Laporan Biokimia

INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE

Nama : Ansori Muchtar

NIM : 10510071

Kelompok : 05

Tanggal Praktikum : 04 April 2013

Tanggal Laporan : 11 April 2013

Asisten: Raden Prima Hari Febrian

Laboratorium Biokimia

Program Studi Kimia

Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Bandung

2013

INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE

I. Tujuan

Menentukan aktivitas beta oksdase dari E. Coli menggunakan teknik

spektrofotometri.

II. Teori Dasar

Pengendalian metabolisme pada dasarnya adalah pengendalian

aktivitas atau sintesis enzim-enzim kunci pada jalur metabolisme. Salah

satu contoh klasik pengendalian sintesis enzim adalah lac operon. Operon

adalah beberapa gen struktur yang diekspresikan oleh satu promoter yang

sama. Operon dibagi menjadi beberapa macam, salah satunya adalah lac-

operon. Lac-operon adalah operon yang dibutuhkan pada metabolisme

laktosa pada bakteri E.Coli.

Pada percobaan ini, kultur E.coli ditumbuhkan dulu dalam media

(NB) yang berisi berbagai gula yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut

dijadikan sumber energi bakteri selama inkubasi semalaman. Sebagai

substrat, tidak digunakan laktosa, melainkan ONPG (orthonitrophenyl-β-

D- galaktosides), suatu senyawa β-galaktosida. Setelah ONPG dipotong

oleh enzim β-galaktosidase, akan dihasilkan ONP (orthonitrophenol) yang

berwarna kuning (λmaks = 420 nm). Dengan demikian, penentuan efek

induksi gula pada sintesis β-galaktosidase dapat ditentukan dengan

metode spektrofotometri.

III. Data Pengamatan

Adsorban t inkubasi (min) 0 10 20 30 40 OD

Medium 1 0.062 0.16

4

0.084 0.175 0.04

8

0.691

Medium 2 0.073 0.23

5

0.096 0.104 0.02

3

0.562

Medium 3 0.077 0.08

6

0.068 0.062 0.09

6

0.597

V =1.060 mL

Media 1: NB

Media 2: NB+laktosa

Media 3: NB+laktosa+glukosa

IV. Pengolahan Data

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

0.10.20.3

kurva waktu terhadap ad-sorban

medium 1medium 2medium 3

waktu (menit)

adso

rban

Aktivitas enz ℑ=A420

t inkubasi ×V kultur ×OD600

untuk t = 10 menit maka,

Aktivitas enzim= 0.164

10 menit ×1.060 ×10−3 L ×0.691=22.3909 menit−1 L−1

sehingga aktivitas enzim dari medium dan waktu inkubasi lain adalah

sebagai berikut:

Mediu

m

t inkubasi 0 10 menit 20 menit 30 menit 40 menit

1 0 22.3903 5.734102 7.96403 1.638315

2 0 39.44806 8.057477 5.819289 0.965219

3 0 13.58996 5.372776 3.265805 3.792548

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

10

20

30

kurva aktivitas enzim terhadap waktu

medium 1medium 2medium 3

waktu (menit)

akti

vita

s en

zim

V. Pembahasan

Pada percobaan ini dilakukan pengukuran aktivitas beta

galaktosidase dengan metoda spektrofotometri. Enzim β-galaktosidase

adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis β-galaktosida seperti

laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Enzim β-galaktosidase bekerja

dengan cara memotong ikatan β-glikosidik antara galaktosa dan suatu

komponen organik lain. Penamaan enzim β-galaktosidase ditentukan juga

oleh substrat yang akan dihidrolisis. Jika substrat yang dihidrolisis adalah

laktosa menjadi galaktosa dan glukosa enzim β-galaktosidase tersebut

adalah laktase.

β-galaktosidase merupakan suatu enzim induktif yaitu enzim yang

tidak selalu diproduksi namun perlu ada suatu senyawa penginduksi

(hormon ataupun substrat). Substrat penginduksi β-galaktosidase tidak

lain adalah laktosa. Enzim merupakan suatu protein yang diproduksi oleh

gen melalui regulasi tertentu. Suatu unit terkoordinasi yang terlibat dalam

ekspresi gen disebut dengan operon. Salah satu operon yang dikenal

adalah lac operon (lactose operon).

Lac operon terdiri dari 2 bagian besar, yaitu gen regulator dan gen struktural.

Tiga gen struktural pada lac operon:

lacZ: mengkode β-galaktosidase

lacY: mengkode β-galaktosidase permease, protein transpor yang terikat pada

membran dan memompa laktosa ke dalam sel

lacA: mengkode β-galaktosidase transasetilase, enzim yang mentransfer

gugus asetil dari asetil-CoA kepada β-galaktosidase

Pada katabolisme laktosa hanyaanya lacZ dan lacY yang diperlukan.

Pada penentuan aktivitas dari beta galaktosa dilakukan dengan substrat

pengganti yaitu ONPG. Hal ini dilakukan karena laktosa yang dihasilkan

tidak berwarna dalam artian tidak menyerap pada sinar tampak sehingga

tidak dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Oleh karena

itu digunakan ONPG yang dapat dihidrolisa dengan enzim yang sama

menghasilkan larutan berwarna ONP, sehingga pengukuran dapat

dilakukan pada panjang gelombang 420 nm. Reaksi ONPG dengan beta

galaktosidase adalah sebagai berikut:

Enzim yang digunakan di isolasi dari bakteri Escherecia Coli. Dinding dari

bakteri dilisis menggunakan SDS dan alkohol teknis sehingga enzim dapat

keluar melalui dinding sel. Kerja dari enzim sangat optimum pada suhu

tubuh akan tetapi kondisi lingkungan pada praktikum tidak sesuai dengan

suhu tubuh sehingga dilakukan modifikasi lingkungan dengan cara

penambahan buffer Z dan diinkubasi pada suhu 37 derajat celcius. Selain

itu faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah pH. Enzim tertentu

memiliki pH optimum tertentu pula perubahn pH yang sangat drastis dapat

mempengaruhi kerja enzim. Pada percobaan ini kerja enzim dihentikan

dengan penambahan natrium karbonat sehingga pH berubah drastis

menjadi sangat basa. Selain itu untuk menghentikan kerja enzim juga

media dimasukkan ke penangas es sehingga suhu menjadi turun mendekati

nol dan kinetika reaksi enzim menjadi berkurang.

Adanya tambahan glukosa mengubah regulasi lac operon menjadi

suatu mekanisme regulasi yang dikenal dengan catabolite repression.

Dalam kata lain, kehadiran glukosa menghambat ekspresi gen struktural

yang dibutuhkan dalam metabolisme laktosa. Regulasi ini dimediasi oleh

cAMP sebagai protein koaktivator dan aktivator CAP dan CRP sebagai

reseptor. Glukosa dalam jumlah kecil meningkatkan jumlah cAMP yang

terikat pada CRP sehingga meningkatkan ekspresi dari lac operon yang

berujung pada ekspresi gen struktural dengan adanya laktosa. Sebaliknya

glukosa dalam jumlah besar menghambat produksi dari cAMP sehingga

tidak ada yang terikat pada CRP akibatnya ekspresi lac operon pun

terhambat yang juga akan menghambat pembentukan β-galaktosidase.

Alasan inilah yang mengakibatkan hasil dari praktikum aktivitas enzim

pada medium NB + Laktosa> NB saja> NB + Glukosa + Laktosa.

VI. Kesimpulan

Urutan besar aktifitas enzim β-galaktosidase E.coli dari paling besar

berturut-turut adalah yang ditumbuhkan pada medium NB + Laktosa, NB

saja, NB + Glukosa + Laktosa.

VII. Daftar Pustaka

Nelson, L. D., Cox, M. M., 2004, Lehninger Principles of

Biochemistry, 4th ed, W. H. Freeman, hal 1081-1088

Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. “Biochemistry”, 6 th ed.

2006. W. H. Freeman and Company. (page 892-901)