada metode

fermentasi goyang ini adalah labu erlenmeyer atau tabung reaksi

besar.

2. Fermentasi metode diam

Metode fermentasi diam ini menggunakan labu erlenmeyer

sebagai wadahnya, metode ini dilakukan dengan cara

mendiamkan wadah selama masa inkubasi tanpa ada goncangan.

Idealnya, media fermentasi yang diisikan ke dalam wadah

fermentasi adalah 20% dari volume wadah tersebut.

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi adalah

(Kumala, 2014):

1. Substrat dan nutrien

Media fermentasi yang digunakan harus menyediakan semua

nutrien yang dibutuhkan oleh mikroba untuk pertumbuhan dan

memperoleh energi. Beberapa substrat dapat digunakan sebagai

sumber karbon adalah pati dan molase. Sementara itu, garam

amonium, urea, nitrat, tepung dan kedelai dapat digunakan

sebagai sumber nitrogen.

9


2. Keasaman (pH)

Pengukuran pH harus dilakukan agar media yang digunakan

berada pada pH optimum selama masa fermentasi. Pada

umumnya bakteri memiliki pH optimum dalam rentang 6,7-7,5

dan tidak dapat tumbuh pada pH dibawah 5,5 dan diatas 8,5.

Sedangkan Khamir memiliki pH optimum pada rentang 2,5-8,5.

Sementara itu, pH optimum kapang berada diantara antara 5 dan

7, tetapi masih dapat tumbuh pada rentang pH 3-8,5

3. Suhu

Suhu pada saat proses fermentasi harus di perhatikan karena

dapat membuat mikroorganisme mati atau tidak berkembang

apabila suhu terlalu tinggi atau terlalu rendah. Sebagian besar

mikroorganisme hanya dapat tumbuh pada rentang suhu 20-30°C

4. Aerasi dan Agitasi

Aerasi bertujuan agar pasokan oksigen cukup memadai, untuk

mempertahankan kondisi aerobik dan membuang gas

karbondioksida yang dihasilkan selama fermentasi. Agitasi

bertujuan meratakan penyebaran mikroorganisme, nutrien, dan

oksigen didalam medium.

Fermentasi juga dapat diartikan sebagai suatu disimilasi senyawa-

senyawa organik yang disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme.

Pengertian disimilasi adalah reaksi kimia yang membebaskan energi

melalui perombakan nutrient. Proses fermentasi memanfaatkan aktivitas

suatu mikroba tertentu atau campuran beberapa spesies mikroba. Mikroba

yang banyak digunakan dalam proses fermentasi antara lain khamir, kapang,

dan bakteri. Dengan fermentasi, manusia dimungkinkan untuk

memproduksi produk yang tidak dapat atau sulit diproduksi apabila produk

tersebut diproses dengan proses kimia (Sulyastiningrum, 2008).

10


Gambar 2.2 Daun salam ( sumber: Koleksi pribadi)

Gambar 2.1 Pohon salam (Sumber: koleksi pribadi)

2.4 Daun Salam (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.)

2.4.1 Klafikasi Tanaman

Klasifikasi tanaman salam secara ilmiah:

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Myrtales

Suku : Myrtaceae

Marga : Syzygium

Jenis : Syzygium polyanthum

(BPOM, 2008)

Gambar 2.3 Daun salam dan tangkai ( sumber: Koleksi pribadi)

11


2.4.2 Nama Daerah

Tanaman Salam banyak tersebar di berbagai daerah di Indonesia,

sehingga memiliki nama yang berbeda di beberapa daerah, yaitu antara lain:

Sumatera: meselangan, ubar serai (Melayu).

Jawa: salam, gowok (Sunda), salam, manting (jawa), salam (Madura).

Kangean: kastolam

(BPOM, 2008)

2.4.3 Deskripsi Tanaman

Pohon salam dapat tumbuh dengan tinggi yang tingginya dapat

mencapai 25 m, memiliki batang berbentuk bulat dengan permukaan yang

licin dan berdiameter hingga 50 cm. Tanaman salam memiliki daun

majemuk,menyirip genap, permukaannya licin dan tepi daunnya rata, serta

memiliki pangkal yang meruncing. Daunnya memiliki panjang 10-14 cm

dan lebar 4-8 cm dengan tangkai daun yang panjangnya ± 1 cm. Pertulangan

menyirip, permukaan atas dari daun licin berwarna hijau tua, sedangkan

bagian permukaan bawah berwarna hijau muda. Tanaman salam memiliki

bunga majemuk yang terdapat diujung batang, kelopak bunganya berbentuk

piala dengan diameter 4 mm berwarna hijau, panjang mahkota bunganya 2-

3,5 mm berwarna putih, panjang putiknya 1,5-2 mm berwarna hijau keputih-

putihan. Buah dari tanaman salam merupakan buah buni, dengan bentuk

bulat dan mempunya diameter ±1.2 cm , buah yang muda berwarna hijau,

dan akan menjadi coklat kehitaman jika sudah tua, dan memiliki rasa.

Sedangkan bijinya berbentuk bulat dengan diameter sekitar 1 cm dan

berwarna coklat serta memiliki akar tunggang dengan warna coklat muda

(BPOM, 2008).

12


2.4.4 Tempat Tumbuh

Tanaman salam cukup sering dan sangat mudah dijumpai karena

banyak tersebar di daerah-daerah yang terdapat di Indonesia. Tanaman ini

biasanya tumbuh liar di daerah hutan dan pegunungan dan dapat di temukan

di daerah permukaan rendah sampai ketinggian 1400 m dpl (Dalimartha,

2000).

2.4.5 Kandungan Kimia

Kandungan kimia yang terdapat pada daun salam antara lain adalah

minyak atsiri (sitral dan eugenol), tanin, dan flavonoid (Dalimartha, 2000).

2.4.6 Kegunaan Tradisional

Daun salam sering digunakan oleh masyarakat sebagai bumbu

dapur. Selain sebagai bumbu dapur, secara empiris hasil rebusan dari daun

salam yang masih segar dapat digunakan sebagai obat mencret, kencing

manis, gatal-gatal, gangguan pencernaan, lemah lambung, dan mempunyai

sifat adstringen (Nuratmi et al., 1999).

2.5 Bakteri Uji

2.5.1 Escherichia coli

Divisi : Bacteria

Kelas : Gamma Proteobakteria

Bangsa : Enterobacteriales

Suku : Enterobacteriaceae

Marga : Escherechia

Spesies : Escherechia coli

13


Escherechia coli merupakan bakteri Gram negatif yang memiliki

bentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm , diameter 0,7

μm lebar 0,4-0,7 μm. Bakteri ini tidak dapat membentuk spora, tidak tahan

asam, dan sebagian besar bergerak dengan flagel (Brooks et al., 2013).

Bakteri ini biasanya dapat ditemukan di saluran pencernaan pada manusia

maupun dan hewan tanpa memberikan dampak negatif, akan tetapi ada

beberapa strain dari bakteri ini yang berevolusi menjadi bakteri patogen

dengan cara memperoleh faktor-faktor virulensi melalui plasmid,

transposon, dan bakteriofag. Bakteri Escherechia coli yang sudah

berevolusi dan menjadi bersifat patogen ini disebut Escherechia coli

enterohemorraghic. Contoh Escherechia coli enterohemorraghic yang

biasanya menyebabkan diare pada manusia adalah Escherechia coli

O157:H7 (Lim, Yoon, & Hovde, 2010).

2.5.2 Pseudomonas aeruginosa

Divisi : Bacteria

Kelas : Gamma Proteobakteria

Bangsa : Pseudomonadales

Suku : Pseudomonadaceae

Marga : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa

Genus Pseudomonas terdiri dari sejumlah bakteri Gram negatif,

aerob, bergerak dengan flagel, katalase positif, oksidase positif, dan bersifat

patogen oportunistik. Bakterinya berbentuk batang, berukuran 0,6 x 2 µm,

bergerak aktif dengan flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak

memiliki spora, tidak punya selubung dan bersifat Gram negatif. Bakteri ini

tumbuh secara obligat aerob pada pembenihan gizi sederhana pada suhu 37-

42 ºC. Suhu optimum untuk pertumbuhannya adalah 42 ºC. Bakteri ini

mudah tumbuh di berbagai media pembiakan karena kebutuhan nutrisi yang

sederhana (Brooks et al., 2013).

14


2.5.3 Staphylococcus aureus

Divisi : Bacteria

Kelas : Bacilli

Bangsa : Bacillales

Suku : Staphylococcaceae

Marga : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang

memiliki bentuk bulat dengan diameter sekitar 1,0 µm, bakteri ini tersusun

dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur, tidak

dapat membentuk spora, dan tidak bergerak, tumbuh pada suhu optimum

pada suhu 37 ºC tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar

(20-25 ºC) (Brooks et al., 2013).

2.6 Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan bakteri di pengaruhi oleh berbagai macam faktor,

(Pelczar & Chan, 1986) menyebutkan adapun faktor-faktor yang

mempengaruhi pertumbuhan bakteri itu antara adalah :

1. Suhu

Proses pertumbuhan bergantung pada reaksi kimiawi, sedang reaksi

kimiawi dipengaruhi oleh suhu, sehingga pertumbuhan yang dialami bakteri

dapat terpengaruh oleh suhu lingkungannya. Setiap spesies bakteri tumbuh

pada rentang suhu tertentu, dan dapat diklasifikasikan menjadi psikrofil

(0ºC-30 ºC), mesofil (25 ºC-40 ºC), dan termofil (50 ºC keatas)

2. pH

pH yang dibutuhkan bakteri untuk tumbuh biasanya ada pada kisaran

pH 6,5-7,5. Akan tetapi ada beberapa bakteri yang dapat tumbuh dalam

15


keadaan sangat asam atau sangat alkalin. Pada umumnya bagi sebagian

besar spesies nilai pH minimum dan maksimum adalah antara 4 dan 9.

Untuk mencegah adanya perubahan pH yang disebabkan oleh zat-

zat yang dihasilkan bakteri saat pertumbuhannya, dapat dilakukan

penambahan larutan penyangga seperti kombinasi garam fosfat (KH2PO4

dan K2HPO4)

3. Atmosfer gas

Jenis gas yang paling mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah

oksigen dan karbondioksida. Adapun respon bakteri terhadap oksigen bebas

sangatlah beragam, sehingga dapat dikelompokan menjadi:

a. Bakteri aerobik

Bakteri yang memerlukan oksigen untuk pertumbuhan

b. Bakteri anaerobik

Bakteri yang tumbuh tanpa oksigen molekular

c. Bakteri anaerobik fakultatif

Bakteri yang dapat tumbuh pada keadaan aerobik dan anaerobik

d. Bakteri mikroaerofilik

Bakteri yang tumbuh secara optimum apabila oksigen di atmosfer

sedikit

2.7 Antibakteri

Pengertian dari antibakteri dalah suatu zat yang dapat membasmi

jasad renik yang diperoleh dari sintesis maupun berasal dari senyawa non-

organik. Adapun (Pelczar & Chan, 1988) menjelaskan beberapa mekanisme

kerja dari antibakteri adalah sebagai berikut:

1. Menghambat sintesis dinding sel

Dengan menghambat pembentukan dinding sel, maka struktur dinding

sel akan rusak.

2. Mengganggu keutuhan membran sel mikroba

Membran sel mikroba berperan penting dengan memelihara integritas

komponen selular, sehingga apabila dirusak akan menyebabkan

terhentinya pertumbuhan pada sel maupun kematian.

16


3. Menghambat sintesis protein sel mikroba

Denaturasi terhadap protein dan asam nukleat pada suatu sel dapat

menyebabkan kerusakan ireversible terhadap sel tersebut.

4. Mengganggu metabolisme sel mikroba

Penghambatan metabolisme dengan zat penghambat dapat

menyebabkan terganggunya proses tersebut dan dapat mengakibatkan

kematian sel tersebut.

5. Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein

DNA, RNA, dan protein sangat penting pengaruhnya terhadap

kehidupan sel. Sehingga gangguan dalam proses pembentukannya

akan menyebabkan sel tersebut rusak.

2.8 Uji Aktivitas Antibakteri

Terdapat tiga metode yang dapat digunakan sebagai metode uji anti

bakteri, yaitu antara lain (Choma & Grzelak, 2011):

1. Metode difusi

Pada metode ini, digunakan cakram kertas saring yang mengandung

senyawa yang akan diuji dan diletakan di permukaan agar yang sudah

diinokulasi dengan mikroba terlebih dahulu. Agen antimikroba akan

berdifusi dengan agar dan menghambat germinasi serta pertumbuhan

bakteri. Kemudian petri diinkubasi dan zona dari penghambat

pertumbuhan kemudian diukur.

2. Metode dilusi

Metode ini mempunya keuntungan karena konsentrasi senyawa uji di

permukaan media dapat di perkirakan. Dengan metode ini, uji

dilakukan menggunakan konsentrasi yang senyawa yang bervariasi dan

dicampur dengan nutrient agar. Kemudian agar di inokulasi dan

inkubasi. Kemudian petri dengan konsentrasi yang tidak ditemukan

mikroba sama sekali ditetapkan sebagai KHM (konsentrasi hambat

minimum).

17


3. Metode bioutografi

Prosedurnya mirip dengan metode difusi agar. Perbedaanyan adalah

senyawa yang diujikan didifusikan dengan medium agar yang

dinokulasikan dengan KLT, dalam bentuk kertas atau adsorbent.

18


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian 1,

Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas

Kesehatan dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Penelitian

dimulai pada bulan Januari 2016 dan selesai pada bulan Agustus 2016.

3.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain, cawan

petri, kertas saring, tabung reaksi (Pyrex), inkubator (C 3000), timbangan

analitik (AND GH-2012), mikroskop cahaya (shimadzu), spatula, labu ukur

(Pyrex), erlenmeyer (Schott Duran), bunsen, kaca objek, jangka sorong,

kaca arloji, batang pengaduk, lemari pendingin, autoklaf digital (ALP

Ogawa Seiki), micro pipet (Thermoscientific) dan tip. Jarum ose, gelas

ukur, pinset, kertas saring alumunium foil, beaker glass (Pyrex), magnetic

stirrer, hot plate (Velp), water bath (Eyela), blank disc, vortex mixer

(Wiggen Hauser), Laminal Air Flow (minihelic), object glass, cover glass,

vacum rotary evaporator dan alat-alat yang umum digunakan di

laboratorium Mikrobiologi.

3.3 Bahan

3.3.1 Tanaman Uji

Sampel uji tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun

salam yang diperoleh dari Kampung Mekarwangi, Desa Kayumanis,

Kabupaten Bogor. Daun yang dipilih adalah daun yang masih hijau dan

tidak terdapat kerusakan yang kemudian dikirimkan dalam keadaan masih

19


utuh dengan. Tanaman tersebut kemudian dideterminasi di Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI) Kebun Raya, Bogor.

3.3.2 Bahan Kimia

Etanol 70%, etanol 96%, NaOCl 5,25%, aquades steril, NaCl

fisiologis 0,9%, larutan kristal violet, larutan safranin, lugol.

3.3.3 Medium

Medium yang akan digunakan pada penilitian ini adalah Nutrient

Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dextrose Yeast Broth

(PDY Broth), Mueller Hinton Agar (MHA).

3.3.4 Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

dan Staphylococcus aureus ATCC 25923.

3.4. Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Media Isolasi, Medium Peremajaan, dan Medium

Pemeliharaan

1. Potato Dextrose Agar (PDA) plate

Pembuatan media disesuaikan dengan petunjuk penggunaan yang

tercantum pada label PDA, ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram dan

ditambahkan aquades sebanyak 1 liter. Bahan kemudian diaduk dengan

menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan diatas hot plate. Media

disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C.

Kemudian 10 mL media dituang ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga

media memadat.

2. Potato Dextrose Agar (PDA) slant


tercantum pada label PDA (Merck), ditimbang Potato Dextrose Agar 39

gram dan ditambahkan aquades sebanyak 1 liter. Bahan kemudian diaduk

20


dengan menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan diatas hot plate.

Media dimasukkan ke dalam tabung slant masing-masing 10 mL. Media

disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C. Media

diletakkan dalam tabung dengan posisi miring ± 45° dan biarkan media

hingga memadat.

3.4.2 Pembuatan Medium Perbanyakan

1. Nutrient Agar (NA)


tercantum pada label NA (Merck), Ditimbang 20 gram Nutrient Agar dan

disiapkan 1 liter aquades. Bahan dicampur dan diaduk dengan magnetic

stirrer. Media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu

121°C. Media dituang ke dalam cawan petri, masing-masing 10 mL, dan

dibiarkan memadat.

3.4.3 Pembuatan Medium Fermentasi

1. Potato Dextrose Yeast (PDY)

Disiapkan kentang 200 g yang sudah dikupas dan dibersihkan,lalu

aquades ditambahkan sebanyak 22 mL sambil dipanaskan hingga mendidih.

Saring ekstrak kentang dan ditambahkan 22 g Dextrose, 4,4 g Yeast Extract

dan aquades sampai 1000 mL. Bahan dihomogenkan sambil dipanaskan

hingga mendidih dan pH diukur sampai 6,0 menggunakan pH universal..

Media disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit, pada suhu 121℃.

Media dimasukkan masing-masing 200 mL ke dalam botol kaca steril

(Maryanti, 2015).

3.4.4 Pembuatan Medium Uji Aktivitas Antibakteri

1. Mueller Hinton Agar (MHA)


tercantum pada label. Ditimbang 38 gram Mueller Hinton Agar dan

disiapkan 1 liter aquades. Bahan kemudian diaduk dengan menggunakan

magnetic stirrer sambil dipanaskan diatas hot plate. Media disterilisasi

21


dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C. Media dituang ke

dalam cawan petri masing-masing 10 mL, biarkan memadat.

3.4.5 Isolasi Kapang Endofit

1. Sampling tanaman

Tanaman diambil bagian daun yang masih segar. Daun yang masih

segar itu dibedakan menjadi 3 jenis, yaitu DSM (daun salam muda) yang

posisinya terletak di ujung batang, DSS (daun salam setengah tua) yang

posisinya ditengah, dan DST (daun salam tua) yang posisinya di pangkal

batang.

2. Sterilisasi permukaan dan penanaman daun

Bagian daun yang dicuci dengan air mengalir selama 10 menit

kemudian disterilkan secara bertahap dengan mencelupkan daun ke dalam

alkohol 70% selama 1 menit kemudian dicelupkan pada larutan NaOCl

5,25% selama 5 menit lalu terakhir dicelupkan lagi dalam alkohol 70%

selama 30 detik menggunakan pinset yang sebelumnya telah dilewatkan

pada api (flambeer) terlebih dahulu. Sampel kemudian direndam dengan

menggunakan aquades steril selama 5 detik. Setelah dikeringkan daun

dipotong dengan ukuran 1x1 cm . Sampel ditanam di dalam media agar

PDA. Cawan petri yang sudah mengandung sampel tanaman kemudian

diinkubasi pada suhu 27°C selama 14 hari (Munim, Ramadhan, & Soemiati,

2013).

3. Pemurnian kapang endofit

Kapang yang tumbuh pada daun salam selama proses inkubasi,

dimurnikan dengan memindahkan secara aseptik sebagian miselium kapang

ke dalam media kultur baru. Kapang yang tumbuh dari daun salam diambil

dengan menggunakan jarum ose yang sebelumnya dipijarkan terlebih

dahulu diatas api kemudian dipindahkan ke media PDA yang baru (Rahmi

et al., 2013).

22


Setelah kapang yang dimurnikan berumur 7 hari. Isolat kapang yang

telah murni ditransfer ke agar miring PDA baru untuk dijadikan working

culture dan stock culture. Proses pemurnian ini dilakukan secara duplo

(Munim et al., 2013).

3.4.6 Pengamatan Morfologi Isolat Kapang Endofit

Pengamatan dilakukan secara makroskopik (visual) dan

mikroskopik. Pengamatan secara makroskopik dilakukan dengan cara

mengamati warna, permukaan, tepian koloni dan pertumbuhan dari kapang

(Kumala & Pratiwi, 2014).

Pengamatan secara mikroskopik dilakukan dengan pembuatan

preparat (Metode slide culture). Adapaun langkah-langkah metode slide

culture ini adalah sebagai berikut: kertas saring diletakkan pada dasar cawan

petri yang sudah diberi kapas. Kemudian kaca objek dan cover glass

diletakan di atas kertas saring dan dibasahi dengan aquades steril . Lalu

cawan petri disterilkan pada suhu 121°C, selama 15 menit. Setelah proses

sterilisasi selesai, pada kaca objek ditetesi medium PDA steril biarkan

membeku, setelah itu dengan menggunakan jarum ose diambil sedikit

meselium kapang, diletakkan diatas kaca objek, setelah itu ditutup dengan

menggunakan cover glass secara perlahan-lahan lalu diinkubasi pada suhu

kamar selama 5 hari, morfologi kapang diamati dengan menggunakan

mikroskop pada perbesaran 1000 kali (Kumala & Pratiwi, 2014).

3.4.7 Fermentasi

Proses fermentasi menggunakan kapang yang sudah dimurnikan

selama 7 hari (Munim et al., 2013). Isolat kapang endofit yang diperoleh

diambil sebanyak 3 bulatan biakan kapang dengan diameter 1x1 cm yang

diambil menggunakan sedotan yang sudah disterilisasi terlebih dahulu.

Potongan kapang tersebut dimasukkan ke dalam medium fermentasi cair

PDY sebanyak 200 mL dalam botol kaca steril berukuran 500 mLdengan

bantuan pinset yang juga sudah disterilisasi. Fermentasi dilakukan dengan

23


cara fermentasi diam (statis) selama 21 hari (Phongpaichit, Rungjindamai,

Rukachaisirikul, & Sakayaroj, 2006).

3.4.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi

Hasil dari fermentasi dibagi menjadi dua bagian. Bagian pertama

merupakan biomassa dari hasil fermentasi. Biomassa kemudian dihaluskan

dengan menggunakan lumpang dan alu, lalu di tambahkan pelarut metanol

dan didiamkan selama 48 jam di tempat yang gelap. Kemudian setelah 48

jam, hasilnya disaring dam filtratnya diambil untuk mendapatkan ekstrak

pekat dengan menggunakan vacum rotary evaporator.

Bagian kedua merupakan media hasil fermentasi. Media di ekstraksi

dengan cara partisi bertingkat menggunakan pelarut n-heksan dan kemudian

menggunakan pelarut etil asetat. Fraksi n-heksan dan etil asetat yang didapat

kemudian juga di evaporasi dengan menggunakan vacum rotary evaporator

untuk mendapatkan ekstrak pekat. Sedangkan fraksi airnya digunakan untuk

uji fraksi air.

3.4.9 Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 diremajakan pada

medium NA miring. Peremajaan dilakukan dengan cara mengambil masing-

masing bakteri uji sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke dalam medium

NA miring baru dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Pengerjaan

dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (Maryanti, 2015).

3.4.10 Uji Aktivitas Antibakteri

1. Identifikasi bakteri uji

Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan menggunakan metode

pewarnaan gram pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Kaca objek

dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan etanol 70%, kemudian

dilewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak dan biarkan dingin

sebelum dipakai, setelah dingin kaca objek ditetesi dengan NaCl steril 0,9%

24


dan diberi bakteri sebanyak 1 ose. Kaca objek di fiksasi dengan melewatkan

gelas objek pada api bunsen. Preparat lalu ditetesi dengan larutan Karbol

Kristal Ungu 0,5% dan didiamkan selama 5 menit dan setelah itu dibilas

dengan air. Preparat kemudian diteteskan dengan Cairan Lugol dan

didiamkan selama 45-60 detik, lalu dicuci dengan air. Setelah itu preparat

dicuci dengan menggunakan alkohol 96% dan digoyang-goyangkan selama

30 detik atau hingga zat warna bersih. Preparat dicuci dengan air. Larutan

Safranin diteteskan di atas preparat, kemudian dibiarkan selama 1-2 menit,

cuci dengan air dan keringkan. Tetesi minyak immersi diatas sediaan, amati

dengan mikroskop (Atika, 2007).

2. Pembuatan suspensi bakteri

Bakteri yang sudah dibiakan di agar miring dipindahkan dengan

menggunakan jarum ose dan disuspensikan dengan cara dimasukan kedalam

tabung berisi 10 mL NaCl Fisiologis 0,9% dan divortex homogen, kemudian

dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada pertumbuhan bakteri,

kekeruhan ini disetarakan dengan standar Mc. Farland 3.0 yang setara

dengan 109 sel bakteri/mL. Kemudian diencerkan lagi dengan NaCl

fisiologis 0,9 % steril sampai diperoleh konsentrasi 106 sel bakteri/mL

(Rahmadani, 2015).

3. Uji aktivitas antibakteri dengan metode cakram

Suspensi bakteri diambil sebanyak 1 mL dari pembuatan suspensi

bakteri sebelumnya dan dipindahkan secara aseptis ke dalam cawan petri

steril kemudian ditambahkan media agar MHA yang telah dibuat untuk

masing-masing bakteri uji sejumlah 10mL. Kemudian cawan petri

digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi bakteri yang tersebar

merata pada medium MHA (Rachmayani, 2008).

Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan metode

difusi cakram. Larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm diserapkan ke

dalam cakram sebanyak 20 μL. Kontrol positif yang digunakan pada uji

aktivitas antibakteri ini adalah cakram kloramfenikol dengan konsentrasi

25


30 µg. Sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah masing-masing

pelarutnya. Cakram yang sudah diresapi dengan larutan uji, kontrol positif,

dan kontrol negatif kemudian diletakkan pada permukaan media uji lalu

diinkubasi.Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35℃. Diamati

zona hambatan yang terbentuk setelah inkubasi. Diameter zona hambat

diukur dengan jangka sorong (Atika, 2007).

26


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Determinasi Tanaman

Daun salam yang digunakan untuk dalam penelitian didapatkan dari

Kampung Mekarwangi, Desa Kayumanis, Kabupaten Bogor pada bulan

januari 2016. Tanaman tersebut kemudian dideterminasi di Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI) Kebun Raya, Bogor untuk memastikan

sampel yang digunakan sudah benar. Hasil determinasi menunjukan bahwa

sampel tanaman yang digunakan adalah benar dari jenis Syzygium

polyanthum (Wight) Walp, suku Myrtaceae. Hasil determinasi dapat dilihat

pada lampiran 11.

4.2 Penyiapan Sampel

Sampel diterima pada tanggal 16 Januari 2016 dalam keadaan

dibungkus sedemikian rupa yang bertujuan agar tanaman tidak layu kering

pada saat masa pengiriman. Sampel yang dikirim masih dalam keadaan utuh

dengan tangkainya agar pemilihan daunnya dapat di variasikan.

Daun yang dipilih merupakan daun yang masih segar dan tidak

rusak. Daun tersebut diambil dari tiga bagian yang berbeda, yaitu daun

bagian atas atau daun muda , daun yang terdapat di bagian tengah atau daun

yang setengah tua, dan daun yang terdapat dibagian bawah atau daun tua

yang terdapat didekat percabangan batang. Pemilihan daun yang bervariasi

bertujuan untuk mendapatkan isolat kapang dengan keanekaragaman yang

berbeda, karena perbedaan kandungan seperti kandungan klorofil, beta

karoten, vitamin, metabolit sekunder dan mineral antara daun muda, daun

setengah tua, dan daun tua dapat menyebabkan perbedaan terhadap faktor

lingkungan yang mempangaruhi pertumbuhan mikroba yang terdapat pada

daun (Setiawati, Saragih, Nurzaman, & Mutaqin, 2016). Daun yang sudah

dipilih tersebut kemudian dibersihkan dengan cara dicuci menggunakan air

27


bersih yang mengalir yang bertujuan agar permukaan daun yang digunakan

bebas dari kotoran seperti debu dan tanah (Rahmi et al., 2013)

Keterangan:

A. Daun salam tua (DST)

B. Daun salam setengah tua (DSS)

C. Daun salam muda (DSM)

Setelah dicuci menggunakan air bersih, kemudian dilakukan

sterilisasi permukaan untuk membersihkan permukaan daun dari mikroba

mikroba yang berada dipermukaan daun (Strobel G, 2003). Proses sterilisasi

permukaan ini menggunakan etanol 70% dan natrium hipoklorit (NaOCl)

5,25% sebagai disinfektan. Pada proses ini daun direndam menggunakan

etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25% selama 5

menit, etanol 70 % selama 30 detik dan terakhir dibilas menggunakan

aquades steril selama 3-5 detik. Penggunaan etanol 70% didasarkan

terhadap kemampuan etanol untuk mendenaturasi protein, dan proses

B

AC

Gambar 4.1 Sampel daun salam

28


denaturasi tersebut akan berlangsung lebih cepat apabila terdapat

keberadaan air. Sehingga penggunaan etanol 70% lebih efektif dari

penggunaan etanol murni karena etanol 70% mengandung 30% air.

Sedangkan penggunan NaOCl 5,25% disebabkan karena memiliki spektrum

anti bakterinya yang luas, tidak meninggalkan residu yang bersifat toksik,

memiliki reaksi yang cepat, dan mudah didapat. NaOCl 5,25%

mengandung klorin didalamnya, klorin bekerja dengan cara mengoksidasi

enzim sulfidril dan asam amino, merusak gugus asam amino, mengurangi

reuptake protein, dan menghambat sintesis protein (Rutala & Weber, 2004).

Pembilasan daun dengan menggunakan aquades steril bertujuan untuk

membersihkan mikroorganisme yang sudah mati saat direndam dengan

etanol 70% dan NaOCl 5,25% ,serta membersihkan sisa-sisa dari kedua

disinfektan tersebut yang mungkin masih tertinggal di permukaan daun

(Kumala, 2014).

4.3 Hasil Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit

Proses isolasi kapang endofit ini menggunakan media PDA. Media

ini bersifat selektif terhadap kapang endofit dan media ini mengandung

kentang dekstrose sebagai sumber nutrisi. Senyawa yang terkandung dalam

kentang seperti karbohidrat sangat mendukung proses perrtumbuhan

kapang endofit, sehing media inilah yang dipilih (Ariyono, Djauhari, &

Sulistyowati, 2014).

Penanaman dilakukan dengan menggunakan tiga variasi daun, yaitu

daun muda, daun sedang, dan daun tua. Isolasi dilakukan dengan cara

langsung melakukan penanaman daun dari tanaman salam di permukaan

media PDA. Penanaman dilakukan secara triplo dan diberikan kode disetiap

sampel. Setelah ditanam, sampel diamati perkembangannya selama 14 hari.

Koloni kapang yang tumbuh dianggap kapang endofit apabila tumbuhnya

berada disekitar daun tanaman yang di isolasi (Ramadhan, 2011).

29


Pada saat proses penanaman selalu terdapat kontaminan pada isolat

DST disetiap kali pengulangan, akan tetapi koloni yang diambil untuk

dimurnikan merupakan koloni kapang yang tumbuh disekitar sampel daun

yang diisolasi yang bebas dari kontaminan (Ramadhan, 2011).

Dari hasil isolasi yang didapat pada DSS1 tidak ada kapang yang

tumbuh, akan tetapi pada varian lain DSS2 dan DSS3 ada beberapa kapang

yang tumbuh, hal ini dapat terjadi karena kemungkinan kapang pada bagian

daun DSS1 tersebut mati secara keseluruhan saat proses sterilisasi

permukaan. Sedangkan pada hasil isolasi DSM dan dan DST seluruhnya

ditumbuhi kapang. Pada isolat DST seluruh kapang yang tumbuh memiliki

kemiripan dengan kapang pada isolat DSM dan DSS sehingga dilakukan

pemurnian untuk menentukan apakah kapang tersebut terdiri dari jenis yang

sama atau tidak. Pemurnian tersebut dilakukan dengan cara pengamatan

morfologi kapang baik secara makroskopik dan mikroskopik (Kumala &

Pratiwi, 2014).

Dari 4 kali hasil pemurnian didapatkan hasil bahwa seluruh kapang

DST juga tumbuh pada DSS dan DSM. Sehingga total isolat kapang yang

didapat adalah lima isolat. Adapun hasil isolasi yang didapat dari penelitian

ini adalah sebagai berikut:

Bagian Daun Jumlah Isolat Kode Isolat

DSM 3 DSM 1B

DSM 2B

DSM 3A

DSS 2 DSS 3A

DSS 3B

DST - -

Tabel 4.1 Hasil Isolasi Kapang Endofit Daun Salam

30


Hasil pemurnian tersebut juga ditanam kembali pada media PDA

miring sebagai stok kultur dan kultur kerja. Kegunaan stok kultur adalah

sebagai stok yang nantinya dapat digunakan kembali, sedangkan kultur

kerja diugunakan untuk melanjutkan pekerjaan.

4.4 Hasil Karakterisasi Isolat Kapang Endofit

Karakterisasi kapang dilakukan secara makroskopik dan

mikroskopik, pengamatan secara makroskopik dilakukan dengan cara

mengamati warna, pertumbuhan, dan bentuk permukaan koloni.

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan cara mengamati pertumbuhan

hifa (bercabang atau tidak bercabang), warna hifa (hialin, transparan, atau

gelap) terdapatnya konidia atau tidak dan bentuk dari konidia yang dimiliki

oleh kapang yang diamati. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop

(Ariyono et al., 2014).

Pada pengamatan mikroskopik, miselium kapang diwarnai dengan

menggunakan methylene blue untuk memperjelas bentuk dari morfologi

kapang yang akan diamati. Penggunaan methylene blue akan menyebabkan

hifa dan konidia yang terdapat pada miselium kapang yang diamati akan

terlihat berwarna biru. Warna biru ini disebabkan karena sel pada miselium

kapang sudah mengalami kematian, karena apabila sel yang diamati masih

hidup maka bagian yang ditetesi methylene blue akan berubah warna

menjadi bening. Selain itu methylene blue juga mengandung fenol yang

dapat menyebabkan tidak aktifnya enzim litik seluler sehingga sel dari

kapang yang akan diamati tidak mengalami lisis (Gandjar et al., 2006)

(Handayani, 2015).

31


Gambar 4.2 Isolat DSM 1B tampak depan dan belakang

Gambar 4.3 Hasil pengamatan isolat DSM 1B pada mikroskop

cahaya perbesaran 1000 kali

4.4.1 Isolat DSM 1B

Secara makroskopik, permukaan Isolat DSM 1B berwarna putih

keabu-abuan dan agak bergelombang dengan diameter 9 cm. Tampak

belakangnya berwarna hitam dibagian tengah dan berwarna kecoklatan

dibagian pinggirnya. Sedangkan secara mikroskopik isolat kapang DSM

1B memiliki hifa yang bersekat dan memiliki cabang, hifa berwarna gelap

dan memiliki konidia berbentuk bulat.

32


Gambar 4.4 Isolat DSM 2B tampak depan dan belakang

Gambar 4.5 Pengamatan isolat DSM 2B pada mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali

4.4.2 Isolat DSM 2B

Secara makroskopik, permukaan Isolat DSM 2B berwarna putih dan

memiliki permukaan seperti kapas dengan diameter sebesar 9 cm. Tampak

belakangnya juga berwarna putih dan mirip dengan kapas. Sedangkan

secara mikroskopik isolat DSM 2B memiliki hifa yang bercabang, bersekat,

berwarna gelap dan memiliki konidia berbentuk bulat.

33


Gambar 4.6 Isolat DSM 3A tampak depan dan belakang

Gambar 4.7 Pengamatan isolat DSM 3A pada mikroskop cahaya


4.4.3 Isolat DSM 3A

Secara makroskopik, Permukaan isolat DSM 3A berwarna hitam

dibagian tengah dan berwarna putih keabu-abuan di bagian pinggirnya,

permukaannya agak kasar dan memiliki diameter 6,3 cm. Tampak

belakang sebagian besar berwarna hitam dan berwarna putih disedikit

bagian pinggirnya. Secara mikroskopik isolat DSM 3A memiliki hifa yang

bercabang, bersekat, berwarna gelap, dan tidak memiliki konidia.

34


Gambar 4.8 Isolat DSS 3A tampak depan dan belakang

Gambar 4.9 Pengamatan isolat DSS 3A pada mikroskop cahaya


4.4.4 Isolat DSS 3A

Secara makroskopik, permukaan isolat DSS 3A berwarna

kecoklatan dibagian tengah dengan tekstur sedikit kasar dan berwarna putih

di bagian pinggir yang berbentuk seperti kapas dengan diameter 8,4 cm.

Tampak belakangnya berwarna coklat dan berwarna jingga dibeberapa

bagian pinggirnya. Sedangkan secara mikroskopik isolat DSS 3A memiliki

hifa yang bercabang, bersekat, berwarna agak transparan dan tidak

memiliki konidia.

35


Gambar 4.10 Isolat DSS 3A tampak depan dan belakang

Gambar 4.11 Pengamatan isolat DSS 3A pada mikroskop cahaya


4.4.5 Isolat DSS 3B

Secara makroskopik, permukaan isolat DSS 3B berwarna abu-abu

dan sedikit berwarna hitam dibagian pinggirnya dengan tekstur yang halus

dan berdiameter diameter 9 cm. Tampak belakangnya berwarna hitam

secara keseluruhan. Secara mikroskopik isolat DSS 3B memiliki hifa yang

bercabang, bersekat, berwarna gelap dan memiliki konidia dengan bentuk

tidak beraturan.

36


4.5 Ekstraksi Hasil Fermentasi

Fermentasi dilakukan secara statis pada suhu ruang selama 21 hari

(Phongpaichit et al., 2006). Proses ini dilakukan selama 21 hari karena

apabila kapang sudah melewati umur 21 hari, kapang tersebut kemungkinan

sudah melewati fase stasioner dan memasuki fase kematian. Fase stasioner

merupakan fase dimana pertumbuhan kapang tetap karena kematian sel

diikuti tumbuhnya sel baru, pada fase ini jugalah kapang menghasilkan

metabolit sekunder. Sedangkan fase kematian adalah fase dimana kapang

tidak tumbuh lagi, dan sel terus mengalami kematian yang akan

mengakibatkan berkurangnya masa kapang (Pokhrel & Ohga, 2007). Media

fermentasi yang digunakan adalah media PDY broth ( Potato Dextrose

Yeast broth). Media ini mengandung kentang dan dextrose sebagai sumber

karbon dan yeast extract sebagai sumber nitrogen (Kumala dan Pratiwi,

2014).

Proses fermentasi dengan metode statis ini menghasilkan hasil yang

kurang optimal apabila dibandingkan dengan fermentasi menggunakan

metode shaker. Hal ini disebabkan karena untuk mendapatkan pertumbuhan

kapang yang optimal diperlukan dukungan dari perlakuan serta faktor

lingkungan. Salah satu faktor utama untuk memperoleh pertumbuhan

kapang yang optimal adalah aerasi, dan untuk mendapatkan aerasi yang

aktif harus dilakukan pengocokan menggunakan alat rotary shaker.

Sedangkan pada metode statis ini tidak dilakukan pengocokan terhadap

substrat sehingga aerasi yang didapatkan kurang optimal apabila dibanding

dengan fermentasi menggunakan metode shaker (Gandjar, Sjamsuridzal, &

Oetari, 2006).

Hasil fermentasi kemudian dipisahkan antara biomasa dan medianya

dengan menggunakan kertas saring. Proses ekstraksi dari hasil fermentasi

ini terbagi dua, yang pertama adalah ekstraksi biomassa dengan

menggunakan pelarut metanol dengan metode maserasi. Pada proses

ekstraksi ini, Biomasa dihaluskan menggunakan lumpang dan alu dan

kemudian direndam dengan menggunakan pelarut pada suhu ruang, selama

37


beberapa hari, dan bebas dari cahaya matahari. Penggunaan metanol sebagai

pelarut karena metanol merupakan pelarut universal yang dapat melarutkan

baik senyawa polar maupun non polar serta mampu menarik metabolit

sekunder lebih banyak (Astarina, Astuti, & Warditiani, 2013). Hasil

maserasi kemudian di evaporasi untuk mendapatkan fraksi metanol.

Proses ekstraksi yang kedua adalah ekstraksi media cair yang sudah

dipisahkan dari biomasa dengan metode partisi bertingkat cair-cair. Metode

ini akan menarik dan memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat pada

media sesuai dengan tingkat kepolaran senyawa tersebut. Tujuan

dilakukannya partisi bertingkat ini adalah untuk mendapatkan variasi

senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda (Hikmah, 2012). Pelarut

yang digunakan adalah pelarut n-heksan sebagai pelarut non polar, dan etil

asetat sebagai pelarut semi polar. Hasil partisi kemudian juga dievaporasi

untuk mendapatkan fraksi n-heksan dan etil asetat. Sedangkan untuk media

Isolat Berat Warna Bau Konsistensi

DSM 1B

DSM 2B

DSM 3B

DSS 3A

DSS 3B

239 mg

861 mg

422 mg

590 mg

422 mg

Coklat pekat

Coklat keputihan

Coklat

Coklat pekat

Coklat pekat

Berbau khas

Manis

Manis

Manis

Manis

Kental

Kental

Kental

Kental

Kental


DSM 1B

DSM 2B

DSM 3B

DSS 3A

DSS 3B

10 mg

27 mg

7 mg

16 mg

16 mg

Hitam

Hijau bening

Hijau pekat

Hijau kecoklatan

Hijau

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Kental

Kental

Kental

Kental

Kental


DSM 1B

DSM 2B

DSM 3B

DSS 3A

DSS 3B

16 mg

87 mg

6 mg

11 mg

17 mg

Coklat pekat

Coklat

Coklat

Coklat

Coklat

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Tidak berbau

Kental

Kental

Kental

Kental

Kental

Tabel 4.2 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi metanol

Tabel 4.3 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi n-heksan

Tabel 4.4 Berat dan organoleptis ekstrak fraksi etil asetat

38


cair yang masih tersisa, digunakan untuk uji fraksi air. Hasil yang didapat

menunjukan bahwa ekstrak metanol memiliki bobot paling besar dari

ekstrak lainnya.

4.6 Hasil Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri dilakukan secara mikroskopis. Metode yang

digunakan adalah metode pewarnaan Gram. Metode ini akan membedakan

mana yang merupakan bakteri Gram positif dan bakteri yang merupakan

Gram negatif. Pewarnaan gram ini akan memperlihatan apabila bakteri

merupakan bakteri Gram negatif akan ditandai dengan adanya warna merah,

sedangkan apabila bakteri tersebut merupakan bakteri Gram positif akan

ditandai dengan adanya warna ungu. Perbedaan warna antara bakteri gram

negatif dan positif ini disebabkan karena adanya perbedaan struktur antara

dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif. Dinding sel bakteri gram

positif mengandung peptidoglikan yang lebih banyak apabila dibandingkan

dengan bakteri gram negatif, yang menyebabkan kristal violet yang masuk

tidak dapat terekstraksi keluar dengan menggunakan alkohol karena pori-

porinya mengecil karena terkena alkohol dan menyebabkan sel bakteri

terlihat berwarna ungu. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif

mengandung peptidoglikan yang lebih sedikit dibandingkan bakteri gram

positif sehingga walaupun sudah terkena alkohol, pori-porinya tetap besar

dan menyebabkan kristal violet terekstraksi keluar dan sel bakteri akan

tampak transparan dengan warna merah muda (Pelczar & Chan, 1986).

Adapun hasil dari identifikasi terhadap bakteri uji yang digunakan

dapat dilihat pada tabel berikut:

39


Tabel 4.5 Hasil uji kemurnian bakteri secara mikroskopik

Bakteri Uji Gambar Mikroskopik

Escherichia

coli

Bakteri Gram negatif

Berwarna merah

Sel berbentuk batang

Pseudomonas

aeroginosa

Bakteri gram negatif

Berwarna merah

Sel berbentuk batang

Staphylococcus

aureus

Merupakan bakteri

Gram positif

Berwarna ungu

Sel berbentuk kokus

dan berkelompok

seperti buah anggur.

4.7 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram,

yaitu dengan cara menyerapkan ekstrak uji dengan konsentrasi 1000 µg/mL

kedalam blank disk yang berdiameter sebesar 6 mm sebanyak 20 µL dengan

menggunakan mikropipet. Ekstrak yang digunakan adalah empat fraksi

yang didapatkan dari ekstraksi hasil fermentasi, yaitu fraksi metanol, fraksi

n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air. Hasil dari uji aktivitas antibakteri

dapat dilihat dalam tabel berikut:

40


Tabel 4.6 Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji

Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara duplo untuk setiap isolat.

Untuk pengukuran diameter zona hambat dilakukan dengan menghitung

diameter rata-rata dari hasil yang didapatkan. Uji antibakteri dilakukan

dengan memisahkan antara fraksi metanol dan fraksi air. Fraksi air dipartisi

secara bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat, hal

ini bertujuan untuk mengetahui apakah eksudat yang dilepaskan kapang

endofit yang masuk kedalam fraksi air juga memiliki aktivitas atau tidak.

Dari kelima isolat yang diujikan hanya isolat DSM 1B dan DSM 2B saja

yang menunjukan adanya aktivitas antibakteri terhadap ketiga bakteri uji.

Isolat Fraksi Uji Rata-rata diameter zona hambat (mm)

Escherechia coli Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus.

aureus

DSM 1B Metanol - - -

N-Heksan - - -

Etil Asetat 8,1 mm 7,1 mm -

Air - 12,2 mm -

DSM 2B Metanol - - -

N-Heksan - - -

Etil Asetat - - -

Air 12,5 mm - 14,1 mm

DSM 3A Metanol - - -

N-Heksan - - -

Etil Asetat - - -

Air - - -

DSS 3A Metanol - - -

N-Heksan - - -

Etil Asetat - - -

Air - - -

DSS 3B

Metanol - - -

N-Heksan - - -

Etil Asetat - - -

Air - - -

Kloramfenikol (+) 25,2 mm 15,3 mm 25,1 mm

Kontrol Metanol (-) - - -

Kontrol N-Heksan(-) - - -

Kontrol Etil Asetat(-) - - -

41


Sedangkan isolat DSM 3A, DSS 3A dan DSS 3B tidak menunjukan adanya

aktivitas antibakteri terhadap bakteri yang dujikan baik itu pada fraksi

metanol, n-heksan, etil asetat dan air.

DSM 1B

Fraksi etil asetat fraksi air DSM 1B menunjukan adanya aktivitas

antibakteri. Fraksi etil asetat menunjukan aktivitas terhadap bakteri

uji Escherichia coli sebesar 8,1 mm dan pada bakteri uji

Pseudomonas aeuruginosa sebesar 7,1 mm. Fraksi air menunjukan

aktivitas terhadap bakteri uji Pseudomonas aeuruginosa sebesar

12,2 mm.

DSM 2B

Fraksi air Isolat DSM 2B menunjukan adanya aktivitas terhadap dua

bakteri uji. Pada bakteri uji Escherichia coli terdapat aktivitas

sebesar 12,5 mm, sedangkan pada bakteri uji Staphylococcus aureus

terdapat aktivitas sebesar 14,1 mm.

DSM 3A

Isolat DSM 3A tidak menunjukan aktivitas apapun terhadap bakteri

uji. Baik itu pada fraksi metanol, n-heksan, etil asetat dan air.

DSS 3A

Isolat DSS 3A tidak menunjukan aktivitas apapun terhadap bakteri


DSS 3B

Isolat DSS 3B tidak menunjukan aktivitas apapun terhadap bakteri


Dari hasil uji yang didapatkan, sebagian besar fraksi yang

didapatkan menunjukan tidak adanya aktivitas antibakteri terhadap bakteri

uji yang diujikan. Hal ini dapat dipengaruhi berbagai macam faktor. Faktor

pertama adalah fraksi tersebut kemungkinan memang memiliki aktivitas

antibakteri, akan tetapi tidak terhadap ketiga bakteri yang telah diujikan,

sehingga perlu dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri yang lain.

Faktor kedua, konsentrasi ekstrak pada larutan uji terlalu kecil sehingga

42


tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Faktor ketiga,

kemampuan larutan uji untuk berifusi dengan media agar kurang baik

sehingga ekstrak tidak dapat terdifusi dengan baik kedalam media agar dan

menyebabkan tidak munculnya zona hambat (Dafale, Semwal, Rajput, &

Singh, 2016).

Kontrol positif yang digunakan pada uji aktitivitas antibakteri ini

adalah disk kloramfenikol dengan konsentrasi 30 µg. Kloramfenikol

merupakan antibiotik yang memiliki spektrum luas sehingga dapat

menghambat atau membunuh baik itu bakteri gram negatif maupun postif.

Kloramfenikol mempunya mekanisme kerja dengan cara menghibisi

sintesis protein pada bakteri dengan berikatan pada subunit ribosom 50S.

Karena proses sintesis bakterinya yang terhambat itulah yang menyebabkan

kematian pada bakteri (Nugrahani dan Ningsih, 2014).

Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut dari masing-masing

ekstrak. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa pelarut dari ekstrak

yang diujikan tidak mempengaruhu aktivitas antibakteri dari ekstrak

tersebut.

Pada DSM 1B menunjukan bahwa fraksi etil asetat memiliki

aktivitas terhadap bakteri uji Escherichia coli, Pseudomonas aeuruginosa

dan Staphylococcus aureus. Etil asetat merupakan pelarut semi polar yang

dapat melarutkan senyawa dengan tingkat kepolaran sedang. Sehingga

kemungkinan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri

uji yang terdapat pada fraksi etil asetat pada isolat ini merupakan senyawa

semipolar (Firdayani, Agustini, & Ma’ruf, 2015).

Fraksi air isolat DSM 1B menunjukan aktivitas terhadap bakteri uji

Pseudomonas aeuruginosa dan DSM 2B menunjukan aktivitas terhadap

bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Kemungkinan ini

terjadi karena senyawa antibakteri pada isolat ini bersifat polar dan tidak

dapat ditarik oleh pelarut nonpolar (n-heksan) dan semipolar (etil asetat)

karena senyawa polar hanya bisa larut dengan pelarut polar seperti air

(Marcelinda & Ridhay, 2016). Pelarut etil asetat seharusnya juga dapat

menarik sedikit senyawa yang bersifat polar, akan tetapi pada fraksi etil

43


asetat DSM 2B tidak didapatkan aktivitas pada bakteri uji sehingga

kemungkinan senyawanya memiliki kepolaran yang lebih tinggi sehingga

tidak dapat ditarik oleh pelarut etil asetat (Firdayani et al., 2015).

Hasil uji aktivitas ini juga menunjukan bahwa fraksi yang berasal

dari daun muda (DSM) memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi, hal ini

kemungkinan disebabkan karena adanya perbedaan kandungan kimia antara

daun muda, daun setengah tua, dan daun tua yang mempengaruhi aktivitas

kapang endofit yang terdapat pada daun tersebut (Setiawati et al., 2016)

Hasil uji yang didapat menunjukan bahwa fraksi air DSM 2B

memiliki aktivitas antibakteri paling besar terhadap ketiga bakteri uji yang

diujikan dengan memiliki aktivitas sebesar 12 mm terhadap bakteri uji

Escherichia coli dan sebesar 14,1 mm terhadap bakteri uji Staphylococcus

aureus. Dari hasil uji yang didapatkan juga dapat dilihat bahwa kapang

endofit yang diperoleh dari daun salam memiliki aktivitas antibakteri

terhadap setiap bakteri uji. Hal ini sesuai dengan teori yang menyebutkan

bahwa mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang sama

dengan inang maupun senyawa yang tidak sama tapi memiliki aktivitas yang

mirip dengan senyawa yang bioaktif yang diproduksi inangnya (Sinaga et

al., 2009). Hal ini didukung dengan adanya penelitian mengenai aktivitas

antibakteri daun salam terhadap ketiga bakteri uji yang diujikan yang

menunjukan bahwa daun salam memang memiliki aktivitas antibakteri

(Murhadi et al., 2007).

44


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Telah berhasil diisolasi 5 isolat kapang endofit dari daun salam [Syzygium

polyanthum (Wight) Walp.]. yaitu isolat DSM 1B, DSM 2B, DSM 3A, DSS

3A, dan DSS 3B.

Isolat kapang endofit yang dihasilkan oleh daun pucuk (DSM) menunjukan

aktivitas antibakteri yang lebih kuat dibandingkan daun muda (DSS) dan

daun tua (DST).

Telah berhasil didapatkan ekstrak kapang endofit daun salam yang

mengandung senyawa dengan aktivitas antibakteri yang ditunjukan oleh

ketiga fraksi berikut:

Fraksi etil asetat DSM 1B memiliki aktivitas terhadap bakteri uji

Escherichia coli dengan diameter zona hambat sebesar 8,1 mm dan

terhadap Pseudomonas aeuruginosa dengan zona hambat sebesar 7,1

mm.

Fraksi air DSM 1B memiliki aktivitas terhadap bakteri uji

Pseudomonas aeuruginosa dengan zona hambat sebesar 12,2 mm.

Fraksi air DSM 2B memiliki aktivitas terhadap bakteri uji Escherichia

coli dengan zona hambat sebesar 12,5 mm dan Staphylococcus aureus

dengan zona hambat sebesar 14,1 mm.

5.2 Saran

Melakukan identifikasi terhadap spesies kapang yang memiliki

aktivitas antibakteri.

Melakukan proses fermentasi dengan metode yang berbeda, yaitu

metode shaker.

Melakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri yang berbeda.

Melakukan penapisan fitokimia terhadap fraksi yang terbukti memiliki

aktivitas antibakteri.

45


DAFTAR PUSTAKA

Alvin, A., Miller, K. I., & Neilan, B. A. (2014). Exploring the potential of

endophytes from medicinal plants as sources of antimycobacterial compounds.

Microbiological Research, 169(7–8), 483–495.

Ariyono, R. Q., Djauhari, S., & Sulistyowati, L. (2014). KEANEKARAGAMAN

JAMUR ENDOFIT AKAR KANGKUNG DARAT ( Ipomoea reptans Poir.)

PADA LAHAN PERTANIAN ORGANIK DAN KONVENSIONAL. Jurnal

Hama Dan Penyakit Tanaman, 2(1), 1–10.

Atika, D. (2007). Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang Endofit yang

Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa Lauterb dan

Garcinia latriflora Blume serta Akar dan Daun Tanaman Garcinia cowa

Roxb. Universitas Indonesia: Depok.

BPOM. (2008). Taksonomi Koleksi Tanaman Obat Kebun Tanaman Obat

Citeureup. Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. Deputi

Bidang Pengawasan Obat Tradisional, Kosmetik, dan Produk Komplemen.

Direktorat Obat Asli Indonesia.

Brooks, G. F., Carroll, K. C., Butel, J., Morse, S. A., & Mietzner, T. (2013). Medical

Microbiology. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology.

Choma, I. M., & Grzelak, E. M. (2011). Bioautography detection in thin-layer

chromatography. Journal of Chromatography A, 1218(19), 2684–2691.

Dafale, N. A., Semwal, U. P., Rajput, R. K., & Singh, G. N. (2016). Selection of

appropriate analytical tools to determine the potency and bioactivity of

antibiotics and antibiotic resistance. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(4),

Dalimartha, S. (2000). Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Trubus Agriwdya, anggota

Ikapi. PT. Pustaka Pembangunan Swadaya Nusantara.

Firdayani, F., Agustini, T. W., & Ma’ruf, W. F. (2015). Ekstraksi senyawa bioaktif

sebagai antioksidan alami Spirulina platensis segar dengan pelarut yang

berbeda. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 18(1), 28–37.

46


Gandjar, I., Sjamsuridzal, W., & Oetari, A. (2006). Mikologi dasar dan terapan.

Jakarta: Yayasan Obor Indonesia Anggota IKAPI DKI Jakarta.

Handayani, P. N. (2015). ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIMIKROBA KAPANG ENDOFIT DARI DAUN TANAMAN JAMBLANG

(Syzygium cumini L.) TERHADAP Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus subtilis Staphylococcus aureus, Candida albicans, dan

Aspergillus niger. Universitas islam Negri Syarif Hidayatullah: Jakarta.

Hikmah, F. dinul. (2012). Pengaruh partisi bertingkat cair-cair ekstrak etanol

rimpang jahe (Zingiber officinale Rosc.) terhadap profil kandungan senyawa

kimia dan aktivitas antiradikalnya. Pengaruh Partisi Bertingkat Cair-Cair

Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (Zingiber Officinale Rosc.) Terhadap Profil

Kandungan Senyawa Kimia Dan Aktivitas Antiradikalnya, 1–17.

Kumala, S. (2014). Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi. PT ISFI.

Kumala, S., & Pratiwi, A. A. (2014). Efek Antimikroba dari Kapang Endofi t

Ranting Tanaman Biduri, 7(2), 111–120.

Lim, J. Y., Yoon, J., & Hovde, C. J. (2010). A brief overview of Escherichia coli

O157:H7 and its plasmid O157. Journal of Microbiology and Biotechnology,

20(1), 5–14.

Marcelinda, A., & Ridhay, A. (2016). Aktivitas Antioksidan Ekstrak Limbah Kulit

Ari Biji Kopi ( Coffea sp ) Berdasarkan Tingkat Kepolaran Pelarut The

Atioxidant Activity Of Husk Coffea ( Coffea sp ) Extract Base On Various

Levels Of Polar Solvent, 5(1), 21–30.

Maryanti, A. (2015). Isolasi dan Karakterisasi Kapang Endofit dari Ranting

Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Reinw. Ex Blume) dan Uji Aktivitasnya

sebagai Antibakteri. Universitas islam Negri Syarif Hidayatullah: Jakarta.

Munim, A., Ramadhan, M. G., & Soemiati, A. (2013). Screening of Endophytic

Fungi From Cassia Siamea Lamk Leaves As Α-Glucosidase Inhibitor.

International Research Journal of Pharmacy, 4(5), 128–131.

47


Murhadi, Suharyono, A., & Susilawati. (2007). Aktivitas antibakteri ekstrak daun

salam (Syzygium polyanta) dan daun pandan (Pandanus amaryllifolius).

Teknologi Dan Industri Pangan.

Nuratmi, B., Winarno, M. W., & Sundari, S. (1999). Khasiat Daun Salam (Eugenia

polyantha Wight) sebagai Antidiare pada Tikus Putih.

Pelczar, M. J., & Chan, E. C. . (1986). Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta:

Penerbit Universitas Indonesia (UI-press).

Pelczar, M. J., & Chan, E. C. . (1988). Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Jakarta:

Penerbit Universitas Indonesia (UI-press).

Phongpaichit, S., Rungjindamai, N., Rukachaisirikul, V., & Sakayaroj, J. (2006).

Antimicrobial activity in cultures of endophytic fungi isolated from Garcinia

species. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 48(3), 367–372.

Pokhrel, C. P., & Ohga, S. (2007). Submerged culture conditions for mycelial yield

and polysaccharides production by Lyophyllum decastes. Food Chemistry,

105(2), 641–646.

Prihatiningtias, W., Widyastuti, S. M., & Wahyuono, S. (2005). Senyawa bioaktif

Fungi Endofit Akar kuning (Fibraurea chloroleuca Miers) sebagai senyawa

antimikroba. Tesis. Sekolah Pascasarjana UGM, 1–15.

Rachmayani, R. (2008). Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dan

Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia mangostana.

Universitas Indonesia: Depok.

Radji, M. (2005). Peranan Bioteknologi Dan Mikroba Endofit Dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian ISSN : 1693-9883,

II(3), 113–126.

Rahmadani, F. (2015). Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak etanol 96% Kulit

Batang Kayu Jawa (Lannea coromandelica) terhadap Bakteri Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa.

Universitas islam Negri Syarif Hidayatullah: Jakarta.

48


Rahmi, A., Dan, H., Asterina, I., Biologi, J., Sains, F., Uin, D. T., … Bandung, D.

(2013). Isolasi Dan Identifikasi Kapang Endofit Dari Tanaman Obat Surian

(Toona Sinensis). Edisi Agustus, VII(2), 175–191.

Ramadhan, M. G. (2011). Skrining dan uji aktivitas penghambatan α-flukosidase

dari kapang endofit daun johar ( Cassia siamea Lamk.). Universitas

Indonesia: Depok.

Rutala, W. A., & Weber, D. J. (2004). Disinfection and Sterilization in Health Care

Facilities: What Clinicians Need to Know. Clinical Infectious Diseases, 39(5),

702–709.

Setiawati, T., Saragih, I. A., Nurzaman, M., & Mutaqin, A. Z. (2016). Analisis

Kadar Klorofil dan Luas Daun Lampeni ( Ardisia humilis Thunberg ) pada

Tingkat Perkembangan yang Berbeda di Cagar Alam Pangandaran, 27–28.

Sinaga, E., Noverita, & Fitria, D. (2009). DAYA ANTIBAKTERI JAMUR

ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI DAUN DAN RIMPANG LENGKUAS

(Alpinia galanga Sw.). Jurnal Farmasi Indonesia, 4(4), 161–170.

Strobel G, D. B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their natural

product. Microbiology and Molecular Biology Review, 67(4), 491–402.

Sudirga, S. K. (2012). Pemanfaatan Tumbuhan sebagai Obat Tradisional di Desa

Trunyan Kecamatan Kintamani kabupaten Bangli. E Jurnal Bumi Lestari,

4(2), 7–18.

Tan, R. X., & Zou, W. X. (2001). Endophytes: a rich source of functional

metabolites. Natural Product Reports, 18(1993), 448–459.

Ventola, C. L. (2015). The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P

& T : A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management (2015), 40(4),

277–83.

Wahyudi, A. (2003). Adln – perpustakaan universitas airlangga. Universitas

Airlangga, Surabaya, (September), 1–21.

49


LAMPIRAN 1

Bagan Tahapan Penelitian

UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA

FERMENTASI DAN EKSTRAKSI

PEMURNIAN DAN PEREMAJAAN ISOLAT

ISOLASI KAPANG ENDOFIT

STERILISASI PERMUKAAN

SAMPEL TANAMAN

50


LAMPIRAN 2

Tahapan Isolasi Kapang Endofit

Sampel Tanaman

Cuci bersih dengan air mengalir selama sepuluh menit

Sterilisasi Permukaan

Daun dikeringkan dan dipotong dengan ukuran 1x1 cm

Tanam pada medium PDA, inkubasi selama 14 hari pada suhu ruang

Alkohol 70%

1 menit

NaOCl 5,25%

5 menit

Alkohol 70%

30 detik

1Akuades Steril

5 detik

51


Kapang endofit

yang tumbuh pada

medium isolasi

Selama pemurnian

kapang diinkubasi

selama 14 hari

pada suhu ruang

(25°c)

Working culture

dan stock culture di

inkubasi 25°c

selama 7 hari dan

kemudian

disimpan pada

suhu 4°c

Sedikit hifa kapang

dipindahkan

Sedikit hifa kapang

dipindahkan

LAMPIRAN 3

Tahapan Pemurnian

52


LAMPIRAN 4

Pengamatan Morfologi Kapang

kapang yang

sudah tumbuh Sedikit hifa kapang

ditanamam pada

medium PDA yang

terletak pada kaca

objek

Kaca objek dimasukan

kedalam petri steril

yang berisi sedikit air

dan dinkubasi selama 7

hari

Seterlah di inkubasi,

ditetesi dengan

alkohol 96%

Tetesi dengan

larutan metilen blue Preparat kemudian

diamati dengan

mikroskop

53


LAMPIRAN 5

Proses Fermentasi

Kapang yang

telah

dimurnikan

selama 7 hari

Kapang diinokulasi kedalam medium PDY

dan di inkubasi pada suhu ruang selama

21 hari.

Dipindahkan dengan menggunakan sedotan steril

sebanyak 3 bulatan ke masing-masing

54


LAMPIRAN 6

Ekstraksi Hasil Fermentasi

Media

Biomasa dihaluskan

dan diekstrak

dengan metanol

Maserat

Di evaporasi

Ekstrak kental

Uji aktivitas antibakteri

fraksi metanol

Media di ekstraksi dengan cara

partisi menggunakan corong

pisah

Di partisi menggunakan

N-heksan

Di partisi menggunakan

Etil Asetat

Fraksi N-heksan yang

didapat dievaporasi

Fraksi Etil Asetat yang

didapat dievaporasi

Ekstrak kental

Ekstrak kental

Uji aktivitas antibakteri fraksi

etil asetat

Uji aktivitas antibakteri fraksi

N-heksan

Media digunakan

digunakan sebagai uji

aktivitas antibakteri

fraksi air

Media dipisahkan

dari biomasa

dengan kertas

saring

55


LAMPIRAN 7

Identifikasi Bakteri Uji

Kaca objek

dibersihkan

dengan alkohol

70%

Kemudian

dilewatkan

diatas api

Lalu ditetesi

dengan NaCl

steril 0,9%

Letakan 1 ose

bakteri

Di fiksasi Kemudian

diteteskan karbol

kristal ungu 0,5%

Kemudian

diteteskan cairan

lugol

Lalu dicuci dengan

alkohol 96%

Kemudian

diteteskan

safranin Kemudian

diteteskan dengan

minyak immersi,

lalu amati dengan

menggunakan

mikroskop

Dibilas

dengan air

56


LAMPIRAN 8

Pembuatan Inokulum Bakteri

Biakan Bakteri

Pindahkan 1ml

Samakan kekeruhan

dengan larutan

McFarland 3.0

Pindahkan

dengan ose

10 ml NaCl 0,9 %

109

Larutan McFarland

3.0

10 ml NaCl 0,9 %

108

10 ml NaCl 0,9 %

107

10 ml NaCl 0,9 %

106

Pindahkan

1ml

Pindahkan

1ml

57


LAMPIRAN 9

Uji Aktivitas Antibakteri

Tambahkan media agar MHA

sebanyak 10 mL

Cawan digoyang perlahan agar

suspensi tersebar merata

Suspensi bakteri 106

Ambil

sebanyak 1 ml

20 µl larutan uji dengan

konsentrasi 1000 ppm

diserapkan pada kertas

cakram steril. Kontrol

positif yang digunakan

adalah cakram

kloramfenikol

a

b c

d

e

g

h

f

Lalu di inkubasikan

selama 18-24 jam

pada suhu 35 °c

58


LAMPIRAN 10

Tanaman Sampel

Pohon Salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.]

Daun Salam [Syzygium polyanthum (Wight) Walp.]

59


LAMPIRAN 11

Surat Hasil Determinasi Sampel

60


Fermentasi DSM 3A

Fermentasi DSS 3B

Fermentasi DSS 3A

Fermentasi DSM 2B Fermentasi DSM 1B

LAMPIRAN 12

Hasil Fermentasi

61


LAMPIRAN 13

Ekstrak Kental Hasil Evaporasi

Fraksi metanol

DSM 1B DSM 2B DSM 3A DSS 3A DSS 3B

Fraksi n-heksan


Fraksi etil asetat


62


LAMPIRAN 14

Fraksi Air


63


LAMPIRAN 15

Hasil Uji Aktivitas Antibakteri menggunakan Bakteri Uji Escherichia coli

DSM 1B DSM 2B

DSM 3A DSS 3A

DSS 3B Fraksi air

64


LAMPIRAN 16

Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri Uji Pseudomonas aeruginosa

DSM 1B DSM 2B

DSM 3A DSS 3A

DSS 3B Fraksi air

65


LAMPIRAN 17

Hasil uji menggunakan bakteri uji Staphylococcus aureus

DSM 1B DSM 2B

DSM 3A DSS 3A

DSS 3B Fraksi air

uin syarif hidayatullah jakarta isolasi...

Documents